THAM KHẢO DANH SÁCH TRÌNH TỰ
Đơn hiện tại đang được nộp cùng với Danh sách trình tự ở định dạng XML điện tử. Tệp Danh sách trình tự có tên 51165-009006_Sequence_Listing 2_16_23, được tạo vào ngày 16 tháng 2 năm 2023 và có kích thước 77.070.454 byte. Thông tin ở định dạng điện tử của Danh sách trình tự được đưa vào đây bằng cách tham chiếu toàn bộ.
LĨNH VỰC SÁNG CHẾ
Sáng chế đề cập đến chế phẩm, phương pháp, quy trình, bộ dụng cụ và thiết bị dùng để thiết kế, điều chế, sản xuất và/hoặc công thức hóa các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp và phân tử mARN biến đổi (mmRNA).
NỀN TẢNG CỦA SÁNG CHẾ
Có nhiều vấn đề với các phương pháp biểu hiện protein trước đây. Ví dụ, ADN được đưa vào có thể tích hợp vào ADN bộ gen của tế bào chủ ở một tần số nào đó, dẫn đến những thay đổi và/hoặc gây tổn hại cho ADN bộ gen của tế bào chủ. Ngoài ra, axit deoxyribonucleic (DNA) dị loại được đưa vào tế bào có thể được di truyền bởi các tế bào con (dù DNA dị loại có tích hợp vào nhiễm sắc thể hay không) hoặc bởi thế hệ con.
Ngoài ra, giả sử việc phân phối thích hợp và không gây hư hại hay tích hợp vào bộ gen chủ, thì phải thực hiện nhiều bước trước khi tạo ra protein mã hóa. Khi đã vào trong tế bào, DNA phải được vận chuyển vào nhân nơi nó được phiên mã thành RNA. RNA được phiên mã từ DNA sau đó phải đi vào tế bào chất nơi nó được dịch thành protein. Nhiều bước xử lý từ DNA được quản lý đến protein không chỉ tạo ra thời gian trễ trước khi tạo ra protein chức năng, mà mỗi bước còn có khả năng gây ra lỗi và gây tổn hại cho tế bào. Hơn nữa, người ta biết rằng rất khó để đạt được biểu hiện DNA trong tế bào vì DNA thường xuyên xâm nhập vào tế bào nhưng không được biểu hiện hoặc không được biểu hiện ở tỷ lệ hoặc nồng độ hợp lý. Đây có thể là một vấn đề đặc biệt khi DNA được đưa vào các tế bào sơ cấp hoặc các dòng tế bào đã được sửa đổi.
Vào đầu những năm 1990, Bloom và các đồng nghiệp đã giải cứu thành công những con chuột bị thiếu vasopressin bằng cách tiêm mRNA vasopressin được phiên mã in vitro vào vùng dưới đồi (Science 255: 996-998; 1992). Tuy nhiên, mức độ dịch mã thấp và khả năng miễn dịch của các phân tử đã cản trở sự phát triển của mRNA như một phương pháp điều trị và các nỗ lực đã tập trung vào các ứng dụng thay thế có thể khai thác những cạm bẫy này, tức là tiêm chủng bằng mRNA mã hóa các kháng nguyên ung thư.
Những người khác đã nghiên cứu việc sử dụng mARN để cung cấp polypeptide quan tâm và chỉ ra rằng một số biến đổi hóa học nhất định của phân tử mARN, đặc biệt là pseudouridine và 5-methyl-cytosine, đã làm giảm tác dụng kích thích miễn dịch.
Những nghiên cứu này được bộc lộ trong, ví dụ, Ribostem Limited ở Vương quốc Anh, số sê-ri đơn xin cấp bằng sáng chế 0316089.2 nộp vào ngày 9 tháng 7 năm 2003 hiện đã bị hủy bỏ, số đơn đăng ký PCT PCT/GB2004/002981 nộp vào ngày 9 tháng 7 năm 2004 được công bố là WO2005005622, bằng sáng chế của Hoa Kỳ ứng dụng nhập cảnh quốc gia Ser. Số 10/563.897 nộp vào ngày 8 tháng 6 năm 2006 được công bố là US20060247195 hiện đã bị hủy bỏ và số sê-ri đơn đăng ký bằng sáng chế quốc gia của Châu Âu EP2004743322 nộp vào ngày 9 tháng 7 năm 2004 được xuất bản là EP1646714 hiện đã bị rút lại; Novozymes, Inc. trong đơn đăng ký PCT số PCT/US2007/88060 nộp ngày 19 tháng 12 năm 2007 được xuất bản với tên WO2008140615, đơn đăng ký bằng sáng chế quốc gia của Hoa Kỳ Ser. Số 12/520.072 nộp ngày 2 tháng 7 năm 2009 được công bố dưới dạng US20100028943 và đơn xin cấp bằng sáng chế Châu Âu giai đoạn quốc gia Ser. Số EP2007874376 nộp ngày 7 tháng 7 năm 2009 được xuất bản dưới dạng EP2104739; Đại học Rochester trong đơn đăng ký PCT số PCT/US2006/46120 nộp ngày 4 tháng 12 năm 2006 được công bố là WO2007064952 và đơn đăng ký bằng sáng chế của Hoa Kỳ Ser. Số 11/606.995 nộp ngày 1 tháng 12 năm 2006 được công bố là US20070141030; BioNTech AG có số sê-ri đơn xin cấp bằng sáng chế ở Châu Âu EP2007024312 nộp ngày 14 tháng 12 năm 2007 hiện đã bị hủy bỏ, số đơn đăng ký PCT là PCT/EP2008/01059 nộp vào ngày 12 tháng 12 năm 2008 được công bố là WO2009077134, số sê-ri đầu vào giai đoạn quốc gia của đơn xin cấp bằng sáng chế ở Châu Âu là EP2008861423 được nộp vào ngày 12 tháng 6 năm 2008. 2, 2010 được xuất bản với tên EP2240572, đơn xin cấp bằng sáng chế quốc gia của Hoa Kỳ Ser. Số 12/,735,060 nộp ngày 24 tháng 11 năm 2010 được công bố là US20110065103, số sê-ri đơn xin cấp bằng sáng chế của Đức DE 10 2005 046 490 nộp ngày 28 tháng 9 năm 2005, đơn PCT PCT/EP2006/0448 nộp ngày 28 tháng 9 năm 2006 được công bố là WO2007036366, Giai đoạn quốc gia Bằng sáng chế Châu Âu EP1934345 được công bố vào ngày 21 tháng 3 năm 2012 và giai đoạn quốc gia Đơn xin cấp bằng sáng chế Hoa Kỳ Ser. Số 11/992.638 nộp ngày 14 tháng 8 năm 2009 công bố là 20100129877; Viện bệnh miễn dịch Inc. trong đơn xin cấp bằng sáng chế của Hoa Kỳ Ser. Số 13/088.009 nộp ngày 15 tháng 4 năm 2011 được công bố là US20120046346 và đơn PCT PCT/US2011/32679 nộp ngày 15 tháng 4 năm 2011 được công bố là WO20110130624; Shire Human Genetic Therapeutics trong đơn xin cấp bằng sáng chế của Hoa Kỳ Ser. Số 12/957.340 nộp ngày 20 tháng 11 năm 2010 được công bố là US20110244026; Sequitur Inc. trong đơn đăng ký PCT PCT/US1998/019492 nộp ngày 18 tháng 9 năm 1998 được xuất bản dưới tên WO1999014346; Viện nghiên cứu Scripps trong đơn đăng ký PCT số PCT/US2010/00567 nộp vào ngày 24 tháng 2 năm 2010 được công bố là WO2010098861, và đơn đăng ký bằng sáng chế của Hoa Kỳ trong giai đoạn quốc gia Ser. Số 13/203.229 nộp ngày 3 tháng 11 năm 2011 được công bố là US20120053333; Đại học Ludwig-Maximillians trong đơn đăng ký PCT số PCT/EP2010/004681 nộp vào ngày 30 tháng 7 năm 2010 được công bố là WO2011012316; Cellscript Inc. ở Mỹ Pat. Số 8.039.214 nộp ngày 30 tháng 6 năm 2008 và được cấp ngày 18 tháng 10 năm 2011, đơn xin cấp bằng sáng chế Hoa Kỳ Ser. Số 12/962.498 nộp ngày 7 tháng 12 năm 2010 công bố dưới dạng US20110143436, 12/962.468 nộp ngày 7 tháng 12 năm 2010 công bố dưới dạng US20110143397, 13/237.451 công bố ngày 20 tháng 9 năm 2011 công bố dưới dạng US20120009649 và đơn PCT /US2010 /59305 nộp ngày 7 tháng 12 năm 2010 được xuất bản dưới dạng WO2011071931 và PCT/US2010/59317 nộp vào ngày 7 tháng 12 năm 2010 được xuất bản dưới dạng WO2011071936; Các Ủy viên của Đại học Pennsylvania trong đơn đăng ký PCT số PCT/US2006/32372 nộp vào ngày 21 tháng 8 năm 2006 được công bố là WO2007024708, và đơn đăng ký bằng sáng chế Hoa Kỳ giai đoạn quốc gia Ser. Số 11/990.646 nộp ngày 27 tháng 3 năm 2009 được công bố là US20090286852; Curevac GMBH ở các số sê-ri đơn xin cấp bằng sáng chế của Đức DE10 2001 027 283.9 nộp ngày 5 tháng 6 năm 2001, DE10 2001 062 480.8 nộp ngày 19 tháng 12 năm 2001 và DE 20 2006 051 516 nộp ngày 31 tháng 10 năm 2006 tất cả đều bị hủy bỏ, số bằng sáng chế Châu Âu EP1392341 được cấp Ngày 30 tháng 3 năm 2005 và EP1458410 được cấp ngày 2 tháng 1 năm 2008, số đơn PCT PCT/EP2002/06180 nộp ngày 5 tháng 6 năm 2002 được công bố là WO2002098443, PCT/EP2002/14577 được công bố vào ngày 19 tháng 12 năm 2002 được công bố là WO2003051401, PCT/ EP2007/09469 nộp ngày 31 tháng 12 năm 2007 được xuất bản dưới tên WO2008052770, PCT/EP2008/03033 nộp ngày 16 tháng 4 năm 2008 được xuất bản dưới tên WO2009127230, PCT/EP2006/004784 nộp ngày 19 tháng 5 năm 2005 được xuất bản dưới tên WO2006122828, PCT/EP2008/00081 nộp vào ngày 9 tháng 1 năm 2007 được công bố là WO2008083949 và đơn xin cấp bằng sáng chế của Hoa Kỳ Ser. Số 10/729.830 nộp ngày 5 tháng 12 năm 2003 được công bố là US20050032730, ngày 10/870.110 nộp ngày 18 tháng 6 năm 2004 được công bố là US20050059624, 11/914.945 được công bố vào ngày 7 tháng 7 năm 2008 được công bố là US20080267873, 12/44 6.912 nộp vào tháng 10 . 27, 2009 được xuất bản dưới dạng US2010047261 hiện đã bị hủy, 12/522.214 được xuất bản vào ngày 4 tháng 1 năm 2010 được xuất bản dưới dạng US20100189729, 12/787.566 được xuất bản vào ngày 26 tháng 5 năm 2010 được xuất bản dưới dạng US20110077287, 12/787.755 được xuất bản vào ngày 26 tháng 5 năm 2010. 2010 được xuất bản dưới dạng US20100239608, 13/185,119 nộp ngày 18 tháng 7 năm 2011 được xuất bản dưới dạng US20110269950 và Ser. Số 13/106,548 nộp ngày 12 tháng 5 năm 2011 được công bố dưới dạng US20110311472, tất cả đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Mặc dù các báo cáo này chỉ giới hạn ở việc lựa chọn các biến đổi hóa học bao gồm pseudouridine và 5-methyl-cytosine, vẫn cần có các phương thức điều trị trong lĩnh vực kỹ thuật này để giải quyết vô số rào cản xung quanh việc điều biến hiệu quả quá trình dịch mã nội bào và xử lý mã hóa axit nucleic polypeptide hoặc các đoạn của chúng.
Để đạt được mục đích này, các nhà sáng chế đã chỉ ra rằng một số trình tự mARN biến đổi nhất định có tiềm năng trở thành phương pháp điều trị với các lợi ích ngoài việc chỉ trốn tránh, tránh hoặc làm giảm phản ứng miễn dịch. Các nghiên cứu này được trình bày chi tiết trong các đơn đăng ký đồng thời được công bố. Đơn đăng ký quốc tế PCT/US2011/046861 nộp ngày 5 tháng 8 năm 2011 và PCT/US2011/054636 nộp ngày 3 tháng 10 năm 2011, Số đơn quốc tế PCT/US2011/054617 nộp ngày 3 tháng 10 năm 2011 , toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn.
Sáng chế giải quyết nhu cầu này bằng cách cung cấp các hợp chất dựa trên axit nucleic hoặc polynucleotit mã hóa polypeptit được quan tâm (ví dụ, mARN biến đổi hoặc mmARN) và có các đặc điểm cấu trúc và/hoặc hóa học giúp tránh được một hoặc nhiều vấn đề trong lĩnh vực kỹ thuật này, ví dụ: ví dụ, các tính năng hữu ích để tối ưu hóa công thức và phân phối các liệu pháp điều trị dựa trên axit nucleic trong khi vẫn duy trì tính toàn vẹn về cấu trúc và chức năng, vượt qua ngưỡng biểu hiện, cải thiện tốc độ biểu hiện, thời gian bán hủy và/hoặc nồng độ protein, tối ưu hóa việc định vị protein và tránh các tác nhân sinh học có hại. - các phản ứng như phản ứng miễn dịch và/hoặc con đường thoái hóa.
TÓM TẮT SÁNG CHẾ
Được mô tả ở đây là chế phẩm, phương pháp, quy trình, bộ dụng cụ và thiết bị dùng để thiết kế, điều chế, sản xuất và/hoặc công thức hóa các phân tử mARN biến đổi (mmRNA).
Chi tiết về các phương án khác nhau của sáng chế được nêu trong phần mô tả dưới đây. Các đặc điểm, đối tượng và ưu điểm khác của sáng chế sẽ được thể hiện rõ ràng từ bản mô tả, hình vẽ cũng như từ yêu cầu bảo hộ.
Các đối tượng, đặc điểm và ưu điểm nêu trên và các đối tượng, đặc điểm và lợi thế khác sẽ được thể hiện rõ ràng từ phần mô tả sau đây về các phương án cụ thể của sáng chế, như được minh họa trong các hình vẽ kèm theo, trong đó các ký tự tham chiếu giống nhau đề cập đến các bộ phận giống nhau trong các góc nhìn khác nhau. Các hình vẽ không nhất thiết phải theo tỷ lệ, thay vào đó nhấn mạnh vào việc minh họa các nguyên tắc theo các phương án khác nhau của sáng chế.
MIÊU TẢ CỤ THỂ
Điều rất được quan tâm trong các lĩnh vực trị liệu, chẩn đoán, thuốc thử và xét nghiệm sinh học là có thể cung cấp axit nucleic, ví dụ, axit ribonucleic (RNA) bên trong tế bào, dù là in vitro, in vivo, in situ hay ex. vivo, chẳng hạn như gây ra sự dịch mã nội bào của axit nucleic và tạo ra polypeptide được mã hóa quan tâm. Điều đặc biệt quan trọng là việc phân phối và chức năng của polynucleotide không tích hợp.
Được mô tả ở đây là các chế phẩm (bao gồm cả dược phẩm) và các phương pháp thiết kế, bào chế, sản xuất và/hoặc công thức hóa các polynucleotit mã hóa một hoặc nhiều polypeptit cần quan tâm. Sáng chế cũng đề xuất các hệ thống, quy trình, thiết bị và bộ dụng cụ để chọn, thiết kế và/hoặc sử dụng các polynucleotit mã hóa các polypeptit quan tâm được mô tả ở đây.
Theo sáng chế, tốt hơn là các polynucleotit này được biến đổi để tránh sự thiếu sót của các phân tử mã hóa polypeptit khác trong lĩnh vực kỹ thuật này. Do đó, các polynucleotide này được gọi là mRNA hoặc mmRNA biến đổi.
Việc sử dụng các polynucleotide biến đổi trong lĩnh vực kháng thể, vi rút, ứng dụng thú y và nhiều cài đặt in vivo đã được các nhà sáng chế khám phá và các nghiên cứu này được bộc lộ trong ví dụ, đơn xin cấp bằng sáng chế tạm thời của Hoa Kỳ Ser. Số 61/470.451 nộp ngày 31 tháng 3 năm 2011 giảng dạy các ứng dụng mmRNA in vivo; Số 61/517,784 nộp ngày 26 tháng 4 năm 2011 dạy về axit nucleic được xử lý bằng công nghệ để sản xuất các polypeptide kháng thể; 61/519.158 nộp ngày 17/5/2011 giảng dạy ứng dụng công nghệ mmRNA trong thú y; 61/533.537 nộp ngày 12 tháng 9 năm 2011 giảng dạy về ứng dụng kháng khuẩn của công nghệ mmRNA; 61/533.554 nộp ngày 12 tháng 9 năm 2011 giảng dạy các ứng dụng virus của công nghệ mmRNA, 61/542.533 nộp ngày 3 tháng 10 năm 2011 dạy các biến đổi hóa học khác nhau để sử dụng trong công nghệ mmRNA; 61/570.690 nộp ngày 14 tháng 12 năm 2011 dạy các thiết bị di động sử dụng trong việc chế tạo hoặc sử dụng công nghệ mmRNA; 61/570.708 nộp ngày 14 tháng 12 năm 2011 dạy cách sử dụng mmRNA trong các tình huống chăm sóc cấp tính; 61/576.651 nộp ngày 16 tháng 12 năm 2011 giảng dạy kiến trúc sửa đổi thiết bị đầu cuối cho mmRNA; 61/576.705 nộp ngày 16 tháng 12 năm 2011 dạy phương pháp phân phối sử dụng lipidoid cho mmRNA; 61/578.271 nộp ngày 21 tháng 12 năm 2011 giảng dạy các phương pháp tăng cường khả năng sống sót của các cơ quan hoặc mô bằng cách sử dụng mmRNA; 61/581.322 nộp ngày 29 tháng 12 năm 2011 dạy mmRNA mã hóa các peptide thâm nhập tế bào; Số 61/581.352 nộp ngày 29 tháng 12 năm 2011 dạy về việc kết hợp các nucleoside gây độc tế bào trong mmRNA và số 61/631.729 nộp ngày 10 tháng 1 năm 2012 dạy phương pháp sử dụng mmRNA để vượt qua hàng rào máu não; tất cả đều được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ.
Ở đây, một phần, đề cập đến các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc polypeptit mã hóa mmRNA được quan tâm được thiết kế để cải thiện một hoặc nhiều tính ổn định và/hoặc độ thanh thải trong mô, sự hấp thu và/hoặc động học của thụ thể, khả năng tiếp cận tế bào bằng chế phẩm , tham gia vào cơ chế dịch mã, thời gian bán hủy của mRNA, hiệu quả dịch mã, khả năng trốn tránh miễn dịch, khả năng sản xuất protein, hiệu quả bài tiết (khi có thể), khả năng lưu thông, thời gian bán hủy của protein và/hoặc sự điều biến trạng thái, chức năng và/hoặc hoạt động của tế bào .
I. Thành phần của sáng chế (mmRNA)
Sáng chế đề xuất các phân tử axit nucleic, cụ thể là các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA mã hóa một hoặc nhiều polypeptit cần quan tâm. Thuật ngữ “axit nucleic,” theo nghĩa rộng nhất của nó, bao gồm hợp chất và/hoặc chất bất kỳ bao gồm polyme gồm các nucleotit. Những polyme này thường được gọi là polynucleotide. Axit nucleic hoặc polynucleotit ví dụ theo sáng chế bao gồm, nhưng không giới hạn ở, axit ribonucleic (RNA), axit deoxyribonucleic (DNA), axit nucleic threose (TNA), axit nucleic glycol (GNA), axit nucleic peptit (PNA), axit nucleic khóa. axit nucleic (LNA, bao gồm LNA có cấu hình β-D-ribo, α-LNA có cấu hình α-L-ribo (một chất diastereomer của LNA), 2′-amino-LNA có chức năng 2′-amino và 2 ′-amino-α-LNA có chức năng hóa 2′-amino) hoặc dạng lai của chúng.
Theo các phương án được ưu tiên, phân tử axit nucleic là ARN thông tin (mARN). Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “ARN thông tin” (mRNA) được dùng để chỉ polynucleotit bất kỳ mã hóa polypeptit quan tâm và có khả năng được dịch mã để tạo ra polypeptit được mã hóa quan tâm in vitro, in vivo, in situ hoặc ex vivo.
Theo truyền thống, các thành phần cơ bản của phân tử mRNA bao gồm ít nhất một vùng mã hóa, 5′UTR, 3′UTR, nắp 5′ và đuôi poly-A. Dựa trên cấu trúc mô đun kiểu hoang dã này, sáng chế mở rộng phạm vi chức năng của các phân tử mARN truyền thống bằng cách cung cấp các polynucleotide hoặc cấu trúc ARN sơ cấp duy trì tổ chức mô đun nhưng bao gồm một hoặc nhiều cải biến hoặc thay đổi về cấu trúc và/hoặc hóa học mang lại lợi ích các đặc tính của polynucleotit bao gồm, theo một số phương án, không gây cảm ứng đáng kể phản ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào mà polynucleotit được đưa vào. Như vậy, các phân tử mARN biến đổi theo sáng chế được gọi là “mmRNA”. Như được sử dụng ở đây, đặc điểm hoặc biến đổi “cấu trúc” là đặc điểm trong đó hai hoặc nhiều nucleotit liên kết được chèn vào, loại bỏ, nhân đôi, đảo ngược hoặc ngẫu nhiên hóa trong polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA mà không có biến đổi hóa học đáng kể đối với bản thân các nucleotit đó. Bởi vì các liên kết hóa học nhất thiết sẽ bị phá vỡ và được cải tổ để tạo ra sự biến đổi cấu trúc, nên sự biến đổi cấu trúc có bản chất hóa học và do đó là những biến đổi hóa học. Tuy nhiên, việc sửa đổi cấu trúc sẽ dẫn đến một trình tự nucleotide khác nhau. Ví dụ, polynucleotit “ATCG” có thể được biến đổi về mặt hóa học thành “AT-5meC-G”. Polynucleotide tương tự có thể được biến đổi cấu trúc từ “ATCG” thành “ATCCCG”. Ở đây, dinucleotide “CC” đã được chèn vào, dẫn đến sự biến đổi cấu trúc của polynucleotide.
Kiến trúc mmRNA
MmRNA theo sáng chế được phân biệt với mARN kiểu dại ở các đặc điểm thiết kế cấu trúc và/hoặc chức năng của chúng nhằm mục đích, như được chứng minh ở đây, khắc phục các vấn đề hiện tại về sản xuất polypeptit hiệu quả bằng cách sử dụng liệu pháp điều trị dựa trên axit nucleic.
Quay lại
Cầu nối đầu 5' của vùng đầu tiên102và vùng sườn đầu tiên104là khu vực hoạt động đầu tiên105. Theo truyền thống, vùng hoạt động này bao gồm một codon khởi đầu. Vùng vận hành có thể bao gồm trình tự hoặc tín hiệu khởi đầu dịch mã bất kỳ bao gồm codon Bắt đầu.
Cầu nối đầu 3’ của vùng thứ nhất102và vùng sườn thứ hai106là khu vực hoạt động thứ hai107. Theo truyền thống, vùng hoạt động này bao gồm một codon dừng. Vùng vận hành có thể bao gồm bất kỳ trình tự hoặc tín hiệu bắt đầu dịch mã nào bao gồm codon dừng. Theo sáng chế, nhiều codon dừng nối tiếp cũng có thể được sử dụng.
Nói chung, độ dài ngắn nhất của vùng thứ nhất trong cấu trúc sơ cấp theo sáng chế có thể là độ dài của trình tự axit nucleic đủ để mã hóa cho dipeptide, tripeptit, tetrapeptide, pentapeptide, hexapeptide, heptapeptide, octapeptit, nonapeptit hoặc decapeptit. Theo một phương án khác, độ dài có thể đủ để mã hóa peptit gồm 2-30 axit amin, ví dụ 5-30, 10-30, 2-25, 5-25, 10-25 hoặc 10-20 axit amin. Độ dài có thể đủ để mã hóa cho peptit có ít nhất 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25 hoặc 30 axit amin, hoặc peptit không dài hơn 40 axit amin, ví dụ: không quá 35, 30, 25, 20, 17, 15, 14, 13, 12, 11 hoặc 10 axit amin. Ví dụ về dipeptit mà trình tự polynucleotit có thể mã hóa hoặc bao gồm, nhưng không giới hạn ở, carnosin và anserin.
Nói chung, độ dài của vùng thứ nhất mã hóa polypeptit quan tâm theo sáng chế lớn hơn khoảng 30 nucleotit (ví dụ, ít nhất hoặc lớn hơn khoảng 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 00, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500 và 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000 00, 70.000, 80.000, 90.000 hoặc lên đến và bao gồm 100.000 nucleotit). Như được sử dụng ở đây, “vùng thứ nhất” có thể được gọi là “vùng mã hóa” hoặc “mã hóa vùng” hoặc đơn giản là “vùng thứ nhất”.
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm từ khoảng 30 đến khoảng 100.000 nucleotit (ví dụ, từ 30 đến 50, từ 30 đến 100, từ 30 đến 250, từ 30 đến 500, từ 30 đến 1.000, từ 30 đến 1.500, từ 30 đến 3.000, từ 30 đến 5.000, từ 30 đến 7.000, từ 30 đến 10.000, từ 30 đến 25.000, từ 30 đến 50.000, từ 30 đến 70.000, từ 100 đến 250, từ 100 đến 500, từ 100 đến 1.000, từ 100 đến 1.500, từ 100 đến 3.000, từ 100 đến 5.000, từ 100 đến 7.000, từ 100 đến 10.000, từ 100 đến 25.000, từ 100 đến 50.000, từ 100 đến 70.000, từ 100 đến 100.000, từ 500 đến 1.000, từ 500 đến 1.500, từ 500 đến 2.000, từ 500 đến 3.000, từ 500 đến 5.000, từ 500 đến 7.000, từ 500 đến 10.000, từ 500 đến 25.000, từ 500 đến 50.000, từ 500 đến 7 0.000, từ 500 đến 100.000, từ 1.000 đến 1.500, từ 1.000 đến 2.000, từ 1.000 đến 3.000, từ 1.000 đến 5.000, từ 1.000 đến 7.000, từ 1.000 đến 10.000, từ 1.000 đến 25.000, từ 1.00 0 đến 50.000, từ 1.000 đến 70.000, từ 1.000 đến 100.000, từ 1.500 đến 3.000, từ 1.500 đến 5.000, từ 1.500 đến 7.000, từ 1.500 đến 10.000, từ 1.500 đến 25.000, từ 1.500 đến 50.000, từ 1,500 đến 70.000, từ 1, 500 đến 100.000, từ 2.000 đến 3.000, từ 2.000 đến 5.000, từ 2.000 đến 7.000, từ 2.000 đến 10.000, từ 2.000 đến 25.000, từ 2.000 đến 50.000, từ 2.000 đến 70.000 và từ 2.000 đến 100.000).
Theo sáng chế, vùng sườn thứ nhất và thứ hai có thể có độ dài độc lập từ 15 đến 1.000 nucleotit (ví dụ, lớn hơn 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140 , 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 và 900 nucleotit hoặc ít nhất 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100 , 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 và 1.000 nucleotide).
Theo sáng chế, trình tự đuôi có thể có chiều dài từ không có đến 500 nucleotit (ví dụ, ít nhất 60, 70, 80, 90, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450 , hoặc 500 nucleotide). Trong trường hợp vùng đuôi là đuôi polyA, độ dài có thể được xác định theo đơn vị hoặc theo hàm số của liên kết Protein liên kết polyA. Theo phương án này, đuôi polyA đủ dài để liên kết ít nhất 4 monome của Protein liên kết PolyA. Các monome Protein liên kết PolyA liên kết với các đoạn khoảng 38 nucleotide. Như vậy, người ta đã quan sát thấy rằng các đuôi polyA có khoảng 80 nucleotide và 160 nucleotide có chức năng.
Theo sáng chế, vùng gắn nắp có thể bao gồm một nắp đơn hoặc một loạt nucleotit tạo thành nắp. Theo phương án này, vùng giới hạn có thể nằm trong khoảng từ 1 đến 10, ví dụ: Chiều dài 2-9, 3-8, 4-7, 1-5, 5-10 hoặc ít nhất 2, hoặc 10 nucleotide hoặc ít hơn. Theo một số phương án, nắp không có.
Theo sáng chế, vùng hoạt động thứ nhất và thứ hai có thể nằm trong khoảng từ 3 đến 40, ví dụ, 5-30, 10-20, 15, hoặc ít nhất 4, hoặc 30 nucleotit hoặc ít hơn về chiều dài và có thể bao gồm, ngoài một codon Bắt đầu và/hoặc Dừng, một hoặc nhiều chuỗi tín hiệu và/hoặc hạn chế.
mmRNA tuần hoàn
Theo sáng chế, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được tuần hoàn hóa hoặc được liên kết để tạo ra phân tử có khả năng dịch mã nhằm hỗ trợ các tương tác giữa protein liên kết poly-A và protein liên kết đầu 5′. Cơ chế tạo vòng hoặc trùng hợp có thể xảy ra thông qua ít nhất 3 con đường khác nhau: 1) hóa học, 2) enzyme và 3) xúc tác ribozyme. Liên kết 5′-/3′ mới được hình thành có thể là liên kết nội phân tử hoặc liên phân tử.
Trong con đường thứ nhất, đầu 5′ và đầu 3′ của axit nucleic chứa các nhóm phản ứng hóa học mà khi ở gần nhau sẽ tạo thành liên kết cộng hóa trị mới giữa đầu 5′ và đầu 3′ của phân tử. . Đầu 5′ có thể chứa nhóm phản ứng NHS-ester và đầu 3′ có thể chứa nucleotide kết thúc bằng 3′-amino sao cho trong dung môi hữu cơ, nucleotide kết thúc bằng 3′-amino ở đầu 3′ của một phân tử mRNA tổng hợp sẽ trải qua một cuộc tấn công ái nhân vào nửa 5′-NHS-ester để hình thành liên kết 5′-/3′-amit mới.
Trong con đường thứ hai, T4 RNA ligase có thể được sử dụng để liên kết bằng enzym một phân tử axit nucleic 5′-phosphoryl hóa với nhóm 3′-hydroxyl của axit nucleic tạo thành liên kết photphorodiester mới. Trong một phản ứng ví dụ, 1p g phân tử axit nucleic được ủ ở 37° C. trong 1 giờ với 1-10 đơn vị T4 RNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, MA) theo quy trình của nhà sản xuất. Phản ứng nối có thể xảy ra với sự có mặt của một oligonucleotide phân tách có khả năng ghép cặp bazơ với cả vùng 5′ và 3′ ở vị trí kề nhau để hỗ trợ phản ứng nối enzym.
Trong con đường thứ ba, đầu 5′ hoặc 3′ của khuôn mẫu cDNA mã hóa trình tự ribozyme ligase sao cho trong quá trình phiên mã in vitro, phân tử axit nucleic thu được có thể chứa trình tự ribozyme hoạt động có khả năng nối đầu 5′ của phân tử axit nucleic đến đầu 3′ của phân tử axit nucleic. Ribozyme ligase có thể có nguồn gốc từ Intron nhóm I, Intron nhóm I, Virus Viêm gan Delta, ribozyme Hairpin hoặc có thể được chọn bởi SELEX (sự tiến hóa có hệ thống của các phối tử bằng cách làm giàu theo cấp số nhân). Phản ứng ribozyme ligase có thể mất từ 1 đến 24 giờ ở nhiệt độ từ 0 đến 37° C.
Máy đa năng mmRNA
Theo sáng chế, nhiều polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA riêng biệt có thể được liên kết với nhau thông qua đầu 3′ bằng cách sử dụng các nucleotit được biến đổi ở đầu 3′. Liên hợp hóa học có thể được sử dụng để kiểm soát tính năng cân bằng hóa học của việc đưa vào tế bào. Ví dụ, các enzyme chu trình glyoxylate, isocitrate lyase và malate synthase, có thể được cung cấp vào tế bào HepG2 theo tỷ lệ 1:1 để thay đổi quá trình chuyển hóa axit béo của tế bào. Tỷ lệ này có thể được kiểm soát bằng các polynucleotide liên kết hóa học, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bằng cách sử dụng nucleotit có đầu tận cùng 3′-azido trên một polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc các loài mmRNA và nucleotit chứa C5-ethynyl hoặc alkynyl trên polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA đối diện giống loài. Nucleotide biến đổi được thêm vào sau phiên mã bằng cách sử dụng enzyme transferase cuối (New England Biolabs, Ipswich, MA) theo quy trình của nhà sản xuất. Sau khi bổ sung nucleotide được biến đổi 3′, hai loại polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được kết hợp trong dung dịch nước, khi có hoặc không có đồng, để tạo thành liên kết cộng hóa trị mới thông qua cơ chế hóa học click như được mô tả trong văn học.
Trong một ví dụ khác, nhiều hơn hai polynucleotit có thể được liên kết với nhau bằng cách sử dụng phân tử liên kết được chức năng hóa. Ví dụ, một phân tử sacarit được chức năng hóa có thể được biến đổi về mặt hóa học để chứa nhiều nhóm phản ứng hóa học (SH—, NH2-, N3, vân vân. . . . ) để phản ứng với gốc cùng nguồn gốc trên phân tử mRNA có chức năng 3′ (tức là este 3′-maleimide, 3′-NHS-ester, alkynyl). Số lượng nhóm phản ứng trên sacarit biến đổi có thể được kiểm soát theo kiểu cân bằng hóa học để kiểm soát trực tiếp tỷ lệ cân bằng hóa học của polynucleotide liên hợp, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA.
Liên hợp và kết hợp mmRNA
Để tăng cường hơn nữa khả năng sản xuất protein, các cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được thiết kế để liên hợp với các polynucleotit, thuốc nhuộm, chất xen kẽ khác (ví dụ, acridin), chất liên kết ngang (ví dụ psoralene, mitomycin C), porphyrin (TPPC4, texaphyrin, Sapphyrin), hydrocacbon thơm đa vòng (ví dụ: phenazine, dihydrophenazine), các endnuclease nhân tạo (ví dụ: EDTA), tác nhân alkyl hóa, phosphat, amino, mercapto, PEG (ví dụ: PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, polyamino, alkyl, alkyl được thế, chất đánh dấu phóng xạ, enzyme, haptens (ví dụ biotin), chất hỗ trợ vận chuyển/hấp thu (ví dụ: aspirin, vitamin E, axit folic), ribonuclease tổng hợp, protein, ví dụ: glycoprotein hoặc peptide, ví dụ: phân tử có ái lực cụ thể với phối tử đồng thời hoặc kháng thể, ví dụ: kháng thể, liên kết với một loại tế bào xác định chẳng hạn như tế bào ung thư, tế bào nội mô hoặc tế bào xương, hormone và thụ thể hormone, các loài không phải peptide, chẳng hạn như lipid , lectins, carbohydrate, vitamin, cofactors, hoặc một loại thuốc.
Sự liên hợp có thể làm tăng độ ổn định và/hoặc thời gian bán hủy và có thể đặc biệt hữu ích trong việc nhắm mục tiêu các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA đến các vị trí cụ thể trong tế bào, mô hoặc sinh vật.
Theo sáng chế, mmRNA hoặc cấu trúc bậc một có thể được sử dụng cùng với hoặc mã hóa thêm một hoặc nhiều tác nhân RNAi, siRNA, shRNA, miRNA, vị trí liên kết miRNA, RNA antisense, ribozyme, DNA xúc tác, tRNA, RNA tạo ra bộ ba sự hình thành chuỗi xoắn, aptamer hoặc vectơ, và tương tự.
mmRNA nhị chức năng
Theo một phương án của sáng chế là các polynucleotit hai chức năng (ví dụ, cấu trúc bậc một hai chức năng hoặc mmRNA hai chức năng). Đúng như tên gọi, polynucleotide nhị chức là những polynucleotide có hoặc có khả năng thực hiện ít nhất hai chức năng. Theo quy ước, những phân tử này cũng có thể được gọi là đa chức năng.
Nhiều chức năng của polynucleotide nhị chức có thể được mã hóa bởi RNA (chức năng này có thể không biểu hiện cho đến khi sản phẩm được mã hóa được dịch) hoặc có thể là một đặc tính của chính polynucleotide. Nó có thể là cấu trúc hoặc hóa học. Các polynucleotit biến đổi hai chức năng có thể bao gồm chức năng liên kết cộng hóa trị hoặc tĩnh điện với các polynucleotit này. Hơn nữa, hai chức năng này có thể được cung cấp trong trường hợp phức hợp của mmARN và phân tử khác.
Các polynucleotide nhị chức có thể mã hóa các peptide có tác dụng chống tăng sinh. Các peptide này có thể là cuộn tuyến tính, tuần hoàn, bị ràng buộc hoặc ngẫu nhiên. Chúng có thể hoạt động như các aptamer, phân tử tín hiệu, phối tử hoặc chất bắt chước hoặc mô phỏng của chúng. Các peptit chống tăng sinh có thể được dịch ra có chiều dài từ 3 đến 50 axit amin. Chúng có thể dài 5-40, 10-30 hoặc khoảng 15 axit amin. Chúng có thể là chuỗi đơn, đa chuỗi hoặc phân nhánh và có thể tạo thành các phức hợp, tập hợp hoặc bất kỳ cấu trúc đa đơn vị nào sau khi được dịch.
Polynucleotide không mã hóa và cấu trúc sơ cấp
Như được mô tả ở đây, sáng chế đề xuất các polynucleotit và cấu trúc bậc một có các trình tự về cơ bản hoặc một phần không thể dịch được, ví dụ, có vùng không mã hóa. Vùng không mã hóa như vậy có thể là “vùng đầu tiên” của cấu trúc chính. Ngoài ra, vùng không mã hóa có thể là vùng khác với vùng thứ nhất. Các phân tử như vậy thường không được dịch mã nhưng có thể tác động lên quá trình sản xuất protein bằng cách liên kết và cô lập một hoặc nhiều thành phần máy dịch mã như protein ribosome hoặc RNA vận chuyển (tRNA), do đó làm giảm hiệu quả sự biểu hiện protein trong tế bào. tế bào hoặc điều chỉnh một hoặc nhiều con đường hoặc các tầng trong tế bào từ đó làm thay đổi mức protein. Cấu trúc polynucleotide hoặc sơ cấp có thể chứa hoặc mã hóa một hoặc nhiều ARN không mã hóa dài (lncRNA, hoặc lincRNA) hoặc một phần của chúng, ARN nucleol nhỏ (sno-RNA), micro RNA (miRNA), ARN can thiệp nhỏ (siRNA) hoặc Piwi- RNA tương tác (piRNA).
Polypeptide quan tâm
Theo sáng chế, cấu trúc bậc một được thiết kế để mã hóa một hoặc nhiều polypeptit quan tâm hoặc các đoạn của chúng. Polypeptit được quan tâm có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, các polypeptit nguyên, nhiều polypeptit hoặc các đoạn polypeptit, mà có thể được mã hóa độc lập bởi một hoặc nhiều axit nucleic, nhiều axit nucleic, các đoạn axit nucleic hoặc các biến thể của bất kỳ điều nào đã nói ở trên. Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “polypeptit được quan tâm” dùng để chỉ polypeptit bất kỳ được chọn để mã hóa trong cấu trúc bậc một theo sáng chế. Như được sử dụng ở đây, “polypeptit” có nghĩa là polyme gồm các gốc axit amin (tự nhiên hoặc không tự nhiên) được liên kết với nhau thường xuyên nhất bằng liên kết peptit. Thuật ngữ này, như được sử dụng ở đây, dùng để chỉ protein, polypeptit và peptit ở bất kỳ kích thước, cấu trúc hoặc chức năng nào. Trong một số trường hợp, polypeptide được mã hóa nhỏ hơn khoảng 50 axit amin và khi đó polypeptide được gọi là peptit. Nếu polypeptide là một peptide thì chiều dài của nó ít nhất là khoảng 2, 3, 4 hoặc ít nhất 5 axit amin. Do đó, polypeptit bao gồm các sản phẩm gen, polypeptit xuất hiện trong tự nhiên, polypeptit tổng hợp, chất tương đồng, chất chỉnh hình, parolog, đoạn và các dạng tương đương, biến thể, và chất tương tự khác của các loại trên. Polypeptit có thể là một phân tử đơn lẻ hoặc có thể là phức hợp đa phân tử như dime, triper hoặc tetramer. Chúng cũng có thể bao gồm các polypeptit chuỗi đơn hoặc đa chuỗi như kháng thể hoặc insulin và có thể được liên kết hoặc liên kết. Các liên kết disulfide phổ biến nhất được tìm thấy trong các polypeptide đa chuỗi. Thuật ngữ polypeptit cũng có thể áp dụng cho các polyme axit amin trong đó một hoặc nhiều gốc axit amin là chất tương tự hóa học nhân tạo của axit amin tự nhiên tương ứng.
Thuật ngữ “biến thể polypeptit” được dùng để chỉ các phân tử có trình tự axit amin khác với trình tự gốc hoặc trình tự tham chiếu. Các biến thể trình tự axit amin có thể có các thay thế, loại bỏ, và/hoặc thêm vào ở các vị trí nhất định trong trình tự axit amin, so với trình tự gốc hoặc trình tự tham chiếu. Thông thường, các biến thể sẽ có ít nhất khoảng 50% sự giống nhau (tương đồng) với trình tự gốc hoặc trình tự tham chiếu, và tốt hơn nữa, chúng sẽ có ít nhất khoảng 80%, tốt hơn nữa là giống ít nhất khoảng 90% (tương đồng) với trình tự gốc hoặc trình tự tham chiếu .
Theo một số phương án, “các dạng bắt chước biến thể” được đề xuất. Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “bắt chước biến thể” là thuật ngữ chứa một hoặc nhiều axit amin mà sẽ bắt chước trình tự được kích hoạt. Ví dụ, glutamate có thể đóng vai trò là chất bắt chước của photphoro-threonin và/hoặc photphoro-serin. Ngoài ra, các chất bắt chước biến thể có thể dẫn đến việc mất hoạt tính hoặc tạo ra sản phẩm bị bất hoạt có chứa chất bắt chước, ví dụ, phenylalanin có thể hoạt động như chất thay thế làm bất hoạt tyrosin; hoặc alanine có thể hoạt động như một chất thay thế bất hoạt cho serine.
“Tính tương đồng” khi áp dụng cho trình tự axit amin được định nghĩa là tỷ lệ phần trăm của các gốc trong trình tự axit amin dự tuyển giống với các gốc trong trình tự axit amin của trình tự thứ hai sau khi sắp thẳng hàng các trình tự và đưa vào các khoảng trống, nếu cần, để đạt được phần trăm tương đồng tối đa. Các phương pháp và chương trình máy tính để căn chỉnh đã được biết rõ trong lĩnh vực kỹ thuật này. Điều này được hiểu rằng sự tương đồng phụ thuộc vào phép tính phần trăm đồng nhất nhưng có thể khác nhau về giá trị do các khoảng trống và hình phạt được đưa ra trong phép tính.
“Các trình tự tương đồng” khi áp dụng cho các trình tự polypeptide có nghĩa là trình tự tương ứng của các loài khác có đặc tính gần giống với trình tự thứ hai của loài thứ hai.
“Chất tương tự” có nghĩa là bao gồm các biến thể polypeptit khác nhau bởi một hoặc nhiều thay đổi axit amin, ví dụ, thay thế, bổ sung hoặc loại bỏ các gốc axit amin mà vẫn duy trì một hoặc nhiều đặc tính của polypeptit gốc hoặc polypeptit ban đầu.
Sáng chế đề xuất một số loại chế phẩm dựa trên polypeptit bao gồm các dạng biến thể và dẫn xuất. Chúng bao gồm các biến thể và dẫn xuất thay thế, chèn, xóa và cộng hóa trị. Thuật ngữ “dẫn xuất” được sử dụng đồng nghĩa với thuật ngữ “biến thể” nhưng thường được dùng để chỉ phân tử đã được biến đổi và/hoặc thay đổi theo cách bất kỳ so với phân tử tham chiếu hoặc phân tử ban đầu.
Như vậy, các polypeptit mã hóa mmRNA chứa các dạng thay thế, thêm và/hoặc thêm, loại bỏ và biến đổi cộng hóa trị đối với các trình tự tham chiếu, đặc biệt là các trình tự polypeptit bộc lộ ở đây, đều nằm trong phạm vi của sáng chế. Ví dụ, thẻ trình tự hoặc axit amin, chẳng hạn như một hoặc nhiều lysin, có thể được thêm vào trình tự peptit theo sáng chế (ví dụ, ở đầu N hoặc đầu C). Thẻ trình tự có thể được sử dụng để tinh chế hoặc định vị peptit. Lysine có thể được sử dụng để tăng khả năng hòa tan peptide hoặc cho phép quá trình biotin hóa. Ngoài ra, các gốc axit amin nằm ở vùng đầu carboxy và amino của trình tự axit amin của peptit hoặc protein có thể tùy ý được loại bỏ để tạo ra các trình tự cắt ngắn. Một số axit amin nhất định (ví dụ, gốc C hoặc đầu N) có thể bị loại bỏ tùy thuộc vào cách sử dụng trình tự, ví dụ, biểu hiện trình tự này như một phần của trình tự lớn hơn có thể hòa tan hoặc liên kết với chất rắn. ủng hộ.
“Các biến thể thay thế” khi đề cập đến polypeptit là các biến thể có ít nhất một gốc axit amin trong trình tự gốc hoặc trình tự bắt đầu bị loại bỏ và một axit amin khác được lắp vào vị trí của nó ở cùng một vị trí. Các thay thế có thể là đơn lẻ, trong đó chỉ một axit amin trong phân tử được thay thế, hoặc chúng có thể là nhiều axit amin, trong đó hai hoặc nhiều axit amin được thay thế trong cùng một phân tử.
Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “sự thay thế axit amin bảo toàn” được dùng để chỉ sự thay thế axit amin thường có trong trình tự bằng axit amin khác có kích thước, điện tích hoặc độ phân cực tương tự. Ví dụ về sự thế bảo toàn bao gồm sự thế của gốc không phân cực (kỵ nước) như isoleuxin, valine và leuxin bằng một gốc không phân cực khác. Tương tự như vậy, ví dụ về sự thế bảo toàn bao gồm sự thế của một gốc phân cực (ưa nước) bằng một gốc khác như giữa arginin và lysine, giữa glutamine và asparagine, và giữa glycin và serin. Ngoài ra, việc thay thế gốc bazơ như lysine, arginine hoặc histidin bằng một gốc khác, hoặc thay thế một gốc axit như axit aspartic hoặc axit glutamic bằng một gốc axit khác là các ví dụ bổ sung về sự thế bảo toàn. Ví dụ về sự thay thế không bảo toàn bao gồm việc thay thế gốc axit amin không phân cực (kỵ nước) như isoleucine, valine, leucine, alanine, methionine bằng gốc axit amin phân cực (ưa nước) như cystein, glutamine, axit glutamic hoặc lysine và/ hoặc dư lượng phân cực đối với dư lượng không phân cực.
“Các biến thể chèn” khi đề cập đến polypeptit là các biến thể có một hoặc nhiều axit amin được chèn ngay liền kề với axit amin ở vị trí cụ thể trong trình tự gốc hoặc trình tự bắt đầu. “Gần liền” với axit amin có nghĩa là được kết nối với nhóm chức alpha-carboxy hoặc alpha-amino của axit amin.
“Các biến thể bị mất” khi đề cập đến polypeptit là các biến thể có một hoặc nhiều axit amin trong trình tự axit amin ban đầu hoặc gốc bị loại bỏ. Thông thường, các biến thể bị mất sẽ có một hoặc nhiều axit amin bị mất ở vùng cụ thể của phân tử.
“Dẫn xuất cộng hóa trị” khi đề cập đến các polypeptit bao gồm các biến đổi protein tự nhiên hoặc protein ban đầu bằng tác nhân tạo dẫn xuất hữu cơ có protein hoặc không có protein, và/hoặc các biến đổi sau dịch mã. Theo truyền thống, các biến đổi cộng hóa trị được giới thiệu bằng cách cho các gốc axit amin nhắm mục tiêu của protein phản ứng với chất tạo dẫn xuất hữu cơ có khả năng phản ứng với các chuỗi bên hoặc các gốc cuối được chọn, hoặc bằng cách khai thác các cơ chế biến đổi sau dịch mã hoạt động trong các tế bào chủ tái tổ hợp đã chọn. Các dẫn xuất cộng hóa trị thu được rất hữu ích trong các chương trình nhằm xác định các gốc quan trọng cho hoạt tính sinh học, cho các thử nghiệm miễn dịch, hoặc để điều chế các kháng thể kháng protein để tinh chế ái lực miễn dịch của glycoprotein tái tổ hợp. Những sửa đổi như vậy nằm trong khả năng thông thường trong lĩnh vực kỹ thuật này và được thực hiện mà không cần thử nghiệm quá mức.
Một số biến đổi hậu dịch mã nhất định là kết quả của hoạt động của tế bào chủ tái tổ hợp trên polypeptit được biểu hiện. Dư lượng glutaminyl và asparaginyl thường được khử amit sau dịch mã thành dư lượng glutamyl và aspartyl tương ứng. Ngoài ra, các chất cặn này được khử amit trong điều kiện axit nhẹ. Một trong hai dạng của các gốc này có thể có trong polypeptit được sản xuất theo sáng chế.
Các biến đổi hậu dịch mã khác bao gồm hydroxyl hóa proline và lysine, phosphoryl hóa các nhóm hydroxyl của gốc seryl hoặc threonyl, methyl hóa các nhóm alpha-amino của chuỗi bên lysine, arginine và histidine (T. E. Creighton, Protein: Cấu trúc và tính chất phân tử, W.H. Freeman & Co., San Francisco, trang 79-86 (1983)).
“Các đặc điểm” khi đề cập đến polypeptit được định nghĩa là các thành phần dựa trên trình tự axit amin riêng biệt của một phân tử. Các đặc điểm của polypeptit được mã hóa bởi mmRNA theo sáng chế bao gồm các biểu hiện bề mặt, hình dạng cấu hình cục bộ, nếp gấp, vòng, nửa vòng, vùng, nửa vùng, vị trí, đầu cuối hoặc bất kỳ sự kết hợp nào của chúng.
Như được sử dụng ở đây khi đề cập đến các polypeptit, thuật ngữ “biểu hiện bề mặt” được dùng để chỉ thành phần dựa trên polypeptit của protein xuất hiện trên bề mặt ngoài cùng.
Như được sử dụng ở đây khi đề cập đến polypeptit, thuật ngữ “hình dạng cấu hình cục bộ” có nghĩa là biểu hiện cấu trúc dựa trên polypeptit của protein nằm trong vùng có thể xác định được của protein.
Như được sử dụng ở đây khi đề cập đến các polypeptit, thuật ngữ “gấp” để chỉ cấu dạng thu được của trình tự axit amin dựa trên việc giảm thiểu năng lượng. Một nếp gấp có thể xảy ra ở cấp độ thứ hai hoặc cấp ba của quá trình gấp. Ví dụ về các nếp gấp cấp độ thứ cấp bao gồm các tấm beta và các vòng xoắn alpha. Ví dụ về nếp gấp bậc ba bao gồm các miền và vùng được hình thành do sự tập hợp hoặc phân tách các lực năng lượng. Các vùng được hình thành theo cách này bao gồm các túi kỵ nước và ưa nước, và những vùng tương tự.
Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “chuyển” vì nó liên quan đến cấu trúc protein có nghĩa là sự uốn cong làm thay đổi hướng của khung của peptit hoặc polypeptit và có thể bao gồm một, hai, ba hoặc nhiều gốc axit amin.
Như được sử dụng ở đây khi đề cập đến polypeptit, thuật ngữ “vòng” được dùng để chỉ đặc điểm cấu trúc của polypeptit mà có thể dùng để đảo ngược hướng của khung chính của peptit hoặc polypeptit. Trong trường hợp vòng lặp được tìm thấy trong polypeptit và chỉ làm thay đổi hướng của mạch chính, nó có thể bao gồm bốn gốc axit amin trở lên. Oliva và cộng sự. đã xác định được ít nhất 5 loại vòng protein (J. Mol Biol 266 (4): 814-830; 1997). Vòng lặp có thể mở hoặc đóng. Vòng khép kín hoặc vòng “vòng” có thể bao gồm 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 hoặc nhiều axit amin giữa các gốc cầu nối. Các gốc cầu nối như vậy có thể bao gồm cầu nối cystein-cystein (Cys-Cys) điển hình trong các polypeptit có cầu nối disulfua hoặc các gốc cầu nối khác có thể không dựa trên protein như tác nhân dibromozylyl được sử dụng ở đây.
Như được sử dụng ở đây khi đề cập đến các polypeptit, thuật ngữ “nửa vòng” được dùng để chỉ một phần của vòng được xác định có ít nhất một nửa số axit amin nằm trong vòng mà nó được tạo ra. Điều này được hiểu rằng các vòng không phải lúc nào cũng chứa số lượng gốc axit amin chẵn. Do đó, trong trường hợp vòng chứa hoặc được xác định là chứa số lẻ axit amin, nửa vòng của vòng số lẻ sẽ bao gồm phần số nguyên hoặc phần số nguyên tiếp theo của vòng (số lượng axit amin của vòng/2+/−0,5 axit amin). Ví dụ: một vòng được xác định là vòng 7 axit amin có thể tạo ra các nửa vòng gồm 3 axit amin hoặc 4 axit amin (7/2=3,5+/−0,5 là 3 hoặc 4).
Như được sử dụng ở đây khi đề cập đến polypeptit, thuật ngữ “vùng chức năng” dùng để chỉ mô típ của polypeptit có một hoặc nhiều đặc điểm hoặc đặc tính cấu trúc hoặc chức năng có thể nhận dạng được (ví dụ, khả năng liên kết, đóng vai trò như một vị trí cho các tương tác protein-protein).
Như được sử dụng ở đây khi đề cập đến các polypeptit, thuật ngữ “nửa vùng chức năng” có nghĩa là một phần của vùng chức năng được xác định có ít nhất một nửa số lượng axit amin nằm trong vùng chức năng mà nó được tạo ra. Điều này được hiểu rằng các vùng chức năng không phải lúc nào cũng có thể chứa số lượng gốc axit amin chẵn. Do đó, trong trường hợp vùng chức năng chứa hoặc được xác định là chứa số lẻ axit amin, nửa vùng chức năng của vùng số lẻ sẽ bao gồm phần số nguyên hoặc phần số nguyên tiếp theo của vùng chức năng (số lượng axit amin của miền/2+/−0,5 axit amin). Ví dụ: một miền được xác định là miền 7 axit amin có thể tạo ra nửa miền gồm 3 axit amin hoặc 4 axit amin (7/2=3,5+/−0,5 là 3 hoặc 4). Người ta cũng hiểu rằng các tên miền phụ có thể được xác định trong các tên miền hoặc nửa tên miền, những tên miền phụ này sở hữu ít hơn tất cả các thuộc tính cấu trúc hoặc chức năng được xác định trong các tên miền hoặc nửa tên miền mà chúng bắt nguồn từ đó. Cũng được hiểu rằng các axit amin bao gồm kiểu vùng bất kỳ trong số các kiểu vùng ở đây không cần phải tiếp giáp dọc theo khung của polypeptit (tức là, các axit amin không liền kề có thể gấp nếp về mặt cấu trúc để tạo ra vùng, nửa vùng hoặc vùng phụ).
Như được sử dụng ở đây khi đề cập đến các polypeptit, thuật ngữ “vị trí” khi nó liên quan đến các phương án dựa trên axit amin được sử dụng đồng nghĩa với “dư lượng axit amin” và “chuỗi bên axit amin”. Vị trí thể hiện một vị trí trong peptit hoặc polypeptit mà có thể được biến đổi, thao tác, thay đổi, tạo dẫn xuất hoặc biến đổi trong các phân tử dựa trên polypeptit theo sáng chế.
Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “đầu cuối” hoặc “đầu cuối” khi đề cập đến polypeptit được dùng để chỉ đầu cuối của peptit hoặc polypeptit. Điểm cực này không chỉ giới hạn ở vị trí đầu tiên hoặc vị trí cuối cùng của peptit hoặc polypeptit mà còn có thể bao gồm các axit amin bổ sung ở vùng cuối. Các phân tử dựa trên polypeptit theo sáng chế có thể được đặc trưng là có cả đầu N (chấm dứt bởi axit amin với nhóm amino tự do (NH2)) và đầu C (chấm dứt bởi axit amin với nhóm carboxyl tự do ( COOH)). Protein theo sáng chế trong một số trường hợp được tạo thành từ nhiều chuỗi polypeptide được liên kết với nhau bằng liên kết disulfua hoặc bằng lực không cộng hóa trị (đa phân tử, oligome). Những loại protein này sẽ có nhiều đầu N và C. Ngoài ra, đầu cuối của polypeptit có thể được biến đổi sao cho chúng bắt đầu hoặc kết thúc, tùy từng trường hợp, với gốc không dựa trên polypeptit như liên hợp hữu cơ.
Khi bất kỳ đặc điểm nào đã được xác định hoặc xác định là thành phần mong muốn của polypeptit để được mã hóa bởi cấu trúc chính hoặc mmRNA theo sáng chế, thì bất kỳ thao tác và/hoặc sửa đổi nào của các đặc điểm này có thể được thực hiện bằng cách di chuyển, hoán đổi, đảo ngược. , xóa, ngẫu nhiên hoặc sao chép. Hơn nữa, cần hiểu rằng việc thao tác các đặc điểm có thể dẫn đến kết quả tương tự như sự biến đổi các phân tử theo sáng chế. Ví dụ, một thao tác liên quan đến việc xóa một vùng sẽ dẫn đến sự thay đổi độ dài của phân tử giống như việc sửa đổi axit nucleic để mã hóa ngắn hơn độ dài của một phân tử đầy đủ.
Các cải biến và thao tác có thể được thực hiện bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực này, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, gây đột biến định hướng tại chỗ. Sau đó, các phân tử biến đổi thu được có thể được kiểm tra hoạt tính bằng cách sử dụng các thử nghiệm in vitro hoặc in vivo như các thử nghiệm được mô tả ở đây hoặc thử nghiệm sàng lọc thích hợp bất kỳ khác đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này.
Theo sáng chế, các polypeptit có thể bao gồm trình tự liên ứng được phát hiện thông qua các vòng thử nghiệm. Như được sử dụng ở đây, trình tự “đồng thuận” là trình tự đơn thể hiện một tập hợp các trình tự cho phép có sự biến đổi ở một hoặc nhiều vị trí.
Như được công nhận bởi chuyên gia trong lĩnh vực kỹ thuật này, các đoạn protein, vùng protein chức năng, và protein tương đồng cũng được coi là nằm trong phạm vi các polypeptit được quan tâm theo sáng chế. Ví dụ, sáng chế đề xuất đoạn protein bất kỳ (nghĩa là trình tự polypeptit có ít nhất một gốc axit amin ngắn hơn trình tự polypeptit tham chiếu nhưng giống hệt) của protein tham chiếu 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, Chiều dài 90, 100 hoặc lớn hơn 100 axit amin. Trong một ví dụ khác, protein bất kỳ bao gồm một đoạn khoảng 20, khoảng 30, khoảng 40, khoảng 50, hoặc khoảng 100 axit amin với khoảng 40%, khoảng 50%, khoảng 60%, khoảng 70%, khoảng 80%, khoảng 90%, khoảng 95%, hoặc khoảng 100% giống với trình tự bất kỳ được mô tả ở đây có thể được sử dụng theo sáng chế. Theo các phương án nhất định, polypeptit được sử dụng theo sáng chế bao gồm 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, hoặc nhiều đột biến như được thể hiện ở trình tự bất kỳ trong số các trình tự được đề xuất hoặc đề cập ở đây.
Polypeptide được mã hóa
Cấu trúc chính hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được thiết kế để mã hóa các polypeptit quan tâm được chọn từ bất kỳ loại mục tiêu nào bao gồm, nhưng không giới hạn ở, sinh phẩm, kháng thể, vắc xin, protein hoặc peptit điều trị, peptit thâm nhập tế bào, protein được tiết, huyết tương. protein màng, protein tế bào chất hoặc tế bào chất, protein liên kết màng nội bào, protein hạt nhân, protein liên quan đến bệnh ở người, các phân tử đích hoặc các protein được mã hóa bởi bộ gen người mà không xác định được chỉ định điều trị nào nhưng dù sao cũng có ích trong các lĩnh vực nghiên cứu và khám phá.
In one embodiment primary constructs or mmRNA may encode variant polypeptides which have a certain identity with a reference polypeptide sequence. As used herein, a “reference polypeptide sequence” refers to a starting polypeptide sequence. Reference sequences may be wild type sequences or any sequence to which reference is made in the design of another sequence. A “reference polypeptide sequence” may, e.g., be any one of SEQ ID NOs: 4924-9439 as disclosed herein, e.g., any of SEQ ID NOs 4672, 4673, 4674, 4675, 4676, 4677, 4678, 4679, 4680, 4681, 4682, 4683, 4684, 4685, 4686, 4687, 4688, 4689, 4690, 4691, 4692, 4693, 4694, 4695, 4696, 4697, 4698, 4699, 4700, 4701, 4702, 4703, 4704, 4705, 4706, 4707, 4708, 4709, 4710, 4711, 4712, 4713, 4714, 4715, 4716, 4717, 4718, 4719, 4720, 4721, 4722, 4723, 4724, 4725, 4726, 4727, 4728, 4729, 4730, 4731, 4732, 4733, 4734, 4735, 4736, 4737, 4738, 4739, 4740, 4741, 4742, 4743, 4744, 4745, 4746, 4747, 4748, 4749, 4750, 4751, 4752, 4753, 4754, 4755, 4756, 4757, 4758, 4759, 4760, 4761, 4762, 4763, 4764, 4765, 4766, 4767, 4768, 4769, 4770, 4771, 4772, 4773, 4774, 4775, 4776, 4777, 4778, 4779, 4780, 4781, 4782, 4783, 4784, 4785, 4786, 4787, 4788, 4789, 4790, 4791, 4792, 4793, 4794, 4795, 4796, 4797, 4798, 4799, 4800, 4801, 4802, 4803, 4804, 4805, 4806, 4807, 4808, 4809, 4810, 4811, 4812, 4813, 4814, 4815, 4816, 4817, 4818, 4819, 4820, 4821, 4822, 4823, 4824, 4825, 4826, 4827, 4828, 4829, 4830, 4831, 4832, 4833, 4834, 4835, 4836, 4837, 4838, 4839, 4840, 4841, 4842, 4843, 4844, 4845, 4846, 4847, 4848, 4849, 4850, 4851, 4852, 4853, 4854, 4855, 4856, 4857, 4858, 4859, 4860, 4861, 4862, 4863, 4864, 4865, 4866, 4867, 4868, 4869, 4870, 4871, 4872, 4873, 4874, 4875, 4876, 4877, 4878, 4879, 4880, 4881, 4882, 4883, 4884, 4885, 4886, 4887, 4888, 4889, 4890, 4891, 4892, 4893, 4894, 4895, 4896, 4897, 4898, 4899, 4900, 4901, 4902, 4903, 4904, 4905, 4906, 4907, 4908, 4909, 4910, 4911, 4912, 4913, 4914, 4915, 4916, 4917, 4918, 4919, 4920, 4921, 4922, 4923, 4924, 4925, 4926, 4927, 4928, 4929, 4930, 4931, 4932, 4933, 4934, 4935, 4936, 4937, 4938, 4939, 4940, 4941, 4942, 4943, 4944, 4945, 4946, 4947, 4948, 4949, 4950, 4951, 4952, 4953, 4954, 4955, 4956, 4957, 4958, 4959, 4960, 4961, 4962, 4963, 4964, 4965, 4966, 4967, 4968, 4969, 4970, 4971, 4972, 4973, 4974, 4975, 4976, 4977, 4978, 4979, 4980, 4981, 4982, 4983, 4984, 4985, 4986, 4987, 4988, 4989, 4990, 4991, 4992, 4993, 4994, 4995, 4996, 4997, 4998, 4999, 5000, 5001, 5002, 5003, 5004, 5005, 5006, 5007, 5008, 5009, 5010, 5011, 5012, 5013, 5014, 5015, 5016, 5017, 5018, 5019, 5020, 5021, 5022, 5023, 5024, 5025, 5026, 5027, 5028, 5029, 5030, 5031, 5032, 5033, 5034, 5035, 5036, 5037, 5038, 5039, 5040, 5041, 5042, 5043, 5044, 5045, 5046, 5047, 5048, 5049, 5050, 5051, 5052, 5053, 5054, 5055, 5056, 5057, 5058, 5059, 5060, 5061, 5062, 5063, 5064, 5065, 5066, 5067, 5068, 5069, 5070, 5071, 5072, 5073, 5074, 5075, 5076, 5077, 5078, 5079, 5080, 5081, 5082, 5083, 5084, 5085, 5086, 5087, 5088, 5089, 5090, 5091, 5092, 5093, 5094, 5095, 5096, 5097, 5098, 5099, 5100, 5101, 5102, 5103, 5104, 5105, 5106, 5107, 5108, 5109, 5110, 5111, 5112, 5113, 5114,5115, 5116, 5117, 5118, 5119, 5120, 5121, 5122, 5123, 5124, 5125, 5126, 5127, 5128, 5129, 5130, 5131, 5132, 5133, 5134, 5135, 5136, 5137, 5138, 5139, 5140, 5141, 5142, 5143, 5144, 5145, 5146, 5147, 5148, 5149, 5150, 5151, 5152, 5153, 5154, 5155, 5156, 5157, 5158, 5159, 5160, 5161, 5162, 5163, 5164, 5165, 5166, 5167, 5168, 5169, 5170, 5171, 5172, 5173, 5174, 5175, 5176, 5177, 5178, 5179, 5180, 5181, 5182, 5183, 5184, 5185, 5186, 5187, 5188, 5189, 5190, 5191, 5192, 5193, 5194, 5195, 5196, 5197, 5198, 5199, 5200, 5201, 5202, 5203, 5204, 5205, 5206, 5207, 5208, 5209, 5210, 5211, 5212, 5213, 5214, 5215, 5216, 5217, 5218, 5219, 5220, 5221, 5222, 5223, 5224, 5225, 5226, 5227, 5228, 5229, 5230, 5231, 5232, 5233, 5234, 5235, 5236, 5237, 5238, 5239, 5240, 5241, 5242, 5243, 5244, 5245, 5246, 5247, 5248, 5249, 5250, 5251, 5252, 5253, 5254, 5255, 5256, 5257, 5258, 5259, 5260, 5261, 5262, 5263, 5264, 5265, 5266, 5267, 5268, 5269, 5270, 5271, 5272, 5273, 5274, 5275, 5276, 5277, 5278, 5279, 5280, 5281, 5282, 5283, 5284, 5285, 5286, 5287, 5288, 5289, 5290, 5291, 5292, 5293, 5294, 5295, 5296, 5297, 5298, 5299, 5300, 5301, 5302, 5303, 5304, 5305, 5306, 5307, 5308, 5309, 5310, 5311, 5312, 5313, 5314, 5315, 5316, 5317, 5318, 5319, 5320, 5321, 5322, 5323, 5324, 5325, 5326, 5327, 5328, 5329, 5330, 5331, 5332, 5333, 5334, 5335, 5336, 5337, 5338, 5339, 5340, 5341, 5342, 5343, 5344, 5345, 5346, 5347, 5348, 5349, 5350, 5351, 5352, 5353, 5354, 5355, 5356, 5357, 5358, 5359, 5360, 5361, 5362, 5363, 5364, 5365, 5366, 5367, 5368, 5369, 5370, 5371, 5372, 5373, 5374, 5375, 5376, 5377, 5378, 5379, 5380, 5381, 5382, 5383, 5384, 5385, 5386, 5387, 5388, 5389, 5390, 5391, 5392, 5393, 5394, 5395, 5396, 5397, 5398, 5399, 5400, 5401, 5402, 5403, 5404, 5405, 5406, 5407, 5408, 5409, 5410, 5411, 5412, 5413, 5414, 5415, 5416, 5417, 5418, 5419, 5420, 5421, 5422, 5423, 5424, 5425, 5426, 5427, 5428, 5429, 5430, 5431, 5432, 5433, 5434, 5435, 5436, 5437, 5438, 5439, 5440, 5441, 5442, 5443, 5444, 5445, 5446, 5447, 5448, 5449, 5450, 5451, 5452, 5453, 5454, 5455, 5456, 5457, 5458, 5459, 5460, 5461, 5462, 5463, 5464, 5465, 5466, 5467, 5468, 5469, 5470, 5471, 5472, 5473, 5474, 5475, 5476, 5477, 5478, 5479, 5480, 5481, 5482, 5483, 5484, 5485, 5486, 5487, 5488, 5489, 5490, 5491, 5492, 5493, 5494, 5495, 5496, 5497, 5498, 5499, 5500, 5501, 5502, 5503, 5504, 5505, 5506, 5507, 5508, 5509, 5510, 5511, 5512, 5513, 5514, 5515, 5516, 5517, 5518, 5519, 5520, 5521, 5522, 5523, 5524, 5525, 5526, 5527, 5528, 5529, 5530, 5531, 5532, 5533, 5534, 5535, 5536, 5537, 5538, 5539, 5540, 5541, 5542, 5543, 5544, 5545, 5546, 5547, 5548, 5549, 5550, 5551, 5552, 5553, 5554, 5555, 5556, 5557, 5558, 5559, 5560, 5561, 5562, 5563, 5564, 5565, 5566, 5567, 5568, 5569, 5570, 5571, 5572, 5573, 5574, 5575, 5576, 5577, 5578, 5579, 5580, 5581, 5582, 5583, 5584, 5585, 5586, 5587, 5588, 5589, 5590, 5591, 5592, 5593, 5594, 5595, 5596, 5597, 5598, 5599, 5600, 5601, 5602, 5603, 5604, 5605, 5606, 5607, 5608, 5609, 5610, 5611, 5612, 5613, 5614, 5615, 5616, 5617, 5618, 5619, 5620, 5621, 5622, 5623, 5624, 5625, 5626, 5627, 5628, 5629, 5630, 5631, 5632, 5633, 5634, 5635, 5636, 5637, 5638, 5639, 5640, 5641, 5642, 5643, 5644, 5645, 5646, 5647, 5648, 5649, 5650, 5651, 5652, 5653, 5654, 5655, 5656, 5657, 5658, 5659, 5660, 5661, 5662, 5663, 5664, 5665, 5666, 5667, 5668, 5669, 5670, 5671, 5672, 5673, 5674, 5675, 5676, 5677, 5678, 5679, 5680, 5681, 5682, 5683, 5684, 5685, 5686, 5687, 5688, 5689, 5690, 5691, 5692, 5693, 5694, 5695, 5696, 5697, 5698, 5699, 5700, 5701, 5702, 5703, 5704, 5705, 5706, 5707, 5708, 5709, 5710, 5711, 5712, 5713, 5714, 5715, 5716, 5717, 5718, 5719, 5720, 5721, 5722, 5723, 5724, 5725, 5726, 5727, 5728, 5729, 5730, 5731, 5732, 5733, 5734, 5735, 5736, 5737, 5738, 5739, 5740, 5741, 5742, 5743, 5744, 5745, 5746, 5747, 5748, 5749, 5750, 5751, 5752, 5753, 5754, 5755, 5756, 5757, 5758, 5759, 5760, 5761, 5762, 5763, 5764, 5765, 5766, 5767, 5768, 5769, 5770, 5771, 5772, 5773, 5774, 5775, 5776, 5777, 5778, 5779, 5780, 5781, 5782, 5783, 5784, 5785, 5786, 5787, 5788, 5789, 5790, 5791, 5792, 5793, 5794, 5795, 5796, 5797, 5798, 5799, 5800, 5801, 5802, 5803, 5804, 5805, 5806, 5807, 5808, 5809, 5810, 5811, 5812, 5813, 5814, 5815, 5816, 5817, 5818, 5819, 5820, 5821, 5822, 5823, 5824, 5825, 5826, 5827, 5828, 5829, 5830, 5831, 5832, 5833, 5834, 5835, 5836, 5837, 5838, 5839, 5840, 5841, 5842, 5843, 5844, 5845, 5846, 5847, 5848, 5849, 5850, 5851, 5852, 5853, 5854, 5855, 5856, 5857, 5858, 5859, 5860, 5861, 5862, 5863, 5864, 5865, 5866, 5867, 5868, 5869, 5870, 5871, 5872, 5873, 5874, 5875, 5876, 5877, 5878, 5879, 5880, 5881, 5882, 5883, 5884, 5885, 5886, 5887, 5888, 5889, 5890, 5891, 5892, 5893, 5894, 5895, 5896, 5897, 5898, 5899, 5900, 5901, 5902, 5903, 5904, 5905, 5906, 5907, 5908, 5909, 5910, 5911, 5912, 5913, 5914, 5915, 5916, 5917, 5918, 5919, 5920, 5921, 5922, 5923, 5924, 5925, 5926, 5927, 5928, 5929, 5930, 5931, 5932, 5933, 5934, 5935, 5936, 5937, 5938, 5939, 5940, 5941, 5942, 5943, 5944, 5945, 5946, 5947, 5948, 5949, 5950, 5951, 5952, 5953, 5954, 5955, 5956, 5957, 5958, 5959, 5960, 5961, 5962, 5963, 5964, 5965, 5966, 5967, 5968, 5969, 5970, 5971, 5972, 5973, 5974, 5975, 5976, 5977, 5978, 5979, 5980, 5981, 5982, 5983, 5984, 5985, 5986, 5987, 5988, 5989, 5990, 5991, 5992, 5993, 5994, 5995, 5996, 5997, 5998, 5999, 6000, 6001, 6002, 6003, 6004, 6005, 6006, 6007, 6008, 6009, 6010, 6011, 6012, 6013, 6014, 6015, 6016, 6017, 6018, 6019, 6020, 6021, 6022, 6023, 6024, 6025, 6026, 6027, 6028, 6029, 6030, 6031, 6032, 6033, 6034, 6035, 6036, 6037, 6038, 6039, 6040, 6041, 6042, 6043, 6044, 6045, 6046, 6047, 6048, 6049, 6050, 6051, 6052, 6053, 6054, 6055, 6056, 6057, 6058, 6059, 6060, 6061, 6062, 6063, 6064, 6065, 6066, 6067, 6068, 6069, 6070, 6071, 6072, 6073, 6074, 6075, 6076, 6077, 6078, 6079, 6080, 6081, 6082, 6083, 6084, 6085, 6086, 6087, 6088, 6089, 6090, 6091, 6092, 6093, 6094, 6095, 6096, 6097, 6098, 6099, 6100, 6101, 6102, 6103, 6104, 6105, 6106, 6107, 6108, 6109, 6110, 6111, 6112, 6113, 6114, 6115, 6116, 6117, 6118, 6119, 6120, 6121, 6122, 6123, 6124, 6125, 6126, 6127, 6128, 6129, 6130, 6131, 6132, 6133, 6134, 6135, 6136, 6137, 6138, 6139, 6140, 6141, 6142, 6143, 6144, 6145, 6146, 6147, 6148, 6149, 6150, 6151, 6152, 6153, 6154, 6155, 6156, 6157, 6158, 6159, 6160, 6161, 6162, 6163, 6164, 6165, 6166, 6167, 6168, 6169, 6170, 6171, 6172, 6173, 6174, 6175, 6176, 6177, 6178, 6179, 6180, 6181, 6182, 6183, 6184, 6185, 6186, 6187, 6188, 6189, 6190, 6191, 6192, 6193, 6194, 6195, 6196, 6197, 6198, 6199, 6200, 6201, 6202, 6203, 6204, 6205, 6206, 6207, 6208, 6209, 6210, 6211, 6212, 6213, 6214, 6215, 6216, 6217, 6218, 6219, 6220, 6221, 6222, 6223, 6224, 6225, 6226, 6227, 6228, 6229, 6230, 6231, 6232, 6233, 6234, 6235, 6236, 6237, 6238, 6239, 6240, 6241, 6242, 6243, 6244, 6245, 6246, 6247, 6248, 6249, 6250, 6251, 6252, 6253, 6254, 6255, 6256, 6257, 6258, 6259, 6260, 6261, 6262, 6263, 6264, 6265, 6266, 6267, 6268, 6269, 6270, 6271, 6272, 6273, 6274, 6275, 6276, 6277, 6278, 6279, 6280, 6281, 6282, 6283, 6284, 6285, 6286, 6287, 6288, 6289, 6290, 6291, 6292, 6293, 6294, 6295, 6296, 6297, 6298, 6299, 6300, 6301, 6302, 6303, 6304, 6305, 6306, 6307, 6308, 6309, 6310, 6311, 6312, 6313, 6314, 6315, 6316, 6317, 6318, 6319, 6320, 6321, 6322, 6323, 6324, 6325, 6326, 6327, 6328, 6329, 6330, 6331, 6332, 6333, 6334, 6335, 6336, 6337, 6338, 6339, 6340, 6341, 6342, 6343, 6344, 6345, 6346, 6347, 6348, 6349, 6350, 6351, 6352, 6353, 6354, 6355, 6356, 6357, 6358, 6359, 6360, 6361, 6362, 6363, 6364, 6365, 6366, 6367, 6368, 6369, 6370, 6371, 6372, 6373, 6374, 6375, 6376, 6377, 6378, 6379, 6380, 6381, 6382, 6383, 6384, 6385, 6386, 6387, 6388, 6389, 6390, 6391, 6392, 6393, 6394, 6395, 6396, 6397, 6398, 6399, 6400, 6401, 6402, 6403, 6404, 6405, 6406, 6407, 6408, 6409, 6410, 6411, 6412, 6413, 6414, 6415, 6416, 6417, 6418, 6419, 6420, 6421, 6422, 6423, 6424, 6425, 6426, 6427, 6428, 6429, 6430, 6431, 6432, 6433, 6434, 6435, 6436, 6437, 6438, 6439, 6440, 6441, 6442, 6443, 6444, 6445, 6446, 6447, 6448, 6449, 6450, 6451, 6452, 6453, 6454, 6455, 6456, 6457, 6458, 6459, 6460, 6461, 6462, 6463, 6464, 6465, 6466, 6467, 6468, 6469, 6470, 6471, 6472, 6473, 6474, 6475, 6476, 6477, 6478, 6479, 6480, 6481, 6482, 6483, 6484, 6485, 6486, 6487, 6488, 6489, 6490, 6491, 6492, 6493, 6494, 6495, 6496, 6497, 6498, 6499, 6500, 6501, 6502, 6503, 6504, 6505, 6506, 6507, 6508, 6509, 6510, 6511, 6512, 6513, 6514, 6515, 6516, 6517, 6518, 6519, 6520, 6521, 6522, 6523, 6524, 6525, 6526, 6527, 6528, 6529, 6530, 6531, 6532, 6533, 6534, 6535, 6536, 6537, 6538, 6539, 6540, 6541, 6542, 6543, 6544, 6545, 6546, 6547, 6548, 6549, 6550, 6551, 6552, 6553, 6554, 6555, 6556, 6557, 6558, 6559, 6560, 6561, 6562, 6563, 6564, 6565, 6566, 6567, 6568, 6569, 6570, 6571, 6572, 6573, 6574, 6575, 6576, 6577, 6578, 6579, 6580, 6581, 6582, 6583, 6584, 6585, 6586, 6587, 6588, 6589, 6590, 6591, 6592, 6593, 6594, 6595, 6596, 6597, 6598, 6599, 6600, 6601, 6602, 6603, 6604, 6605, 6606, 6607, 6608, 6609, 6610, 6611, 6612, 6613, 6614, 6615, 6616, 6617, 6618, 6619, 6620, 6621, 6622, 6623, 6624, 6625, 6626, 6627, 6628, 6629, 6630, 6631, 6632, 6633, 6634, 6635, 6636, 6637, 6638, 6639, 6640, 6641, 6642, 6643, 6644, 6645, 6646, 6647, 6648, 6649, 6650, 6651, 6652, 6653, 6654, 6655, 6656, 6657, 6658, 6659, 6660, 6661, 6662, 6663, 6664, 6665, 6666, 6667, 6668, 6669, 6670, 6671, 6672, 6673, 6674, 6675, 6676, 6677, 6678, 6679, 6680, 6681, 6682, 6683, 6684, 6685, 6686, 6687, 6688, 6689, 6690, 6691, 6692, 6693, 6694, 6695, 6696, 6697, 6698, 6699, 6700, 6701, 6702, 6703, 6704, 6705, 6706, 6707, 6708, 6709, 6710, 6711, 6712, 6713, 6714, 6715, 6716, 6717, 6718, 6719, 6720, 6721, 6722, 6723, 6724, 6725, 6726, 6727, 6728, 6729, 6730, 6731, 6732, 6733, 6734, 6735, 6736, 6737, 6738, 6739, 6740, 6741, 6742, 6743, 6744, 6745, 6746, 6747, 6748, 6749, 6750, 6751, 6752, 6753, 6754, 6755, 6756, 6757, 6758, 6759, 6760, 6761, 6762, 6763, 6764, 6765, 6766, 6767, 6768, 6769, 6770, 6771, 6772, 6773, 6774, 6775, 6776, 6777, 6778, 6779, 6780, 6781, 6782, 6783, 6784, 6785, 6786, 6787, 6788, 6789, 6790, 6791, 6792, 6793, 6794, 6795, 6796, 6797, 6798, 6799, 6800, 6801, 6802, 6803, 6804, 6805, 6806, 6807, 6808, 6809, 6810, 6811, 6812, 6813, 6814, 6815, 6816, 6817, 6818, 6819, 6820, 6821, 6822, 6823, 6824, 6825, 6826, 6827, 6828, 6829, 6830, 6831, 6832, 6833, 6834, 6835, 6836, 6837, 6838, 6839, 6840, 6841, 6842, 6843, 6844, 6845, 6846, 6847, 6848, 6849, 6850, 6851, 6852, 6853, 6854, 6855, 6856, 6857, 6858, 6859, 6860, 6861, 6862, 6863, 6864, 6865, 6866, 6867, 6868, 6869, 6870, 6871, 6872, 6873, 6874, 6875, 6876, 6877, 6878, 6879, 6880, 6881, 6882, 6883, 6884, 6885, 6886, 6887, 6888, 6889, 6890, 6891, 6892, 6893, 6894, 6895, 6896, 6897, 6898, 6899, 6900, 6901, 6902, 6903, 6904, 6905, 6906, 6907, 6908, 6909, 6910, 6911, 6912, 6913, 6914, 6915, 6916, 6917, 6918, 6919, 6920, 6921, 6922, 6923, 6924, 6925, 6926, 6927, 6928, 6929, 6930, 6931, 6932, 6933, 6934, 6935, 6936, 6937, 6938, 6939, 6940, 6941, 6942, 6943, 6944, 6945, 6946, 6947, 6948, 6949, 6950, 6951, 6952, 6953, 6954, 6955, 6956, 6957, 6958, 6959, 6960, 6961, 6962, 6963, 6964, 6965, 6966, 6967, 6968, 6969, 6970, 6971, 6972, 6973, 6974, 6975, 6976, 6977, 6978, 6979, 6980, 6981, 6982, 6983, 6984, 6985, 6986, 6987, 6988, 6989, 6990, 6991, 6992, 6993, 6994, 6995, 6996, 6997, 6998, 6999, 7000, 7001, 7002, 7003, 7004, 7005, 7006, 7007, 7008, 7009, 7010, 7011, 7012, 7013, 7014, 7015, 7016, 7017, 7018, 7019, 7020, 7021, 7022, 7023, 7024, 7025, 7026, 7027, 7028, 7029, 7030, 7031, 7032, 7033, 7034, 7035, 7036, 7037, 7038, 7039, 7040, 7041, 7042, 7043, 7044, 7045, 7046, 7047, 7048, 7049, 7050, 7051, 7052, 7053, 7054, 7055, 7056, 7057, 7058, 7059, 7060, 7061, 7062, 7063, 7064, 7065, 7066, 7067, 7068, 7069, 7070, 7071, 7072, 7073, 7074, 7075, 7076, 7077, 7078, 7079, 7080, 7081, 7082, 7083, 7084, 7085, 7086, 7087, 7088, 7089, 7090, 7091, 7092, 7093, 7094, 7095, 7096, 7097, 7098, 7099, 7100, 7101, 7102, 7103, 7104, 7105, 7106, 7107, 7108, 7109, 7110, 7111, 7112, 7113, 7114, 7115, 7116, 7117, 7118, 7119, 7120, 7121, 7122, 7123, 7124, 7125, 7126, 7127, 7128, 7129, 7130, 7131, 7132, 7133, 7134, 7135, 7136, 7137, 7138, 7139, 7140, 7141, 7142, 7143, 7144, 7145, 7146, 7147, 7148, 7149, 7150, 7151, 7152, 7153, 7154, 7155, 7156, 7157, 7158, 7159, 7160, 7161, 7162, 7163, 7164, 7165, 7166, 7167, 7168, 7169, 7170, 7171, 7172, 7173, 7174, 7175, 7176, 7177, 7178, 7179, 7180, 7181, 7182, 7183, 7184, 7185, 7186, 7187, 7188, 7189, 7190, 7191, 7192, 7193, 7194, 7195, 7196, 7197, 7198, 7199, 7200, 7201, 7202, 7203, 7204, 7205, 7206, 7207, 7208, 7209, 7210, 7211, 7212, 7213, 7214, 7215, 7216, 7217, 7218, 7219, 7220, 7221, 7222, 7223, 7224, 7225, 7226, 7227, 7228, 7229, 7230, 7231, 7232, 7233, 7234, 7235, 7236, 7237, 7238, 7239, 7240, 7241, 7242, 7243, 7244, 7245, 7246, 7247, 7248, 7249, 7250, 7251, 7252, 7253, 7254, 7255, 7256, 7257, 7258, 7259, 7260, 7261, 7262, 7263, 7264, 7265, 7266, 7267, 7268, 7269, 7270, 7271, 7272, 7273, 7274, 7275, 7276, 7277, 7278, 7279, 7280, 7281, 7282, 7283, 7284, 7285, 7286, 7287, 7288, 7289, 7290, 7291, 7292, 7293, 7294, 7295, 7296, 7297, 7298, 7299, 7300, 7301, 7302, 7303, 7304, 7305, 7306, 7307, 7308, 7309, 7310, 7311, 7312, 7313, 7314, 7315, 7316, 7317, 7318, 7319, 7320, 7321, 7322, 7323, 7324, 7325, 7326, 7327, 7328, 7329, 7330, 7331, 7332, 7333, 7334, 7335, 7336, 7337, 7338, 7339, 7340, 7341, 7342, 7343, 7344, 7345, 7346, 7347, 7348, 7349, 7350, 7351, 7352, 7353, 7354, 7355, 7356, 7357, 7358, 7359, 7360, 7361, 7362, 7363, 7364, 7365, 7366, 7367, 7368, 7369, 7370, 7371, 7372, 7373, 7374, 7375, 7376, 7377, 7378, 7379, 7380, 7381, 7382, 7383, 7384, 7385, 7386, 7387, 7388, 7389, 7390, 7391, 7392, 7393, 7394, 7395, 7396, 7397, 7398, 7399, 7400, 7401, 7402, 7403, 7404, 7405, 7406, 7407, 7408, 7409, 7410, 7411, 7412, 7413, 7414, 7415, 7416, 7417, 7418, 7419, 7420, 7421, 7422, 7423, 7424, 7425, 7426, 7427, 7428, 7429, 7430, 7431, 7432, 7433, 7434, 7435, 7436, 7437, 7438, 7439, 7440, 7441, 7442, 7443, 7444, 7445, 7446, 7447, 7448, 7449, 7450, 7451, 7452, 7453, 7454, 7455, 7456, 7457, 7458, 7459, 7460, 7461, 7462, 7463, 7464, 7465, 7466, 7467, 7468, 7469, 7470, 7471, 7472, 7473, 7474, 7475, 7476, 7477, 7478, 7479, 7480, 7481, 7482, 7483, 7484, 7485, 7486, 7487, 7488, 7489, 7490, 7491, 7492, 7493, 7494, 7495, 7496, 7497, 7498, 7499, 7500, 7501, 7502, 7503, 7504, 7505, 7506, 7507, 7508, 7509, 7510, 7511, 7512, 7513, 7514, 7515, 7516, 7517, 7518, 7519, 7520, 7521, 7522, 7523, 7524, 7525, 7526, 7527, 7528, 7529, 7530, 7531, 7532, 7533, 7534, 7535, 7536, 7537, 7538, 7539, 7540, 7541, 7542, 7543, 7544, 7545, 7546, 7547, 7548, 7549, 7550, 7551, 7552, 7553, 7554, 7555, 7556, 7557, 7558, 7559, 7560, 7561, 7562, 7563, 7564, 7565, 7566, 7567, 7568, 7569, 7570, 7571, 7572, 7573, 7574, 7575, 7576, 7577, 7578, 7579, 7580, 7581, 7582, 7583, 7584, 7585, 7586, 7587, 7588, 7589, 7590, 7591, 7592, 7593, 7594, 7595, 7596, 7597, 7598, 7599, 7600, 7601, 7602, 7603, 7604, 7605, 7606, 7607, 7608, 7609, 7610, 7611, 7612, 7613, 7614, 7615, 7616, 7617, 7618, 7619, 7620, 7621, 7622, 7623, 7624, 7625, 7626, 7627, 7628, 7629, 7630, 7631, 7632, 7633, 7634, 7635, 7636, 7637, 7638, 7639, 7640, 7641, 7642, 7643, 7644, 7645, 7646, 7647, 7648, 7649, 7650, 7651, 7652, 7653, 7654, 7655, 7656, 7657, 7658, 7659, 7660, 7661, 7662, 7663, 7664, 7665, 7666, 7667, 7668, 7669, 7670, 7671, 7672, 7673, 7674, 7675, 7676, 7677, 7678, 7679, 7680, 7681, 7682, 7683, 7684, 7685, 7686, 7687, 7688, 7689, 7690, 7691, 7692, 7693, 7694, 7695, 7696, 7697, 7698, 7699, 7700, 7701, 7702, 7703, 7704, 7705, 7706, 7707, 7708, 7709, 7710, 7711, 7712, 7713, 7714, 7715, 7716, 7717, 7718, 7719, 7720, 7721, 7722, 7723, 7724, 7725, 7726, 7727, 7728, 7729, 7730, 7731, 7732, 7733, 7734, 7735, 7736, 7737, 7738, 7739, 7740, 7741, 7742, 7743, 7744, 7745, 7746, 7747, 7748, 7749, 7750, 7751, 7752, 7753, 7754, 7755, 7756, 7757, 7758, 7759, 7760, 7761, 7762, 7763, 7764, 7765, 7766, 7767, 7768, 7769, 7770, 7771, 7772, 7773, 7774, 7775, 7776, 7777, 7778, 7779, 7780, 7781, 7782, 7783, 7784, 7785, 7786, 7787, 7788, 7789, 7790, 7791, 7792, 7793, 7794, 7795, 7796, 7797, 7798, 7799, 7800, 7801, 7802, 7803, 7804, 7805, 7806, 7807, 7808, 7809, 7810, 7811, 7812, 7813, 7814, 7815, 7816, 7817, 7818, 7819, 7820, 7821, 7822, 7823, 7824, 7825, 7826, 7827, 7828, 7829, 7830, 7831, 7832, 7833, 7834, 7835, 7836, 7837, 7838, 7839, 7840, 7841, 7842, 7843, 7844, 7845, 7846, 7847, 7848, 7849, 7850, 7851, 7852, 7853, 7854, 7855, 7856, 7857, 7858, 7859, 7860, 7861, 7862, 7863, 7864, 7865, 7866, 7867, 7868, 7869, 7870, 7871, 7872, 7873, 7874, 7875, 7876, 7877, 7878, 7879, 7880, 7881, 7882, 7883, 7884, 7885, 7886, 7887, 7888, 7889, 7890, 7891, 7892, 7893, 7894, 7895, 7896, 7897, 7898, 7899, 7900, 7901, 7902, 7903, 7904, 7905, 7906, 7907, 7908, 7909, 7910, 7911, 7912, 7913, 7914, 7915, 7916, 7917, 7918, 7919, 7920, 7921, 7922, 7923, 7924, 7925, 7926, 7927, 7928, 7929, 7930, 7931, 7932, 7933, 7934, 7935, 7936, 7937, 7938, 7939, 7940, 7941, 7942, 7943, 7944, 7945, 7946, 7947, 7948, 7949, 7950, 7951, 7952, 7953, 7954, 7955, 7956, 7957, 7958, 7959, 7960, 7961, 7962, 7963, 7964, 7965, 7966, 7967, 7968, 7969, 7970, 7971, 7972, 7973, 7974, 7975, 7976, 7977, 7978, 7979, 7980, 7981, 7982, 7983, 7984, 7985, 7986, 7987, 7988, 7989, 7990, 7991, 7992, 7993, 7994, 7995, 7996, 7997, 7998, 7999, 8000, 8001, 8002, 8003, 8004, 8005, 8006, 8007, 8008, 8009, 8010, 8011, 8012, 8013, 8014, 8015, 8016, 8017, 8018, 8019, 8020, 8021, 8022, 8023, 8024, 8025, 8026, 8027, 8028, 8029, 8030, 8031, 8032, 8033, 8034, 8035, 8036, 8037, 8038, 8039, 8040, 8041, 8042, 8043, 8044, 8045, 8046, 8047, 8048, 8049, 8050, 8051, 8052, 8053, 8054, 8055, 8056, 8057, 8058, 8059, 8060, 8061, 8062, 8063, 8064, 8065, 8066, 8067, 8068, 8069, 8070, 8071, 8072, 8073, 8074, 8075, 8076, 8077, 8078, 8079, 8080, 8081, 8082, 8083, 8084, 8085, 8086, 8087, 8088, 8089, 8090, 8091, 8092, 8093, 8094, 8095, 8096, 8097, 8098, 8099, 8100, 8101, 8102, 8103, 8104, 8105, 8106, 8107, 8108, 8109, 8110, 8111, 8112, 8113, 8114, 8115, 8116, 8117, 8118, 8119, 8120, 8121, 8122, 8123, 8124, 8125, 8126, 8127, 8128, 8129, 8130, 8131, 8132, 8133, 8134, 8135, 8136, 8137, 8138, 8139, 8140, 8141, 8142, 8143, 8144, 8145, 8146, 8147, 8148, 8149, 8150, 8151, 8152, 8153, 8154, 8155, 8156, 8157, 8158, 8159, 8160, 8161, 8162, 8163, 8164, 8165, 8166, 8167, 8168, 8169, 8170, 8171, 8172, 8173, 8174, 8175, 8176, 8177, 8178, 8179, 8180, 8181, 8182, 8183, 8184, 8185, 8186, 8187, 8188, 8189, 8190, 8191, 8192, 8193, 8194, 8195, 8196, 8197, 8198, 8199, 8200, 8201, 8202, 8203, 8204, 8205, 8206, 8207, 8208, 8209, 8210, 8211, 8212, 8213, 8214, 8215, 8216, 8217, 8218, 8219, 8220, 8221, 8222, 8223, 8224, 8225, 8226, 8227, 8228, 8229, 8230, 8231, 8232, 8233, 8234, 8235, 8236, 8237, 8238, 8239, 8240, 8241, 8242, 8243, 8244, 8245, 8246, 8247, 8248, 8249, 8250, 8251, 8252, 8253, 8254, 8255, 8256, 8257, 8258, 8259, 8260, 8261, 8262, 8263, 8264, 8265, 8266, 8267, 8268, 8269, 8270, 8271, 8272, 8273, 8274, 8275, 8276, 8277, 8278, 8279, 8280, 8281, 8282, 8283, 8284, 8285, 8286, 8287, 8288, 8289, 8290, 8291, 8292, 8293, 8294, 8295, 8296, 8297, 8298, 8299, 8300, 8301, 8302, 8303, 8304, 8305, 8306, 8307, 8308, 8309, 8310, 8311, 8312, 8313, 8314, 8315, 8316, 8317, 8318, 8319, 8320, 8321, 8322, 8323, 8324, 8325, 8326, 8327, 8328, 8329, 8330, 8331, 8332, 8333, 8334, 8335, 8336, 8337, 8338, 8339, 8340, 8341, 8342, 8343, 8344, 8345, 8346, 8347, 8348, 8349, 8350, 8351, 8352, 8353, 8354, 8355, 8356, 8357, 8358, 8359, 8360, 8361, 8362, 8363, 8364, 8365, 8366, 8367, 8368, 8369, 8370, 8371, 8372, 8373, 8374, 8375, 8376, 8377, 8378, 8379, 8380, 8381, 8382, 8383, 8384, 8385, 8386, 8387, 8388, 8389, 8390, 8391, 8392, 8393, 8394, 8395, 8396, 8397, 8398, 8399, 8400, 8401, 8402, 8403, 8404, 8405, 8406, 8407, 8408, 8409, 8410, 8411, 8412, 8413, 8414, 8415, 8416, 8417, 8418, 8419, 8420, 8421, 8422, 8423, 8424, 8425, 8426, 8427, 8428, 8429, 8430, 8431, 8432, 8433, 8434, 8435, 8436, 8437, 8438, 8439, 8440, 8441, 8442, 8443, 8444, 8445, 8446, 8447, 8448, 8449, 8450, 8451, 8452, 8453, 8454, 8455, 8456, 8457, 8458, 8459, 8460, 8461, 8462, 8463, 8464, 8465, 8466, 8467, 8468, 8469, 8470, 8471, 8472, 8473, 8474, 8475, 8476, 8477, 8478, 8479, 8480, 8481, 8482, 8483, 8484, 8485, 8486, 8487, 8488, 8489, 8490, 8491, 8492, 8493, 8494, 8495, 8496, 8497, 8498, 8499, 8500, 8501, 8502, 8503, 8504, 8505, 8506, 8507, 8508, 8509, 8510, 8511, 8512, 8513, 8514, 8515, 8516, 8517, 8518, 8519, 8520, 8521, 8522, 8523, 8524, 8525, 8526, 8527, 8528, 8529, 8530, 8531, 8532, 8533, 8534, 8535, 8536, 8537, 8538, 8539, 8540, 8541, 8542, 8543, 8544, 8545, 8546, 8547, 8548, 8549, 8550, 8551, 8552, 8553, 8554, 8555, 8556, 8557, 8558, 8559, 8560, 8561, 8562, 8563, 8564, 8565, 8566, 8567, 8568, 8569, 8570, 8571, 8572, 8573, 8574, 8575, 8576, 8577, 8578, 8579, 8580, 8581, 8582, 8583, 8584, 8585, 8586, 8587, 8588, 8589, 8590, 8591, 8592, 8593, 8594, 8595, 8596, 8597, 8598, 8599, 8600, 8601, 8602, 8603, 8604, 8605, 8606, 8607, 8608, 8609, 8610, 8611, 8612, 8613, 8614, 8615, 8616, 8617, 8618, 8619, 8620, 8621, 8622, 8623, 8624, 8625, 8626, 8627, 8628, 8629, 8630, 8631, 8632, 8633, 8634, 8635, 8636, 8637, 8638, 8639, 8640, 8641, 8642, 8643, 8644, 8645, 8646, 8647, 8648, 8649, 8650, 8651, 8652, 8653, 8654, 8655, 8656, 8657, 8658, 8659, 8660, 8661, 8662, 8663, 8664, 8665, 8666, 8667, 8668, 8669, 8670, 8671, 8672, 8673, 8674, 8675, 8676, 8677, 8678, 8679, 8680, 8681, 8682, 8683, 8684, 8685, 8686, 8687, 8688, 8689, 8690, 8691, 8692, 8693, 8694, 8695, 8696, 8697, 8698, 8699, 8700, 8701, 8702, 8703, 8704, 8705, 8706, 8707, 8708, 8709, 8710, 8711, 8712, 8713, 8714, 8715, 8716, 8717, 8718, 8719, 8720, 8721, 8722, 8723, 8724, 8725, 8726, 8727, 8728, 8729, 8730, 8731, 8732, 8733, 8734, 8735, 8736, 8737, 8738, 8739, 8740, 8741, 8742, 8743, 8744, 8745, 8746, 8747, 8748, 8749, 8750, 8751, 8752, 8753, 8754, 8755, 8756, 8757, 8758, 8759, 8760, 8761, 8762, 8763, 8764, 8765, 8766, 8767, 8768, 8769, 8770, 8771, 8772, 8773, 8774, 8775, 8776, 8777, 8778, 8779, 8780, 8781, 8782, 8783, 8784, 8785, 8786, 8787, 8788, 8789, 8790, 8791, 8792, 8793, 8794, 8795, 8796, 8797, 8798, 8799, 8800, 8801, 8802, 8803, 8804, 8805, 8806, 8807, 8808, 8809, 8810, 8811, 8812, 8813, 8814, 8815, 8816, 8817, 8818, 8819, 8820, 8821, 8822, 8823, 8824, 8825, 8826, 8827, 8828, 8829, 8830, 8831, 8832, 8833, 8834, 8835, 8836, 8837, 8838, 8839, 8840, 8841, 8842, 8843, 8844, 8845, 8846, 8847, 8848, 8849, 8850, 8851, 8852, 8853, 8854, 8855, 8856, 8857, 8858, 8859, 8860, 8861, 8862, 8863, 8864, 8865, 8866, 8867, 8868, 8869, 8870, 8871, 8872, 8873, 8874, 8875, 8876, 8877, 8878, 8879, 8880, 8881, 8882, 8883, 8884, 8885, 8886, 8887, 8888, 8889, 8890, 8891, 8892, 8893, 8894, 8895, 8896, 8897, 8898, 8899, 8900, 8901, 8902, 8903, 8904, 8905, 8906, 8907, 8908, 8909, 8910, 8911, 8912, 8913, 8914, 8915, 8916, 8917, 8918, 8919, 8920, 8921, 8922, 8923, 8924, 8925, 8926, 8927, 8928, 8929, 8930, 8931, 8932, 8933, 8934, 8935, 8936, 8937, 8938, 8939, 8940, 8941, 8942, 8943, 8944, 8945, 8946, 8947, 8948, 8949, 8950, 8951, 8952, 8953, 8954, 8955, 8956, 8957, 8958, 8959, 8960, 8961, 8962, 8963, 8964, 8965, 8966, 8967, 8968, 8969, 8970, 8971, 8972, 8973, 8974, 8975, 8976, 8977, 8978, 8979, 8980, 8981, 8982, 8983, 8984, 8985, 8986, 8987, 8988, 8989, 8990, 8991, 8992, 8993, 8994, 8995, 8996, 8997, 8998, 8999, 9000, 9001, 9002, 9003, 9004, 9005, 9006, 9007, 9008, 9009, 9010, 9011, 9012, 9013, 9014, 9015, 9016, 9017, 9018, 9019, 9020, 9021, 9022, 9023, 9024, 9025, 9026, 9027, 9028, 9029, 9030, 9031, 9032, 9033, 9034, 9035, 9036, 9037, 9038, 9039, 9040, 9041, 9042, 9043, 9044, 9045, 9046, 9047, 9048, 9049, 9050, 9051, 9052, 9053, 9054, 9055, 9056, 9057, 9058, 9059, 9060, 9061, 9062, 9063, 9064, 9065, 9066, 9067, 9068, 9069, 9070, 9071, 9072, 9073, 9074, 9075, 9076, 9077, 9078, 9079, 9080, 9081, 9082, 9083, 9084, 9085, 9086, 9087, 9088, 9089, 9090, 9091, 9092, 9093, 9094, 9095, 9096, 9097, 9098, 9099, 9100, 9101, 9102, 9103, 9104, 9105, 9106, 9107, 9108, 9109, 9110, 9111, 9112, 9113, 9114, 9115, 9116, 9117, 9118, 9119, 9120, 9121, 9122, 9123, 9124, 9125, 9126, 9127, 9128, 9129, 9130, 9131, 9132, 9133, 9134, 9135, 9136, 9137, 9138, 9139, 9140, 9141, 9142, 9143, 9144, 9145, 9146, 9147, 9148, 9149, 9150, 9151, 9152, 9153, 9154, 9155, 9156, 9157, 9158, 9159, 9160, 9161, 9162, 9163, 9164, 9165, 9166, 9167, 9168, 9169, 9170, 9171, 9172, 9173, 9174, 9175, 9176, 9177, 9178, 9179, 9180, 9181, 9182, 9183, 9184, 9185, 9186, 9187.
Thuật ngữ “nhận dạng” như đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này, dùng để chỉ mối quan hệ giữa các trình tự của hai hoặc nhiều peptit, như được xác định bằng cách so sánh các trình tự. Trong lĩnh vực kỹ thuật này, tính đồng nhất còn có nghĩa là mức độ liên quan đến trình tự giữa các peptit, được xác định bằng số lượng trùng khớp giữa các chuỗi có hai hoặc nhiều gốc axit amin. Nhận dạng đo lường phần trăm các kết quả trùng khớp giống nhau giữa chuỗi nhỏ hơn trong số hai hoặc nhiều chuỗi có sự sắp xếp khoảng cách (nếu có) được giải quyết bằng một mô hình toán học hoặc chương trình máy tính cụ thể (tức là “thuật toán”). Việc nhận dạng các peptit liên quan có thể được tính toán dễ dàng bằng các phương pháp đã biết. Những phương pháp như vậy bao gồm, nhưng không giới hạn, những phương pháp được mô tả trong Sinh học phân tử tính toán, Lesk, A. M., ed., Nhà xuất bản Đại học Oxford, New York, 1988; Điện toán sinh học: Dự án tin học và bộ gen, Smith, D. W., ed., Nhà xuất bản học thuật, New York, 1993; Phân tích dữ liệu trình tự trên máy tính, Phần1, Griffin, A. M., và Griffin, H. G., biên tập, Humana Press, New Jersey, 1994; Phân tích trình tự trong sinh học phân tử, von Heinje, G., Nhà xuất bản học thuật, 1987; Primer Phân tích trình tự, Gribskov, M. và Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; và Carillo và cộng sự, SIAM J. Toán ứng dụng. 48, 1073 (1988).
Theo một số phương án, biến thể polypeptit có thể có hoạt tính giống hoặc có hoạt tính tương tự như polypeptit đối chứng. Ngoài ra, biến thể này có thể có hoạt tính thay đổi (ví dụ, tăng hoặc giảm) so với polypeptit đối chứng. Nói chung, các biến thể của polynucleotit hoặc polypeptit cụ thể theo sáng chế sẽ có ít nhất khoảng 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nhưng ít hơn 100% độ đồng nhất trình tự với polynucleotit hoặc polypeptit tham chiếu cụ thể đó như được xác định bằng chương trình căn chỉnh trình tự và các thông số được mô tả ở đây và được những người có tay nghề cao trong lĩnh vực này biết đến. Các công cụ căn chỉnh này bao gồm các công cụ của bộ BLAST (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, và David J. Lipman (1997), “Gapped BLAST và PSI- BLAST: chương trình tìm kiếm cơ sở dữ liệu protein thế hệ mới”, Axit Nucleic Res. 25:3389-3402.) Các công cụ khác được mô tả ở đây, cụ thể là trong định nghĩa về “Danh tính”.
Các tham số mặc định trong thuật toán BLAST bao gồm, ví dụ: ngưỡng mong đợi là 10, Kích thước từ là 28, Điểm trùng khớp/không khớp 1, -2, Chi phí chênh lệch tuyến tính. Có thể áp dụng bất kỳ bộ lọc nào cũng như lựa chọn các lần lặp lại cụ thể của loài, ví dụ,Một người đàn ông khôn ngoan.
Sinh học
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bộc lộ ở đây, có thể mã hóa một hoặc nhiều sinh phẩm. Như được sử dụng ở đây, “sinh học” là phân tử dựa trên polypeptit được tạo ra bằng các phương pháp được đề xuất ở đây và có thể được sử dụng để điều trị, chữa bệnh, giảm nhẹ, ngăn ngừa hoặc chẩn đoán bệnh hoặc tình trạng bệnh lý nghiêm trọng hoặc đe dọa tính mạng. Sản phẩm sinh học, theo sáng chế bao gồm, nhưng không giới hạn ở, chất chiết xuất gây dị ứng (ví dụ để tiêm và xét nghiệm dị ứng), thành phần máu, sản phẩm trị liệu gen, mô người hoặc sản phẩm tế bào được sử dụng trong cấy ghép, vắc-xin, kháng thể đơn dòng, cytokine, tăng trưởng các yếu tố, enzyme, chất làm tan huyết khối và chất điều hòa miễn dịch, cùng nhiều chất khác.
Theo sáng chế, một hoặc nhiều chế phẩm sinh học hiện đang được bán trên thị trường hoặc đang được phát triển có thể được mã hóa bởi các polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế. Mặc dù không muốn bị ràng buộc bởi lý thuyết, nhưng người ta tin rằng việc kết hợp các polynucleotit mã hóa của sinh vật đã biết vào cấu trúc chính hoặc mmRNA theo sáng chế sẽ mang lại hiệu quả điều trị được cải thiện do ít nhất một phần là do tính đặc hiệu, độ tinh khiết và/hoặc tính chọn lọc của thiết kế xây dựng.
Kháng thể
Cấu trúc chính hoặc mmRNA bộc lộ ở đây, có thể mã hóa một hoặc nhiều kháng thể hoặc đoạn của nó. Thuật ngữ “kháng thể” bao gồm các kháng thể đơn dòng (bao gồm các kháng thể có chiều dài đầy đủ có vùng Fc của globulin miễn dịch), chế phẩm kháng thể có tính đặc hiệu ở nhiều vị trí, kháng thể đa đặc hiệu (ví dụ, kháng thể đặc hiệu kép, kháng thể không nhiễm trùng, và các phân tử chuỗi đơn), cũng như các đoạn kháng thể. Thuật ngữ “globulin miễn dịch” (Ig) được sử dụng thay thế cho “kháng thể” ở đây. Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “kháng thể đơn dòng” được dùng để chỉ kháng thể thu được từ quần thể các kháng thể gần như đồng nhất, nghĩa là, các kháng thể riêng lẻ bao gồm quần thể này giống hệt nhau ngoại trừ các đột biến có thể xảy ra tự nhiên và/hoặc các cải biến sau dịch mã (ví dụ, sự đồng phân hóa , amidations) có thể hiện diện với số lượng nhỏ. Kháng thể đơn dòng có tính đặc hiệu cao, nhắm vào một vị trí kháng nguyên duy nhất.
Các kháng thể đơn dòng ở đây đặc biệt bao gồm các kháng thể “chimeric” (globulin miễn dịch) trong đó một phần của chuỗi nặng và/hoặc chuỗi nhẹ giống hệt hoặc tương đồng với các trình tự tương ứng trong các kháng thể có nguồn gốc từ một loài cụ thể hoặc thuộc về lớp hoặc phân lớp kháng thể cụ thể, trong khi phần còn lại của (các) chuỗi giống hệt hoặc tương đồng với các trình tự tương ứng trong kháng thể có nguồn gốc từ loài khác hoặc thuộc lớp hoặc phân lớp kháng thể khác, cũng như các đoạn của kháng thể đó, miễn là chúng biểu hiện đặc tính mong muốn hoạt động sinh học. Các kháng thể khảm được quan tâm ở đây bao gồm, nhưng không giới hạn ở, các kháng thể “linh trưởng” bao gồm các trình tự liên kết kháng nguyên miền biến đổi có nguồn gốc từ động vật linh trưởng không phải người (ví dụ, Khỉ Cựu Thế giới, Khỉ vượn, v.v.) và các trình tự vùng cố định của con người.
“Đoạn kháng thể” bao gồm một phần của kháng thể nguyên vẹn, tốt hơn là phần liên kết kháng nguyên và/hoặc vùng biến đổi của kháng thể nguyên vẹn. Ví dụ về các mảnh kháng thể bao gồm Fab, Fab′, F(ab′)2và các mảnh Fv; bệnh tiểu đường; kháng thể tuyến tính; nanobody; các phân tử kháng thể chuỗi đơn và kháng thể đa đặc hiệu được hình thành từ các mảnh kháng thể.
Bất kỳ loại nào trong số năm loại globulin miễn dịch, IgA, IgD, IgE, IgG và IgM, có thể được mã hóa bởi mmRNA theo sáng chế, bao gồm các chuỗi nặng được ký hiệu lần lượt là alpha, delta, epsilon, gamma và mu. Cũng bao gồm các chuỗi polynucleotide mã hóa các phân lớp, gamma và mu. Do đó, bất kỳ phân lớp nào của kháng thể có thể được mã hóa một phần hoặc toàn bộ và bao gồm các phân lớp sau: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 và IgA2.
Theo sáng chế, một hoặc nhiều kháng thể hoặc đoạn hiện đang được bán trên thị trường hoặc đang được phát triển có thể được mã hóa bởi các polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế. Mặc dù không mong muốn bị ràng buộc bởi lý thuyết, nhưng người ta tin rằng việc kết hợp vào các cấu trúc cơ bản của sáng chế sẽ mang lại hiệu quả điều trị được cải thiện ít nhất một phần nhờ vào tính đặc hiệu, độ tinh khiết và tính chọn lọc của các thiết kế mmRNA.
Các kháng thể được mã hóa trong polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được sử dụng để điều trị các tình trạng hoặc bệnh tật trong nhiều lĩnh vực điều trị như, nhưng không giới hạn ở, máu, tim mạch, CNS, ngộ độc (bao gồm cả thuốc kháng nọc độc), da liễu, nội tiết, tiêu hóa , hình ảnh y tế, cơ xương khớp, ung thư, miễn dịch học, hô hấp, cảm giác và chống nhiễm trùng.
Theo một phương án, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bộc lộ ở đây có thể mã hóa kháng thể đơn dòng và/hoặc các biến thể của nó. Các biến thể của kháng thể cũng có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, các biến thể thay thế, thay thế axit amin bảo thủ, các biến thể chèn vào, các biến thể loại bỏ và/hoặc dẫn xuất cộng hóa trị. Theo một phương án, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA bộc lộ ở đây có thể mã hóa vùng Fc của globulin miễn dịch. Theo một phương án khác, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN có thể mã hóa vùng Fc của globulin miễn dịch biến thể. Là một ví dụ không giới hạn, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN có thể mã hóa kháng thể có vùng Fc globulin miễn dịch biến thể như được mô tả trong US Pat. Số 8.217.147 được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Vắc-xin
Cấu trúc chính hoặc mmRNA bộc lộ ở đây, có thể mã hóa một hoặc nhiều vắc xin. Như được sử dụng ở đây, “vacxin” là chế phẩm sinh học giúp cải thiện khả năng miễn dịch đối với bệnh hoặc tác nhân lây nhiễm cụ thể. Theo sáng chế, một hoặc nhiều vắc xin hiện đang được bán trên thị trường hoặc đang được phát triển có thể được mã hóa bởi các polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế. Mặc dù không mong muốn bị ràng buộc bởi lý thuyết, người ta tin rằng việc đưa vào cấu trúc chính hoặc mmRNA của sáng chế sẽ mang lại hiệu quả điều trị được cải thiện do ít nhất một phần là do tính đặc hiệu, độ tinh khiết và tính chọn lọc của thiết kế cấu trúc.
Vắc xin được mã hóa trong polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được sử dụng để điều trị các tình trạng hoặc bệnh tật trong nhiều lĩnh vực điều trị như, nhưng không giới hạn ở, tim mạch, thần kinh trung ương, da liễu, nội tiết, ung thư, miễn dịch, hô hấp và chống truyền nhiễm.
Protein hoặc Peptide trị liệu
Cấu trúc chính hoặc mmRNA bộc lộ ở đây, có thể mã hóa một hoặc nhiều peptit hoặc protein điều trị đã được xác nhận hoặc “đang thử nghiệm”.
Theo sáng chế, một hoặc nhiều protein hoặc peptit điều trị hiện đang được bán trên thị trường hoặc đang được phát triển có thể được mã hóa bởi các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế. Mặc dù không mong muốn bị ràng buộc bởi lý thuyết, người ta tin rằng việc đưa vào cấu trúc chính hoặc mmRNA của sáng chế sẽ mang lại hiệu quả điều trị được cải thiện do ít nhất một phần là do tính đặc hiệu, độ tinh khiết và tính chọn lọc của thiết kế cấu trúc.
Các protein và peptit điều trị được mã hóa trong các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được sử dụng để điều trị các tình trạng hoặc bệnh tật trong nhiều lĩnh vực trị liệu như, nhưng không giới hạn ở, máu, tim mạch, CNS, ngộ độc (kể cả thuốc kháng nọc độc), da liễu, nội tiết, di truyền, sinh dục, tiêu hóa, cơ xương, ung thư và miễn dịch, hô hấp, cảm giác và chống nhiễm trùng.
Polypeptide thâm nhập tế bào
Cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bộc lộ ở đây, có thể mã hóa một hoặc nhiều polypeptit thâm nhập tế bào. Như được sử dụng ở đây, “polypeptit thâm nhập tế bào” hoặc CPP được dùng để chỉ polypeptit mà có thể tạo điều kiện thuận lợi cho sự hấp thu các phân tử của tế bào. Polypeptit xuyên tế bào theo sáng chế có thể chứa một hoặc nhiều nhãn có thể phát hiện được. Các polypeptide có thể được dán nhãn một phần hoặc được dán nhãn toàn bộ. Polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA có thể mã hóa toàn bộ, một phần hoặc hoàn toàn nhãn có thể phát hiện được. Peptit thâm nhập tế bào cũng có thể bao gồm trình tự tín hiệu. Như được sử dụng ở đây, “trình tự tín hiệu” được dùng để chỉ trình tự các gốc axit amin được liên kết ở đầu cùng amino của protein mới sinh trong quá trình dịch mã protein. Trình tự tín hiệu có thể được sử dụng để báo hiệu sự tiết ra polypeptide thâm nhập tế bào.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN cũng có thể mã hóa protein dung hợp. Protein dung hợp có thể được tạo ra bằng cách liên kết chức năng protein tích điện với protein điều trị. Như được sử dụng ở đây, “được liên kết theo chức năng” được dùng để chỉ protein điều trị và protein tích điện được kết nối theo cách sao cho cho phép biểu hiện phức hợp khi được đưa vào tế bào. Như được sử dụng ở đây, “protein tích điện” được dùng để chỉ protein mang điện tích dương, âm hoặc tổng thể là trung tính. Tốt hơn là, protein điều trị có thể được liên kết cộng hóa trị với protein tích điện để tạo ra protein dung hợp. Tỷ lệ điện tích bề mặt trên tổng số hoặc axit amin bề mặt có thể xấp xỉ 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 hoặc 0,9.
Polypeptide thâm nhập tế bào được mã hóa bởi các polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể tạo thành phức hợp sau khi được dịch mã. Phức hợp này có thể bao gồm protein tích điện được liên kết, ví dụ: liên kết cộng hóa trị với polypeptide xuyên qua tế bào. “Protein điều trị” dùng để chỉ protein mà khi được sử dụng vào tế bào sẽ có tác dụng điều trị, chẩn đoán và/hoặc phòng bệnh và/hoặc tạo ra tác dụng sinh học và/hoặc dược lý mong muốn.
Theo một phương án, polypeptit thâm nhập tế bào có thể bao gồm vùng thứ nhất và vùng thứ hai. Vùng thứ nhất có thể bao gồm polypeptit được tăng cường. Vùng thứ hai có thể bao gồm phần liên kết với protein. Như được sử dụng ở đây, “đối tác gắn kết với protein” bao gồm, nhưng không giới hạn ở, kháng thể và đoạn chức năng của chúng, protein khung hoặc peptit. Polypeptit thâm nhập tế bào còn có thể bao gồm phần liên kết nội bào cho phần liên kết protein. Polypeptit xuyên qua tế bào có thể có khả năng được tiết ra từ tế bào nơi polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN có thể được đưa vào. Polypeptit xuyên qua tế bào cũng có thể có khả năng xuyên qua tế bào đầu tiên.
Theo một phương án khác, polypeptit xuyên qua tế bào có khả năng xuyên qua tế bào thứ hai. Ô thứ hai có thể đến từ cùng khu vực với ô đầu tiên hoặc có thể đến từ một khu vực khác. Khu vực này có thể bao gồm nhưng không giới hạn ở các mô và cơ quan. Ô thứ hai cũng có thể ở gần hoặc xa ô thứ nhất.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể mã hóa polypeptit thâm nhập tế bào mà có thể chứa phần liên kết với protein. Phần liên kết với protein có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, kháng thể, kháng thể tăng cường hoặc đoạn chức năng. Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN có thể được đưa vào tế bào nơi mà polypeptit xuyên qua tế bào bao gồm phần liên kết với protein được đưa vào.
Protein được tiết ra
Tế bào người và các tế bào nhân chuẩn khác được màng phân chia thành nhiều ngăn có chức năng riêng biệt. Mỗi khoang có màng bao quanh, hay cơ quan, chứa các protein khác nhau cần thiết cho chức năng của cơ quan đó. Tế bào sử dụng “tín hiệu sắp xếp”, là các mô típ axit amin nằm trong protein, để nhắm mục tiêu protein đến các cơ quan tế bào cụ thể.
Một loại tín hiệu sắp xếp, được gọi là chuỗi tín hiệu, peptide tín hiệu hoặc chuỗi dẫn đầu, hướng một loại protein đến một cơ quan gọi là mạng lưới nội chất (ER).
Các protein được nhắm mục tiêu đến ER theo chuỗi tín hiệu có thể được giải phóng vào không gian ngoại bào dưới dạng protein được tiết ra. Tương tự, các protein cư trú trên màng tế bào cũng có thể được tiết vào không gian ngoại bào bằng cách phân cắt protein của một “trình liên kết” giữ protein với màng. Mặc dù không mong muốn bị ràng buộc bởi lý thuyết, nhưng các phân tử theo sáng chế có thể được sử dụng để khai thác quá trình trao đổi tế bào được mô tả ở trên. Như vậy, theo một số phương án của sáng chế, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được đề xuất để biểu hiện protein được tiết ra. Các protein được tiết ra có thể được chọn từ các protein được mô tả ở đây hoặc các protein trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ, 20100255574, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, chúng có thể được sử dụng để sản xuất số lượng lớn các sản phẩm gen người có giá trị.
Protein màng huyết tương
Theo một số phương án của sáng chế, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được đề xuất để biểu hiện protein của màng sinh chất.
Protein tế bào chất hoặc tế bào chất
Theo một số phương án của sáng chế, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được đề xuất để biểu hiện protein tế bào chất hoặc protein khung tế bào.
Protein liên kết màng nội bào
Theo một số phương án của sáng chế, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được đề xuất để biểu hiện protein liên kết màng nội bào.
Protein hạt nhân
Theo một số phương án của sáng chế, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được đề xuất để biểu hiện protein nhân.
Protein liên quan đến bệnh tật ở người
Theo một số phương án của sáng chế, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được đề xuất để biểu hiện protein liên quan đến bệnh ở người.
Protein khác
Theo một số phương án của sáng chế, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được đề xuất để biểu hiện protein có chức năng điều trị hiện chưa được biết đến.
Nhắm mục tiêu các nhóm
Theo một số phương án của sáng chế, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được đề xuất để biểu hiện nhóm nhắm đích. Chúng bao gồm đối tác liên kết với protein hoặc thụ thể trên bề mặt tế bào, có chức năng nhắm mục tiêu tế bào đến một không gian mô cụ thể hoặc tương tác với một phần cụ thể, in vivo hoặc in vitro. Các phần liên kết với protein thích hợp bao gồm, nhưng không giới hạn ở, kháng thể và đoạn chức năng của chúng, protein khung hoặc peptit. Ngoài ra, polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được sử dụng để chỉ đạo quá trình tổng hợp và định vị ngoại bào của lipid, cacbohydrat hoặc các gốc sinh học hoặc phân tử sinh học khác.
Thư viện polypeptide
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN có thể được sử dụng để tạo ra các thư viện polypeptit. Các thư viện này có thể phát sinh từ việc sản xuất một quần thể polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA, mỗi thư viện chứa các thiết kế sửa đổi cấu trúc hoặc hóa học khác nhau. Theo phương án này, quần thể polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể bao gồm nhiều polypeptit được mã hóa, bao gồm nhưng không giới hạn ở kháng thể hoặc đoạn kháng thể, phần liên kết protein, protein khung, và các polypeptit khác được dạy ở đây hoặc đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này . Theo một phương án được ưu tiên, các polynucleotit là cấu trúc chính theo sáng chế, bao gồm mmRNA mà có thể thích hợp để đưa trực tiếp vào tế bào đích hoặc môi trường nuôi cấy mà sau đó có thể tổng hợp các polypeptit được mã hóa.
Theo các phương án nhất định, nhiều biến thể của protein, mỗi biến thể có (các) biến đổi axit amin khác nhau, có thể được tạo ra và thử nghiệm để xác định biến thể tốt nhất về mặt dược động học, độ ổn định, tính tương thích sinh học và/hoặc hoạt tính sinh học, hoặc đặc tính sinh lý như như mức độ biểu hiện. Một thư viện như vậy có thể chứa 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 10số 8, 109, hoặc trên 109các biến thể có thể có (bao gồm nhưng không giới hạn ở việc thay thế, loại bỏ một hoặc nhiều gốc và chèn một hoặc nhiều gốc).
Polypeptide chống vi khuẩn và chống vi-rút
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA theo sáng chế có thể được thiết kế để mã hóa trên hoặc nhiều peptit kháng khuẩn (AMP) hoặc peptit kháng vi rút (AVP). AMP và AVP đã được phân lập và mô tả từ nhiều loại động vật như, nhưng không giới hạn ở, vi sinh vật, động vật không xương sống, thực vật, động vật lưỡng cư, chim, cá và động vật có vú (Wang và cộng sự,Axit nucleic Res.2009; 37 (Vấn đề về cơ sở dữ liệu):D933-7). Ví dụ: các polypeptide kháng khuẩn được mô tả trong Cơ sở dữ liệu peptide kháng khuẩn (aps.unmc.edu/AP/main.php; Wang và cộng sự,Axit nucleic Res.2009; 37 (Vấn đề về cơ sở dữ liệu):D933-7), CAMP: Bộ sưu tập các peptide chống vi khuẩn (www.bicnirrh.res.in/antibiotic/); Thomas và cộng sự,Axit nucleic Res.2010; 38 (Vấn đề về cơ sở dữ liệu):D774-80), US Pat. Số 5.221.732, 5.447.914, 5.519.115, 5.607.914, 5.714.577, 5.734.015, 5.798.336, 5.821.224, 5.849.490, 5.856.127, 5.905.187 , 5,994,308, 5,998,374, 6,107,460, 6,191,254, 6,211,148, 6,300,489, 6,329,504, 6,399,370, 6,476,189, 6,478,825, 6,492,328, 6 ,514.701, 6.573.361, 6.573.361, 6.576.755, 6.605.698, 6.624.140, 6.638.531, 6.642.203, 6.653.280, 6.696.238, 6.727.066, 6.730.659, 6.743.598, 6 ,743.769, 6.747.007, 6.790.833, 6.794.490, 6.818.407, 6.835.536, 6.835.713, 6.838.435, 6.872.705, 6.875.907, 6.884.776, 7.847, 6.906.035, 6.911.524, 6.936.432, 7.001.924, 7.071.293, 7.078.380, 7.091.185, 7.094.759, 7.166.769, 7.244.710, 7.314.858 và 7.582.301, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào bằng cách viện dẫn .
Các polypeptit kháng vi khuẩn được mô tả ở đây có thể ngăn chặn sự dung hợp tế bào và/hoặc sự xâm nhập của vi rút bởi một hoặc nhiều vi rút có vỏ bọc (ví dụ, HIV, HCV). Ví dụ, polypeptit kháng vi khuẩn có thể bao gồm hoặc bao gồm peptit tổng hợp tương ứng với vùng, ví dụ, trình tự liên tiếp ít nhất là khoảng 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 hoặc 60 axit amin của tiểu đơn vị xuyên màng của protein vỏ virus, ví dụ: HIV-1 gp120 hoặc gp41. Trình tự axit amin và nucleotide của HIV-1 gp120 hoặc gp41 được mô tả trong Kuiken et al., (2008). “Bản tóm tắt trình tự HIV”, Phòng thí nghiệm quốc gia Los Alamos.
Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn có thể có trình tự tương đồng ít nhất khoảng 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% với trình tự protein của virus tương ứng. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn có thể có trình tự tương đồng ít nhất khoảng 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, hoặc 100% với trình tự protein của virus tương ứng.
Theo các phương án khác, polypeptit kháng vi khuẩn có thể bao gồm hoặc bao gồm peptit tổng hợp tương ứng với vùng, ví dụ, trình tự liên tiếp ít nhất khoảng 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 , 55 hoặc 60 axit amin của vùng liên kết của protein liên kết với vỏ nang. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn có thể có ít nhất khoảng 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, hoặc 100% độ tương đồng về trình tự với trình tự tương ứng của protein liên kết với vỏ.
Các polypeptit kháng vi khuẩn được mô tả ở đây có thể ngăn chặn quá trình dime hóa protease và ức chế sự phân cắt các tiền protein của virus (ví dụ, quá trình xử lý Gag-pol của HIV) thành các protein chức năng do đó ngăn chặn sự giải phóng một hoặc nhiều virus có vỏ bọc (ví dụ, HIV, HCV). Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn có thể có trình tự tương đồng ít nhất khoảng 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% với trình tự protein của virus tương ứng.
Theo các phương án khác, polypeptit kháng vi khuẩn có thể bao gồm hoặc bao gồm peptit tổng hợp tương ứng với vùng, ví dụ, trình tự liên tiếp ít nhất là khoảng 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 , 55 hoặc 60 axit amin của vùng liên kết của protein liên kết protease. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn có thể có trình tự tương đồng ít nhất khoảng 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% với trình tự tương ứng của protein liên kết proteaza.
Các polypeptit kháng vi khuẩn được mô tả ở đây có thể bao gồm polypeptit tiến hóa in vitro nhằm chống lại mầm bệnh virus.
Polypeptide kháng vi khuẩn
Polypeptide kháng khuẩn (AMP) là các peptide nhỏ có chiều dài, trình tự và cấu trúc thay đổi với hoạt tính phổ rộng chống lại nhiều loại vi sinh vật bao gồm nhưng không giới hạn ở vi khuẩn, vi rút, nấm, động vật nguyên sinh, ký sinh trùng, prion và khối u/ung thư. tế bào. (Xem, ví dụ, Zaiou, J Mol Med, 2007; 85:317; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Người ta đã chứng minh rằng AMP có phổ rộng các hoạt động tiêu diệt nhanh chóng, với mức độ kháng thuốc gây ra ở mức độ thấp và đồng thời có tác dụng chống viêm rộng.
Theo một số phương án, polypeptit kháng khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) có thể nhỏ hơn 10 kDa, ví dụ, dưới 8 kDa, 6 kDa, 4 kDa, 2 kDa, hoặc 1 kDa. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) bao gồm từ khoảng 6 đến khoảng 100 axit amin, ví dụ, từ khoảng 6 đến khoảng 75 axit amin, khoảng 6 đến khoảng 50 axit amin, khoảng 6 đến khoảng 25 axit amin, khoảng 25 đến khoảng 100 axit amin, khoảng 50 đến khoảng 100 axit amin, hoặc khoảng 75 đến khoảng 100 axit amin. Theo các phương án nhất định, polypeptit kháng vi khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) có thể bao gồm từ khoảng 15 đến khoảng 45 axit amin. Theo một số phương án, polypeptit kháng khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) về cơ bản là cation.
Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) về cơ bản có thể có tính lưỡng tính. Theo các phương án nhất định, polypeptit kháng vi khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) về cơ bản có thể là cation và lưỡng tính. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) có thể có tác dụng kìm tế bào đối với vi khuẩn Gram dương. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) có thể gây độc tế bào đối với vi khuẩn Gram dương. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) có thể có tác dụng kìm tế bào và gây độc tế bào đối với vi khuẩn Gram dương. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) có thể có tác dụng kìm tế bào đối với vi khuẩn gram âm. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) có thể gây độc tế bào đối với vi khuẩn gram âm. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) có thể có tác dụng kìm tế bào và gây độc tế bào đối với vi khuẩn Gram dương. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn có thể có tác dụng kìm tế bào đối với vi rút, nấm, động vật nguyên sinh, ký sinh trùng, prion, hoặc hỗn hợp của chúng. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn có thể gây độc tế bào đối với vi rút, nấm, động vật nguyên sinh, ký sinh trùng, prion, hoặc hỗn hợp của chúng. Theo các phương án nhất định, polypeptit kháng vi khuẩn có thể có tác dụng kìm tế bào và gây độc tế bào đối với vi rút, nấm, động vật nguyên sinh, ký sinh trùng, prion, hoặc hỗn hợp của chúng. Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn có thể gây độc tế bào đối với khối u hoặc tế bào ung thư (ví dụ, khối u ở người và/hoặc tế bào ung thư). Theo một số phương án, polypeptit kháng vi khuẩn có thể có tác dụng kìm tế bào đối với khối u hoặc tế bào ung thư (ví dụ, khối u ở người và/hoặc tế bào ung thư). Theo các phương án nhất định, polypeptit kháng vi khuẩn có thể gây độc tế bào và kìm tế bào đối với khối u hoặc tế bào ung thư (ví dụ, khối u ở người hoặc tế bào ung thư). Theo một số phương án, polypeptit kháng khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) có thể là polypeptit được tiết ra.
Theo một số phương án, polypeptit kháng khuẩn bao gồm hoặc bao gồm defensin. Defensin làm ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, α-defensin (ví dụ, bạch cầu trung tính defensin 1, defensin alpha 1, bạch cầu trung tính defensin 3, bạch cầu trung tính defensin 4, defensin 5, defensin 6), β-defensin (ví dụ, beta-defensin 1, beta-defensin 2, beta-defensin 103, beta-defensin 107, beta-defensin 110, beta-defensin 136) và 6-defensin. Theo các phương án khác, polypeptit kháng vi khuẩn bao gồm hoặc bao gồm cathelicidin (ví dụ, hCAP18).
Polypeptide chống vi-rút
Các polypeptide chống vi-rút (AVP) là các peptide nhỏ có chiều dài, trình tự và cấu trúc thay đổi với hoạt tính phổ rộng chống lại nhiều loại vi-rút. Xem, ví dụ, Zaiou, J Mol Med, 2007; 85:317. Người ta đã chứng minh rằng AVP có phổ hoạt động diệt khuẩn nhanh chóng, với mức độ kháng thuốc gây ra ở mức độ thấp và đồng thời có tác dụng chống viêm rộng. Theo một số phương án, polypeptit kháng virut là dưới 10 kDa, ví dụ, dưới 8 kDa, 6 kDa, 4 kDa, 2 kDa, hoặc 1 kDa. Theo một số phương án, polypeptit kháng virut bao gồm hoặc bao gồm từ khoảng 6 đến khoảng 100 axit amin, ví dụ, từ khoảng 6 đến khoảng 75 axit amin, khoảng 6 đến khoảng 50 axit amin, khoảng 6 đến khoảng 25 axit amin, khoảng 25 đến khoảng 100 axit amin, khoảng 50 đến khoảng 100 axit amin, hoặc khoảng 75 đến khoảng 100 axit amin. Theo các phương án nhất định, polypeptit kháng virut bao gồm hoặc bao gồm từ khoảng 15 đến khoảng 45 axit amin. Theo một số phương án, polypeptit kháng virut về cơ bản là cation. Theo một số phương án, polypeptit kháng virut về cơ bản là lưỡng tính. Theo các phương án nhất định, polypeptit kháng virut về cơ bản là cation và lưỡng tính. Theo một số phương án, polypeptit kháng virut có tác dụng kìm tế bào đối với virut. Theo một số phương án, polypeptit kháng virut có tác dụng gây độc tế bào đối với virut. Theo một số phương án, polypeptit kháng virut có tác dụng kìm tế bào và gây độc tế bào đối với virut. Theo một số phương án, polypeptit kháng virut có tác dụng kìm tế bào đối với vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh, ký sinh trùng, prion, hoặc hỗn hợp của chúng. Theo một số phương án, polypeptit kháng virut có tác dụng gây độc tế bào đối với vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh, ký sinh trùng, prion hoặc hỗn hợp của chúng. Theo các phương án nhất định, polypeptit kháng virut có tác dụng kìm tế bào và gây độc tế bào đối với vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh, ký sinh trùng, prion, hoặc hỗn hợp của chúng. Theo một số phương án, polypeptit kháng virut có tác dụng gây độc tế bào đối với khối u hoặc tế bào ung thư (ví dụ, tế bào ung thư ở người). Theo một số phương án, polypeptit kháng virut có tác dụng kìm tế bào đối với khối u hoặc tế bào ung thư (ví dụ, tế bào ung thư ở người). Theo các phương án nhất định, polypeptit kháng virut có tác dụng gây độc tế bào và kìm tế bào đối với khối u hoặc tế bào ung thư (ví dụ, tế bào ung thư ở người). Theo một số phương án, polypeptit kháng virut là polypeptit được tiết ra.
Nucleoside gây độc tế bào
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể kết hợp một hoặc nhiều nucleoside gây độc tế bào. Ví dụ, nucleoside gây độc tế bào có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmARN như ARN biến đổi hai chức năng hoặc mARN. Các chất chống ung thư nucleoside gây độc tế bào bao gồm nhưng không giới hạn ở adenosine arabinoside, cytarabine, cytosine arabinoside, 5-fluorouracil, fludarabine, floxuridine, FTORAFUR® (sự kết hợp giữa tegafur và uracil), tegafur ((RS)-5-fluoro -1-(tetrahydrofuran-2-yl)pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione), và 6-mercaptopurin.
Một số chất tương tự nucleoside gây độc tế bào đang được sử dụng trong lâm sàng hoặc là đối tượng của các thử nghiệm lâm sàng như tác nhân chống ung thư. Ví dụ về các chất tương tự như vậy bao gồm, nhưng không giới hạn ở, cytarabine, gemcitabine, troxacitabine, decitabine, tezacitabine, 2′-deoxy-2′-methylidenecytidine (DMDC), cladribine, clofarabine, 5-azacytidine, 4′-thio-aracytidine, cyclopentenylcytosine và 1-(2-C-cyano-2-deoxy-beta-D-arabino-pentofuranosyl)-cytosine. Một ví dụ khác về hợp chất như vậy là fludarabine phosphate. Các hợp chất này có thể được sử dụng một cách có hệ thống và có thể có các tác dụng phụ điển hình của tác nhân gây độc tế bào, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, ít hoặc không có tính đặc hiệu đối với tế bào khối u so với tế bào bình thường đang tăng sinh.
Một số tiền dược chất tương tự nucleoside gây độc tế bào cũng được báo cáo trong lĩnh vực kỹ thuật này. Các ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, N4-behenoyl-1-beta-D-arabinofuranosylcytosine, N4-octadecyl-1-beta-D-arabinofuranosylcytosine, N4-palmitoyl-1-(2-C-cyano-2-deoxy- beta-D-arabino-pentofuranosyl) cytosine và P-4055 (cytarabine 5′-elaidic acid ester). Nói chung, các tiền thuốc này có thể được chuyển hóa thành thuốc có hoạt tính chủ yếu ở gan và hệ tuần hoàn và thể hiện rất ít hoặc không có sự giải phóng chọn lọc thuốc có hoạt tính trong mô khối u. Ví dụ, capecitabine, một tiền chất của 5′-deoxy-5-fluorocytidine (và cuối cùng là 5-fluorouracil), được chuyển hóa cả ở gan và mô khối u. Một loạt các chất tương tự capecitabine có chứa “một gốc dễ bị thủy phân trong điều kiện sinh lý” đã được Fujiu và cộng sự tuyên bố. (Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 4.966.891) và được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Chuỗi được Fujiu mô tả bao gồm N4 alkyl và aralkyl carbamate của 5′-deoxy-5-fluorocytidine và ngụ ý rằng các hợp chất này sẽ được kích hoạt bằng cách thủy phân trong điều kiện sinh lý bình thường để cung cấp 5′-deoxy-5-fluorocytidine.
Một loạt cytarabine N4-carbamate đã được báo cáo bởi Fadl và cộng sự (Pharmazie. 1995, 50, 382-7, ở đây được đưa vào đây làm tài liệu tham khảo) trong đó các hợp chất được thiết kế để chuyển đổi thành cytarabine trong gan và huyết tương. WO 2004/041203, được đưa vào đây bằng cách tham khảo, bộc lộ các tiền dược chất của gemcitabine, trong đó một số tiền dược chất là N4-cacbamat. Các hợp chất này được thiết kế để khắc phục độc tính trên đường tiêu hóa của gemcitabine và nhằm mục đích cung cấp gemcitabine bằng cách giải phóng thủy phân ở gan và huyết tương sau khi hấp thu tiền thuốc còn nguyên vẹn từ đường tiêu hóa. Nomura và cộng sự (Bioorg Med. Chem. 2003, 11, 2453-61, được đưa vào đây bằng cách viện dẫn) đã mô tả các dẫn xuất acetal của cytosine 1-(3-C-ethynyl-β-D-ribo-pentofaranosyl) mà trong quá trình khử sinh học, tạo ra chất trung gian cần thủy phân thêm trong điều kiện axit để tạo ra hợp chất nucleoside gây độc tế bào.
Các nucleotide gây độc tế bào có thể có tác dụng hóa trị liệu cũng bao gồm, nhưng không giới hạn ở, pyrazolo [3,4-D]-pyrimidine, allopurinol, azathioprine, capecitabine, cytosine arabinoside, fluorouracil, mercaptopurine, 6-thioguanine, acyclovir, ara-adenosine, ribavirin , 7-deaza-adenosine, 7-deaza-guanosine, 6-aza-uracil, 6-aza-cytidine, thymidine ribonucleotide, 5-bromodeoxyuridine, 2-chloro-purine, và inosine, hoặc tổ hợp của chúng.
Vùng sườn: Vùng chưa được dịch (UTR)
Các vùng chưa được dịch mã (UTR) của gen được phiên mã nhưng không được dịch mã. 5′UTR bắt đầu tại vị trí bắt đầu phiên mã và tiếp tục đến codon bắt đầu nhưng không bao gồm codon bắt đầu; trong khi đó, 3′UTR bắt đầu ngay sau codon dừng và tiếp tục cho đến khi có tín hiệu kết thúc phiên mã. Ngày càng có nhiều bằng chứng về vai trò điều tiết của UTR về tính ổn định của phân tử axit nucleic và dịch mã. Các đặc điểm điều hòa của UTR có thể được kết hợp vào các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA theo sáng chế để tăng cường tính ổn định của phân tử. Các tính năng cụ thể cũng có thể được kết hợp để đảm bảo việc điều chỉnh xuống bản ghi có kiểm soát trong trường hợp chúng bị chuyển hướng sai đến các vị trí cơ quan không mong muốn.
5′ UTR và bắt đầu dịch thuật
5′UTR tự nhiên mang các đặc điểm đóng vai trò bắt đầu dịch mã. Chúng chứa đựng những dấu hiệu giống như trình tự Kozak thường được biết là có liên quan đến quá trình ribosome bắt đầu dịch mã nhiều gen. Các trình tự Kozak có CCR(A/G)CCAUGG đồng thuận, trong đó R là một purine (adenine hoặc guanine) ba bazơ ngược dòng của codon khởi đầu (AUG), theo sau là một ‘G’ khác. 5′UTR cũng được biết là tạo thành các cấu trúc thứ cấp có liên quan đến liên kết yếu tố kéo dài.
Bằng cách xử lý các đặc điểm thường được tìm thấy ở các gen được biểu hiện nhiều của các cơ quan đích cụ thể, người ta có thể tăng cường độ ổn định và khả năng sản xuất protein của các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmARN theo sáng chế. Ví dụ, việc đưa vào 5′ UTR của mRNA biểu hiện ở gan, chẳng hạn như albumin, amyloid huyết thanh A, Apolipoprotein A/B/E, transferrin, alpha fetoprotein, erythropoietin hoặc Yếu tố VIII, có thể được sử dụng để tăng cường biểu hiện axit nucleic phân tử, chẳng hạn như mmRNA, trong các dòng tế bào gan hoặc gan. Tương tự như vậy, có thể sử dụng 5′ UTR từ mRNA đặc hiệu của mô khác để cải thiện biểu hiện ở mô đó đối với cơ (MyoD, Myosin, Myoglobin, Myogenin, Herculin), cho các tế bào nội mô (Tie-1, CD36), cho các tế bào tủy ( C/EBP, AML1, G-CSF, GM-CSF, CD11b, MSR, Fr-1, i-NOS), cho bạch cầu (CD45, CD18), cho mô mỡ (CD36, GLUT4, ACRP30, adiponectin) và cho phổi tế bào biểu mô (SP-A/B/C/D).
Các chuỗi không phải UTR khác có thể được kết hợp vào các UTR 5′ (hoặc 3′ UTR). Ví dụ, các intron hoặc các phần của trình tự intron có thể được kết hợp vào các vùng xung quanh của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế. Việc kết hợp các trình tự phức tạp có thể làm tăng sản xuất protein cũng như mức độ mRNA.
3′ UTR và các phần tử phong phú AU
3′ UTR được biết là có chứa nhiều Adenosine và Uridine bên trong. Những chữ ký giàu AU này đặc biệt phổ biến ở các gen có tỷ lệ luân chuyển cao. Dựa trên các đặc điểm trình tự và đặc tính chức năng của chúng, các phần tử giàu AU (ARE) có thể được chia thành ba loại (Chen và cộng sự, 1995): Các IS loại I chứa một số bản sao phân tán của mô típ AUUUA trong các vùng giàu U. C-Myc và MyoD chứa lớp I. Các IS loại II có hai hoặc nhiều tên không phải UUAUUUA(U/A)(U/A) chồng chéo lên nhau. Các phân tử chứa loại IS này bao gồm GM-CSF và TNF-α. ARES loại III ít được xác định rõ ràng hơn. Các vùng giàu U này không chứa mô-đun AUUUA c-Jun và Myogenin là hai ví dụ được nghiên cứu kỹ lưỡng về lớp này. Hầu hết các protein liên kết với IS được biết là có tác dụng làm mất ổn định chất truyền tin, trong khi các thành viên của họ ELAV, đáng chú ý nhất là HuR, đã được ghi nhận là có tác dụng tăng tính ổn định của mRNA. HuR liên kết với IS của cả ba lớp. Việc biến đổi các vị trí liên kết đặc hiệu HuR thành 3′ UTR của các phân tử axit nucleic sẽ dẫn đến liên kết HuR và do đó, ổn định thông điệp in vivo.
Việc đưa vào, loại bỏ hoặc cải biến 3′ nguyên tố giàu UTR AU (ARE) có thể được sử dụng để điều biến độ ổn định của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế. Khi thao tác di truyền các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA cụ thể, một hoặc nhiều bản sao của IS có thể được đưa vào để làm cho các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế kém ổn định hơn và do đó làm hạn chế quá trình dịch mã và giảm khả năng sản xuất protein thu được. Tương tự như vậy, IS có thể được xác định và loại bỏ hoặc biến đổi để tăng tính ổn định nội bào và do đó làm tăng quá trình dịch mã và sản xuất protein tổng hợp. Các thử nghiệm chuyển nhiễm có thể được tiến hành trong các dòng tế bào thích hợp, sử dụng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế và việc sản xuất protein có thể được thử nghiệm tại các thời điểm khác nhau sau khi chuyển nhiễm. Ví dụ, các tế bào có thể được chuyển nhiễm bằng các phân tử kỹ thuật ARE khác nhau và bằng cách sử dụng bộ ELISA đối với protein liên quan và protein xét nghiệm được tạo ra vào lúc 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 7 ngày sau khi truyền nhiễm.
Kết hợp các trang web liên kết microRNA
microRNA (hoặc miRNA) là các RNA không mã hóa dài 19-25 nucleotide liên kết với 3′UTR của các phân tử axit nucleic và điều chỉnh giảm biểu hiện gen bằng cách làm giảm tính ổn định của phân tử axit nucleic hoặc bằng cách ức chế dịch mã. Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể bao gồm một hoặc nhiều trình tự đích microRNA, trình tự microRNA, hoặc hạt microRNA. Các trình tự như vậy có thể tương ứng với bất kỳ microRNA đã biết nào như các trình tự được dạy trong Ấn phẩm Hoa Kỳ US2005/0261218 và Ấn phẩm Hoa Kỳ US2005/0059005, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn.
Trình tự microRNA bao gồm vùng “hạt giống”, tức là trình tự trong vùng có vị trí 2-8 của microRNA trưởng thành, trình tự này có sự bổ sung hoàn hảo của Watson-Crick với trình tự đích miRNA. Hạt microRNA có thể bao gồm các vị trí 2-8 hoặc 2-7 của microRNA trưởng thành. Theo một số phương án, hạt microRNA có thể bao gồm 7 nucleotit (ví dụ, nucleotit 2-8 của microRNA trưởng thành), trong đó vị trí hạt bổ sung trong đích miRNA tương ứng được bao quanh bởi adenin (A) đối lập với vị trí microRNA 1. Trong Một số phương án, hạt microRNA có thể bao gồm 6 nucleotit (ví dụ, nucleotit 2-7 của microRNA trưởng thành), trong đó vị trí hạt bổ sung trong đích miRNA tương ứng được bao quanh bởi adenine (A) đối lập với vị trí 1 của microRNA. Xem ví dụ , Grimson A, Farh K K, Johnston W K, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel D P; Tế bào Mol. 2007 ngày 6 tháng 7; 27(1):91-105; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Các bazơ của hạt microRNA có sự bổ sung hoàn toàn với trình tự đích. Bằng cách xử lý các trình tự đích microRNA thành 3′UTR của polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA theo sáng chế, người ta có thể nhắm mục tiêu phân tử này để làm thoái hóa hoặc giảm dịch mã, miễn là microRNA được đề cập có sẵn. Quá trình này sẽ làm giảm nguy cơ ảnh hưởng ngoài mục tiêu khi phân phối phân tử axit nucleic. Việc xác định các vùng mục tiêu microRNA, microRNA cũng như các kiểu biểu hiện và vai trò của chúng trong sinh học đã được báo cáo (Bonauer và cộng sự, Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand và Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras và Rao Leukemia 2012 26:404-413 (20/12/2011 doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf et al, Cell, 2007 129:1401-1414; được đưa vào toàn bộ bằng cách tham chiếu).
Ví dụ, nếu phân tử axit nucleic là một mRNA và không có ý định được chuyển đến gan mà kết thúc ở đó, thì miR-122, một microRNA có nhiều trong gan, có thể ức chế sự biểu hiện của gen quan tâm nếu một hoặc nhiều gen quan tâm. vị trí mục tiêu của miR-122 được thiết kế thành 3′ UTR của polynucleotide, cấu trúc chính hoặc mmRNA. Việc đưa vào một hoặc nhiều vị trí liên kết cho các microRNA khác nhau có thể được thiết kế để làm giảm hơn nữa tuổi thọ, độ ổn định và quá trình dịch mã protein của polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA.
Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “vị trí microRNA” được dùng để chỉ vị trí đích microRNA hoặc vị trí nhận dạng microRNA, hoặc trình tự nucleotit bất kỳ mà microRNA liên kết hoặc liên kết với nó. Cần hiểu rằng “liên kết” có thể tuân theo các quy tắc lai Watson-Crick truyền thống hoặc có thể phản ánh bất kỳ sự liên kết ổn định nào của microRNA với trình tự đích tại hoặc liền kề với vị trí microRNA.
Ngược lại, với mục đích của các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế, các vị trí liên kết microRNA có thể được thiết kế từ các trình tự (tức là được loại bỏ khỏi) mà chúng xuất hiện một cách tự nhiên để làm tăng sự biểu hiện protein trong các mô cụ thể. Ví dụ, các vị trí gắn miR-122 có thể được loại bỏ để cải thiện biểu hiện protein ở gan. Việc điều chỉnh biểu hiện ở nhiều mô có thể được thực hiện thông qua việc đưa vào hoặc loại bỏ hoặc một hoặc một số vị trí gắn microRNA.
Ví dụ về các mô mà microRNA được biết là có vai trò điều chỉnh mRNA và do đó biểu hiện protein, bao gồm nhưng không giới hạn ở gan (miR-122), cơ (miR-133, miR-206, miR-208), tế bào nội mô (miR-208). -17-92, miR-126), tế bào dòng tủy (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), mô mỡ (cho phép -7, miR-30c), tim (miR-1d, miR-149), thận (miR-192, miR-194, miR-204) và tế bào biểu mô phổi (let-7, miR-133, miR-126 ). MicroRNA cũng có thể điều chỉnh các quá trình sinh học phức tạp như sự hình thành mạch (miR-132) (Anand và Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách tham chiếu). Trong các polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế, các vị trí gắn kết của microRNA tham gia vào các quá trình như vậy có thể được loại bỏ hoặc đưa vào, để điều chỉnh sự biểu hiện của polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc sự biểu hiện mmRNA phù hợp với các loại tế bào có liên quan về mặt sinh học hoặc vào bối cảnh của các quá trình sinh học có liên quan. Danh sách các trình tự MicroRNA, miR và vị trí liên kết miR được liệt kê trong Bảng 9 của Đơn đăng ký tạm thời số 61/753.661 của Hoa Kỳ nộp ngày 17 tháng 1 năm 2013, trong Bảng 9 của Đơn đăng ký tạm thời số 61/754.159 của Hoa Kỳ nộp ngày 18 tháng 1 năm 2013 , và trong Bảng 7 của Đơn tạm thời Hoa Kỳ số 61/758.921 nộp ngày 31 tháng 1 năm 2013, mỗi đơn trong số đó đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Các ví dụ về việc sử dụng microRNA để điều khiển sự biểu hiện gen đặc hiệu của mô hoặc bệnh được liệt kê (Getner và Naldini, Kháng nguyên mô. 2012, 80:393-403; ở đây được kết hợp toàn bộ bằng cách tham chiếu). Ngoài ra, các vị trí hạt microRNA có thể được kết hợp vào mRNA để giảm biểu hiện ở một số tế bào nhất định, mang lại sự cải thiện về mặt sinh học. Một ví dụ về điều này là việc kết hợp các vị trí miR-142 vào vectơ lentivirus biểu hiện UGT1A1. Sự hiện diện của các vị trí hạt miR-142 làm giảm biểu hiện trong các tế bào tạo máu và do đó làm giảm biểu hiện trong các tế bào trình diện kháng nguyên, dẫn đến không có phản ứng miễn dịch chống lại UGT1A1 được biểu hiện bằng virus (Schmitt và cộng sự, Gastroenterology 2010; 139: 999-1007; Gonzalez-Asequinolaza và cộng sự. Khoa tiêu hóa 2010, 139:726-729; cả hai đều được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ). Việc kết hợp các vị trí miR-142 vào mRNA đã được sửa đổi không chỉ có thể làm giảm sự biểu hiện của protein được mã hóa trong các tế bào tạo máu mà còn có thể làm giảm hoặc loại bỏ các phản ứng miễn dịch đối với protein được mã hóa bởi mRNA. Việc kết hợp các vị trí hạt miR-142 (một hoặc nhiều) vào mRNA sẽ rất quan trọng trong trường hợp điều trị bệnh nhân bị thiếu hụt protein hoàn toàn (UGT1A1 loại I, bệnh nhân thiếu LDLR, bệnh nhân Pompe âm tính CRIM, v.v.).
Cuối cùng, thông qua sự hiểu biết về các kiểu biểu hiện của microRNA trong các loại tế bào khác nhau, polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA có thể được thiết kế để biểu hiện mục tiêu hơn trong các loại tế bào cụ thể hoặc chỉ trong các điều kiện sinh học cụ thể. Thông qua việc đưa vào các vị trí liên kết microRNA đặc hiệu của mô, các polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA có thể được thiết kế sao cho tối ưu cho sự biểu hiện protein trong mô hoặc trong bối cảnh điều kiện sinh học.
Các thí nghiệm chuyển nhiễm có thể được tiến hành trong các dòng tế bào liên quan, sử dụng các polynucleotit được thao tác di truyền, các cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA và việc sản xuất protein có thể được thử nghiệm tại các thời điểm khác nhau sau khi chuyển nhiễm. Ví dụ, các tế bào có thể được chuyển nhiễm bằng các polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA khác nhau gắn với microRNA khác nhau và bằng cách sử dụng bộ ELISA đối với protein liên quan và protein thử nghiệm được tạo ra lúc 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 72 giờ. 7 ngày sau khi truyền máu. Các thí nghiệm in vivo cũng có thể được tiến hành bằng cách sử dụng các phân tử được thiết kế tại chỗ gắn với microRNA để kiểm tra những thay đổi trong sự biểu hiện đặc hiệu mô của các polynucleotide được tạo thành, các cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA.
Giới hạn 5′
Cấu trúc đầu 5’ của mRNA tham gia vào quá trình xuất hạt nhân, tăng tính ổn định của mRNA và liên kết với Protein liên kết nắp mRNA (CBP), chất này chịu trách nhiệm đảm bảo sự ổn định của mRNA trong tế bào và khả năng dịch mã thông qua sự liên kết của CBP với poly(A) protein liên kết để hình thành các loại mRNA tuần hoàn trưởng thành. Nắp này còn hỗ trợ thêm cho việc loại bỏ các intron đầu gần 5’ trong quá trình ghép nối mRNA.
Các phân tử mARN nội sinh có thể có đầu 5′ tạo ra liên kết 5′-ppp-5′-triphosphat giữa phần gốc nắp guanosine tận cùng và nucleotit cảm giác được phiên mã ở đầu 5′ của phân tử mARN. Nắp 5′-guanylat này sau đó có thể được metyl hóa để tạo ra dư lượng N7-metyl-guanylat. Đường ribose của nucleotit phiên mã ở đầu cuối và/hoặc đầu cuối của đầu 5’ của mARN có thể tùy ý cũng được 2′-O-metyl hóa. Sự phân hủy 5′ thông qua quá trình thủy phân và phân cắt cấu trúc nắp guanylat có thể nhắm mục tiêu phân tử axit nucleic, chẳng hạn như phân tử mARN, để phân hủy.
Các cải biến đối với polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmARN theo sáng chế có thể tạo ra cấu trúc nắp không thủy phân được để ngăn ngừa sự phân rã và do đó làm tăng thời gian bán hủy của mARN. Bởi vì quá trình thủy phân cấu trúc nắp đòi hỏi phải phân cắt các liên kết photphorodiester 5′-ppp-5’ nên các nucleotide biến tính có thể được sử dụng trong phản ứng tạo nắp. Ví dụ, Enzyme đóng nắp Vaccinia từ New England Biolabs (Ipswich, MA) có thể được sử dụng với các nucleotide α-thio-guanosine theo hướng dẫn của nhà sản xuất để tạo liên kết photphorothioate trong nắp 5′-ppp-5′. Các nucleotit guanosin biến đổi bổ sung có thể được sử dụng như các nucleotit α-metyl-phosphonat và seleno-photphat.
Các cải biến bổ sung bao gồm, nhưng không giới hạn ở, quá trình methyl hóa 2′-O-metyl đường ribose của nucleotit đầu 5′ và/hoặc nucleotide đầu 5′ của mARN (như đã đề cập ở trên) trên nhóm 2′-hydroxyl của vòng đường. Nhiều cấu trúc nắp 5′ riêng biệt có thể được sử dụng để tạo ra nắp 5′ của phân tử axit nucleic, chẳng hạn như phân tử mARN.
Các chất tương tự nắp, mà ở đây còn được gọi là các chất tương tự nắp tổng hợp, các chất tương tự nắp hóa học, hoặc các chất tương tự nắp cấu trúc hoặc chức năng, khác với các chất tương tự nắp 5′ tự nhiên (tức là nội sinh, dạng hoang dã hoặc sinh lý) trong cấu trúc hóa học của chúng, trong khi vẫn giữ chức năng nắp. Các chất tương tự nắp có thể được tổng hợp về mặt hóa học (tức là không có enzym) hoặc được tổng hợp bằng enzym và/hoặc liên kết với phân tử axit nucleic.
Ví dụ, nắp Tương tự nắp chống đảo ngược (ARCA) chứa hai guanin được liên kết bởi nhóm 5′-5′-triphosphat, trong đó một guanin chứa nhóm metyl N7 cũng như nhóm 3′-O-metyl (tức là, N7,3′-O-dimethyl-guanosine-5′-triphosphate-5′-guanosine (m7G-3′mppp-G; tương đương có thể được ký hiệu là 3′ O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G). Nguyên tử 3′-O của guanine còn lại, chưa biến đổi, sẽ được liên kết với nucleotide đầu 5′ của phân tử axit nucleic có nắp (ví dụ: mRNA hoặc mmRNA). Guanine N7- và 3′-O-metlyat hóa cung cấp phân tử cuối cùng của phân tử axit nucleic có nắp (ví dụ, mARN hoặc mmARN).
Một nắp làm ví dụ khác là mCAP, tương tự như ARCA nhưng có nhóm 2′-O-methyl trên guanosine (tức là, N7,2′-O-dimethyl-guanosine-5′-triphosphate-5′-guanosine, m7Gm-ppp-G).
Trong khi các chất tương tự nắp cho phép đóng nắp đồng thời một phân tử axit nucleic trong phản ứng phiên mã in vitro, thì có tới 20% bản phiên mã có thể vẫn không bị đóng nắp. Điều này, cũng như sự khác biệt về cấu trúc của chất tương tự nắp với cấu trúc axit nucleic 5′ nội sinh được tạo ra bởi bộ máy phiên mã tế bào nội sinh, có thể dẫn đến giảm khả năng dịch mã và giảm độ ổn định của tế bào.
Polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmARN theo sáng chế cũng có thể được gắn giới hạn sau phiên mã bằng cách sử dụng enzym để tạo ra cấu trúc nắp 5′ đích thực hơn. Như được sử dụng ở đây, cụm từ “xác thực hơn” dùng để chỉ đặc điểm gần giống hoặc bắt chước, về mặt cấu trúc hoặc chức năng, một đặc điểm nội sinh hoặc loại hoang dã. Nghĩa là, đặc điểm “xác thực hơn” đại diện tốt hơn cho chức năng và/hoặc cấu trúc tế bào nội sinh, kiểu hoang dã, tự nhiên hoặc sinh lý so với các đặc điểm tổng hợp hoặc chất tương tự, v.v., của tình trạng kỹ thuật đã biết, hoặc vượt trội hơn đặc tính tương ứng đặc điểm nội sinh, kiểu hoang dã, tự nhiên hoặc sinh lý ở một hoặc nhiều khía cạnh. Các ví dụ không giới hạn về cấu trúc 5′cap xác thực hơn theo sáng chế là những cấu trúc, trong số những thứ khác, đã tăng cường khả năng liên kết của protein liên kết nắp, tăng thời gian bán hủy, giảm tính nhạy cảm với 5’ endonuclease và/hoặc giảm sự phân hủy 5’, như so với cấu trúc 5'nắp tổng hợp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này (hoặc với cấu trúc 5'nắp kiểu hoang dã, tự nhiên hoặc sinh lý). Ví dụ, Enzym giới hạn virus Vaccinia tái tổ hợp và enzyme 2′-O-methyltransferase tái tổ hợp có thể tạo ra liên kết chính tắc 5′-5′-triphosphate giữa nucleotit đầu 5′ của mARN và nucleotit nắp guanin trong đó nắp guanin chứa một Quá trình methyl hóa N7 và nucleotide đầu 5′ của mRNA chứa 2′-O-methyl. Cấu trúc như vậy được gọi là cấu trúc Cap1. Giới hạn này mang lại khả năng dịch mã và độ ổn định của tế bào cao hơn và làm giảm hoạt hóa của các xytokin gây viêm tế bào, so với, ví dụ, với các cấu trúc tương tự 5'cap khác đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Cấu trúc nắp bao gồm, nhưng không giới hạn ở, 7mG(5′)ppp(5′)N,pN2p (cap 0), 7mG(5′)ppp(5′)N1mpNp (cap 1) và 7mG(5′) -ppp(5′)N1mpN2mp (giới hạn 2).
Bởi vì các polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA có thể bị giới hạn sau quá trình phiên mã và do quá trình này hiệu quả hơn nên gần 100% các polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA có thể bị giới hạn. Điều này trái ngược với ˜80% khi chất tương tự nắp được liên kết với mRNA trong quá trình phản ứng phiên mã in vitro.
Theo sáng chế, nắp đầu cuối 5’ có thể bao gồm các nắp nội sinh hoặc các nắp tương tự. Theo sáng chế, nắp đầu cực 5’ có thể bao gồm chất tương tự guanin. Các chất tương tự guanine hữu ích bao gồm, nhưng không giới hạn ở inosine, N1-methyl-guanosine, 2′fluoro-guanosine, 7-deaza-guanosine, 8-oxo-guanosine, 2-amino-guanosine, LNA-guanosine, và 2- azido-guanosine.
Trình tự virus
Các trình tự vi rút bổ sung, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn, trình tự tăng cường dịch mã của vi rút lùn vàng lúa mạch (BYDV-PAV), vi rút retrovirus cừu Jaagsiekte (JSRV) và/hoặc vi rút khối u mũi Enzootic (Xem ví dụ: International Pub. No WO2012129648; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn) có thể được thao tác di truyền và gắn vào 3′ UTR của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế và có thể kích thích quá trình dịch mã cấu trúc in vitro và in vivo. Các thí nghiệm truyền nhiễm có thể được tiến hành trên các dòng tế bào liên quan và việc sản xuất protein có thể được phân tích bằng ELISA vào lúc 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và ngày thứ 7 sau khi truyền máu.
Trình tự IRES
Ngoài ra, với điều kiện là các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmARN mà có thể chứa vị trí xâm nhập ribosome bên trong (IRES). Lần đầu tiên được xác định là RNA của virus Picorna, IRES đóng vai trò quan trọng trong việc bắt đầu tổng hợp protein khi không có cấu trúc nắp 5’. IRES có thể đóng vai trò là vị trí liên kết ribosome duy nhất hoặc có thể đóng vai trò là một trong nhiều vị trí liên kết ribosome của mRNA. Polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA chứa nhiều hơn một vị trí liên kết chức năng với ribosome có thể mã hóa một số peptit hoặc polypeptide được dịch mã độc lập bởi ribosome (“phân tử axit nucleic đa cistron”). Khi các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN được cung cấp IRES, thì tùy chọn bổ sung thêm là vùng có thể dịch mã thứ hai. Ví dụ về các trình tự IRES có thể được sử dụng theo sáng chế bao gồm nhưng không giới hạn, các trình tự từ picornavirus (ví dụ FMDV), vi rút gây hại (CFFV), vi rút bại liệt (PV), vi rút viêm não cơ tim (ECMV), vi rút gây bệnh lở mồm long móng ( FMDV), virus viêm gan C (HCV), virus sốt lợn cổ điển (CSFV), virus gây bệnh bạch cầu ở chuột (MLV), virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ (SIV) hoặc virus gây tê liệt dế (CrPV).
Đuôi Poly-A
Trong quá trình xử lý RNA, một chuỗi dài các nucleotide adenine (đuôi poly-A) có thể được thêm vào một polynucleotide như phân tử mRNA để tăng tính ổn định. Ngay sau khi phiên mã, đầu 3’ của bản phiên mã có thể bị cắt để giải phóng 3’ hydroxyl. Sau đó poly-A polymerase thêm một chuỗi nucleotide adenine vào RNA. Quá trình này, được gọi là polyadenylation, thêm một đuôi poly-A có thể dài từ khoảng 100 đến 250 gốc chẳng hạn.
Đã phát hiện ra rằng độ dài đuôi poly-A độc nhất mang lại những lợi ích nhất định cho các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế.
Nói chung, chiều dài của đuôi poly-A theo sáng chế dài hơn 30 nucleotit. Theo một phương án khác, đuôi poly-A có chiều dài lớn hơn 35 nucleotit (ví dụ, ít nhất hoặc lớn hơn khoảng 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160 , 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 0, 1.900, 2.000, 2.500 và 3.000 nucleotide). Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm từ khoảng 30 đến khoảng 3.000 nucleotit (ví dụ, từ 30 đến 50, từ 30 đến 100, từ 30 đến 250, từ 30 đến 500, từ 30 đến 750, từ 30 đến 1.000, từ 30 đến 1.500, từ 30 đến 2.000, từ 30 đến 2.500, từ 50 đến 1.00, từ 50 đến 250, từ 50 đến 500, từ 50 đến 750, từ 50 đến 1.000, từ 50 đến 1.500, từ 50 đến 2.000, từ 50 đến 2.500, từ 50 đến 3.000, từ 100 đến 500, từ 100 đến 750, từ 100 đến 1.000, từ 100 đến 1.500, từ 100 đến 2.000, từ 100 đến 2.500, từ 100 đến 3.000, từ 50 0 đến 750, từ 500 đến 1.000, từ 500 đến 1.500, từ 500 đến 2.000, từ 500 đến 2.500, từ 500 đến 3.000, từ 1.000 đến 1.500, từ 1.000 đến 2.000, từ 1.000 đến 2.500, từ 1.000 đến 3.000, từ 1.500 đến 2.000, từ 1.500 đến 2.500, từ 1.500 đến 3.000, từ 2.000 đến 3.000, từ 2.000 đến 2.500 và từ 2.500 đến 3.000).
Theo một phương án, đuôi poly-A được thiết kế tương ứng với chiều dài của tổng thể các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN. Thiết kế này có thể dựa trên độ dài của vùng mã hóa, độ dài của một tính năng hoặc vùng cụ thể (như vùng thứ nhất hoặc vùng sườn), hoặc dựa trên độ dài của sản phẩm cuối cùng được biểu hiện từ các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA.
Trong trường hợp này, đuôi poly-A có thể có chiều dài lớn hơn 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 hoặc 100% so với chiều dài của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN hoặc đặc điểm của chúng. Đuôi poly-A cũng có thể được thiết kế dưới dạng một phần của polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA mà nó thuộc về. Trong ngữ cảnh này, đuôi poly-A có thể bằng 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 hoặc 90% hoặc hơn tổng chiều dài của cấu trúc hoặc tổng chiều dài của cấu trúc trừ đi poly- Cái đuôi. Hơn nữa, các vị trí liên kết được thao tác di truyền và sự liên hợp của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA đối với protein liên kết Poly-A có thể tăng cường sự biểu hiện.
Ngoài ra, nhiều polynucleotide riêng biệt, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA có thể được liên kết với nhau với PABP (protein liên kết Poly-A) thông qua đầu 3′ bằng cách sử dụng các nucleotide biến đổi ở đầu 3′ của đuôi poly-A. Các thí nghiệm truyền nhiễm có thể được tiến hành trên các dòng tế bào liên quan và việc sản xuất protein có thể được phân tích bằng ELISA vào lúc 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và ngày thứ 7 sau khi truyền máu.
Theo một phương án, cấu trúc sơ cấp polynucleotit theo sáng chế được thiết kế để bao gồm Bộ tứ polyA-G. Bộ tứ G là một mảng liên kết hydro tuần hoàn gồm bốn nucleotide guanine có thể được hình thành bởi các trình tự giàu G trong cả DNA và RNA. Theo phương án này, bộ tứ G được kết hợp ở cuối đuôi poly-A. Cấu trúc mmRNA thu được được thử nghiệm về độ ổn định, khả năng sản xuất protein và các thông số khác bao gồm thời gian bán hủy ở các thời điểm khác nhau. Người ta đã phát hiện ra rằng bộ tứ polyA-G mang lại khả năng sản xuất protein tương đương với ít nhất 75% lượng protein được thấy khi chỉ sử dụng đuôi poly-A gồm 120 nucleotide.
Định lượng
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được định lượng trong các exosome có nguồn gốc từ một hoặc nhiều dịch cơ thể. Như được sử dụng ở đây “dịch cơ thể” bao gồm máu ngoại vi, huyết thanh, huyết tương, cổ trướng, nước tiểu, dịch não tủy (CSF), đờm, nước bọt, tủy xương, dịch khớp, thủy dịch, nước ối, ráy tai, sữa mẹ, dịch rửa phế quản phế nang, tinh dịch, dịch tuyến tiền liệt, dịch Cowper hoặc dịch trước xuất tinh, mồ hôi, phân, tóc, nước mắt, dịch nang, dịch màng phổi và phúc mạc, dịch màng ngoài tim, bạch huyết, nhũ trấp, dưỡng trấp, mật, dịch kẽ, kinh nguyệt, mủ, bã nhờn, chất nôn, dịch tiết âm đạo, dịch tiết niêm mạc, nước trong phân, dịch tụy, dịch rửa từ xoang, dịch hút phế quản phổi, dịch khoang blastocyl và máu dây rốn. Ngoài ra, exosome có thể được lấy từ cơ quan được chọn từ nhóm bao gồm phổi, tim, tuyến tụy, dạ dày, ruột, bàng quang, thận, buồng trứng, tinh hoàn, da, đại tràng, vú, tuyến tiền liệt, não, thực quản, gan và nhau thai.
Trong phương pháp định lượng, một mẫu không quá 2 mL được lấy từ đối tượng và các exosome được phân lập bằng sắc ký loại trừ kích thước, ly tâm gradient mật độ, ly tâm vi phân, siêu lọc màng nano, thu giữ chất hấp thụ miễn dịch, tinh chế ái lực, tách vi lỏng, hoặc kết hợp chúng. Trong phân tích, mức hoặc nồng độ của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể là mức biểu hiện, sự có mặt, sự vắng mặt, sự cắt bớt hoặc sự thay đổi của cấu trúc được sử dụng. Sẽ có lợi hơn nếu so sánh mức độ với một hoặc nhiều kiểu hình lâm sàng hoặc với xét nghiệm dấu ấn sinh học bệnh ở người. Thử nghiệm này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các đầu dò đặc hiệu, phương pháp đo tế bào, qRT-PCR, PCR thời gian thực, PCR, phương pháp đo tế bào theo dòng chảy, điện di, phép đo khối phổ hoặc kết hợp các phương pháp đó trong khi các exosome có thể được phân lập bằng các phương pháp hóa mô miễn dịch như xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme ( phương pháp ELISA). Exosome cũng có thể được phân lập bằng sắc ký loại trừ kích thước, ly tâm gradient mật độ, ly tâm vi phân, siêu lọc màng nano, thu giữ chất hấp thụ miễn dịch, tinh chế ái lực, tách vi lỏng, hoặc kết hợp chúng.
Những phương pháp này mang lại cho người nghiên cứu khả năng giám sát theo thời gian thực mức độ polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA còn lại hoặc được phân phối. Điều này có thể thực hiện được vì các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA theo sáng chế khác với các dạng nội sinh do các biến đổi về cấu trúc hoặc hóa học.
II. Thiết kế và tổng hợp mmRNA
Polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA để sử dụng theo sáng chế có thể được điều chế theo kỹ thuật sẵn có bất kỳ bao gồm, nhưng không giới hạn ở tổng hợp hóa học, tổng hợp bằng enzym, thường được gọi là phiên mã in vitro (IVT) hoặc phân cắt bằng enzym hoặc hóa học của một tiền chất dài hơn, v.v.. Các phương pháp tổng hợp ARN đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này (xem, ví dụ, Gait, M. J. (ed.)Tổng hợp oligonucleotide: một cách tiếp cận thực tế, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: TRL Press, 1984; và Herdewijn, P. (ed.)Tổng hợp oligonucleotide: phương pháp và ứng dụng, Phương pháp sinh học phân tử, v. 288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005; cả hai đều được đưa vào đây bằng cách viện dẫn).
Quy trình thiết kế và tổng hợp các cấu trúc sơ cấp theo sáng chế thường bao gồm các bước tạo cấu trúc gen, sản xuất mARN (có hoặc không có cải biến) và tinh chế. Trong phương pháp tổng hợp enzym, trình tự polynucleotit đích mã hóa polypeptit quan tâm trước tiên được chọn để kết hợp vào vectơ mà vectơ này sẽ được khuếch đại để tạo ra mẫu cADN. Tùy ý, trình tự polynucleotit đích và/hoặc trình tự sườn bất kỳ có thể được tối ưu hóa codon. Mẫu cDNA sau đó được sử dụng để tạo ra mRNA thông qua phiên mã in vitro (IVT). Sau khi sản xuất, mRNA có thể trải qua quá trình tinh chế và làm sạch. Các bước được cung cấp chi tiết hơn dưới đây.
Xây dựng gen
Bước xây dựng gen có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở việc tổng hợp gen, khuếch đại vectơ, tinh chế plasmid, tuyến tính hóa và làm sạch plasmid cũng như tổng hợp và làm sạch mẫu cDNA.
Tổng hợp gen
Sau khi polypeptit quan tâm hoặc mục tiêu được chọn để sản xuất, cấu trúc bậc một sẽ được thiết kế. Trong cấu trúc bậc một, vùng thứ nhất gồm các nucleoside liên kết mã hóa polypeptit quan tâm có thể được tạo ra bằng cách sử dụng khung đọc mở (ORF) của bản phiên mã axit nucleic (DNA hoặc RNA) đã chọn. ORF có thể bao gồm ORF kiểu hoang dã, dạng đồng phân, biến thể hoặc một đoạn của nó. Như được sử dụng ở đây, “khung đọc mở” hoặc “ORF” được dùng để chỉ trình tự axit nucleic (DNA hoặc RNA) có khả năng mã hóa polypeptit cần quan tâm. ORF thường bắt đầu bằng codon khởi đầu, ATG và kết thúc bằng codon hoặc tín hiệu vô nghĩa hoặc kết thúc.
Hơn nữa, trình tự nucleotit của vùng thứ nhất có thể được tối ưu hóa codon. Các phương pháp tối ưu hóa codon đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này và có thể hữu ích trong nỗ lực đạt được một hoặc nhiều mục tiêu. Các mục tiêu này bao gồm để phù hợp với tần số codon trong sinh vật đích và vật chủ để đảm bảo hàm lượng GC thiên vị, gấp thích hợp để tăng tính ổn định của mRNA hoặc giảm cấu trúc thứ cấp, giảm thiểu các codon lặp lại song song hoặc chạy cơ sở có thể làm giảm quá trình xây dựng hoặc biểu hiện gen, tùy chỉnh các vùng kiểm soát phiên mã và dịch mã , chèn hoặc xóa trình tự trao đổi protein, xóa/thêm vị trí sửa đổi sau dịch mã trong protein được mã hóa (ví dụ: vị trí glycosyl hóa), thêm, xóa hoặc xáo trộn các miền protein, chèn hoặc xóa vị trí hạn chế, sửa đổi vị trí liên kết ribosome và vị trí phân hủy mRNA, để điều chỉnh quá trình dịch mã. để cho phép các miền khác nhau của protein gấp lại đúng cách hoặc giảm hoặc loại bỏ các cấu trúc thứ cấp có vấn đề trong mRNA. Các công cụ, thuật toán và dịch vụ tối ưu hóa codon đã được biết đến trong lĩnh vực này, các ví dụ không giới hạn bao gồm các dịch vụ từ GeneArt (Life Technologies), DNA2.0 (Menlo Park CA) và/hoặc các phương pháp độc quyền. Theo một phương án, trình tự ORF được tối ưu hóa bằng thuật toán tối ưu hóa. Các tùy chọn codon cho từng axit amin được đưa ra trong Bảng 1.
Các đặc điểm, mà có thể được coi là có lợi theo một số phương án của sáng chế, có thể được mã hóa bởi cấu trúc chính và có thể nằm ở bên cạnh ORF như vùng xung quanh thứ nhất hoặc thứ hai. Các vùng sườn có thể được tích hợp vào cấu trúc chính trước và/hoặc sau khi tối ưu hóa ORF. Cấu trúc sơ cấp không bắt buộc phải chứa cả vùng xung quanh 5′ và 3′. Ví dụ về các tính năng như vậy bao gồm, nhưng không giới hạn ở các vùng chưa được dịch (UTR), trình tự Kozak, trình tự oligo(dT) và các thẻ có thể phát hiện được và có thể bao gồm nhiều vị trí nhân bản có thể có khả năng nhận dạng XbaI.
Theo một số phương án, 5′ UTR và/hoặc 3′ UTR có thể được đề xuất làm vùng sườn. Nhiều UTR 5’ hoặc 3’ có thể được bao gồm trong các vùng sườn và có thể giống nhau hoặc có trình tự khác nhau. Bất kỳ phần nào của các vùng sườn, kể cả không có, có thể được tối ưu hóa codon và bất kỳ phần nào có thể chứa một hoặc nhiều biến đổi cấu trúc hoặc hóa học khác nhau một cách độc lập, trước và/hoặc sau khi tối ưu hóa codon. Sự kết hợp của các đặc điểm có thể được bao gồm trong vùng sườn thứ nhất và thứ hai và có thể được chứa trong các đặc điểm khác. Ví dụ, ORF có thể được bao quanh bởi một UTR 5′ có thể chứa tín hiệu khởi đầu tịnh tiến Kozak mạnh và/hoặc một UTR 3′ có thể bao gồm một chuỗi oligo(dT) để bổ sung theo khuôn mẫu của đuôi poly-A. 5′UTR có thể bao gồm đoạn polynucleotit thứ nhất và đoạn polynucleotit thứ hai từ các gen giống nhau và/hoặc khác nhau như 5′UTR được mô tả trong Công bố đơn xin cấp bằng sáng chế Hoa Kỳ số 20100293625, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Bảng 2 và 3 cung cấp danh sách các UTR ví dụ có thể được sử dụng trong cấu trúc chính của sáng chế như các vùng sườn. Trong Bảng 2 là danh sách vùng 5′ chưa được dịch mã của sáng chế. Các biến thể của 5′ UTR có thể được sử dụng trong đó một hoặc nhiều nucleotit được thêm vào hoặc loại bỏ ở đầu cuối, bao gồm A, T, C hoặc G.
Trong Bảng 3 là danh sách đại diện của các vùng 3′ chưa được dịch mã của sáng chế. Các biến thể của 3′ UTR có thể được sử dụng trong đó một hoặc nhiều nucleotit được thêm vào hoặc loại bỏ ở đầu cuối, bao gồm A, T, C hoặc G.
Cần hiểu rằng những điều được liệt kê trong các bảng trước đây là các ví dụ và rằng bất kỳ UTR nào từ gen bất kỳ đều có thể được kết hợp vào vùng sườn thứ nhất hoặc thứ hai tương ứng của cấu trúc sơ cấp. Hơn nữa, nhiều UTR kiểu hoang dã của bất kỳ gen đã biết nào có thể được sử dụng. Nó cũng nằm trong phạm vi của sáng chế để đề xuất các UTR nhân tạo không phải là các biến thể của gen kiểu dại. Các UTR này hoặc các phần của chúng có thể được đặt theo cùng hướng như trong bản ghi mà chúng được chọn hoặc có thể được thay đổi về hướng hoặc vị trí. Do đó, 5′ hoặc 3′ UTR có thể được đảo ngược, rút ngắn, kéo dài, tạo thành hình khảm với một hoặc nhiều 5′ UTR hoặc 3′ UTR khác. Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “được thay đổi” vì nó liên quan đến trình tự UTR, có nghĩa là UTR đã được thay đổi theo cách nào đó liên quan đến trình tự tham chiếu. Ví dụ: UTR 3′ hoặc 5′ có thể bị thay đổi so với loại hoang dã hoặc UTR nguyên gốc do thay đổi hướng hoặc vị trí như đã dạy ở trên hoặc có thể bị thay đổi bằng cách đưa vào các nucleotide bổ sung, loại bỏ các nucleotide, hoán đổi hoặc chuyển vị của nucleotide. Bất kỳ thay đổi nào trong số này tạo ra UTR “bị thay đổi” (dù là 3′ hay 5′) bao gồm một UTR biến thể.
Theo một phương án, UTR gấp đôi, gấp ba hoặc gấp bốn lần như UTR 5′ hoặc 3′ có thể được sử dụng. Như được sử dụng ở đây, UTR “kép” là UTR trong đó hai bản sao của cùng một UTR được mã hóa thành chuỗi hoặc gần như thành chuỗi. Ví dụ, beta-globin 3′ UTR kép có thể được sử dụng như được mô tả trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20100129877, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn.
Việc có các UTR theo khuôn mẫu cũng nằm trong phạm vi của sáng chế. Như được sử dụng ở đây “UTR theo mẫu” là các UTR phản ánh mẫu lặp lại hoặc xen kẽ, chẳng hạn như ABABAB hoặc AABBAABBAABB hoặc ABCABCABC hoặc các biến thể của chúng được lặp lại một lần, hai lần hoặc nhiều hơn 3 lần. Trong các mẫu này, mỗi chữ cái A, B hoặc C đại diện cho một UTR khác nhau ở cấp độ nucleotide.
Theo một phương án, các vùng sườn được chọn từ họ bản phiên mã có các protein có chung chức năng, cấu trúc, đặc điểm chung. Ví dụ, các polypeptit quan tâm có thể thuộc họ protein được biểu hiện trong tế bào, mô cụ thể hoặc tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển. Các UTR từ bất kỳ gen nào trong số này có thể được hoán đổi cho bất kỳ UTR nào khác của cùng họ protein hoặc khác họ để tạo ra bản phiên mã chính chimeric mới. Như được sử dụng ở đây, “họ protein” được sử dụng theo nghĩa rộng nhất để chỉ nhóm gồm hai hoặc nhiều polypeptit được quan tâm có chung ít nhất một chức năng, cấu trúc, đặc điểm, vị trí, nguồn gốc, hoặc kiểu biểu hiện.
Sau khi tối ưu hóa (nếu muốn), các thành phần cấu trúc chính được hoàn nguyên và biến đổi thành một vectơ chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, plasmid, virus, cosmid và nhiễm sắc thể nhân tạo. Ví dụ, cấu trúc được tối ưu hóa có thể được hoàn nguyên và chuyển thành dạng có khả năng về mặt hóa họcE coli, men,bào tử thần kinh, bắp,ruồi giấm, v.v. trong đó các cấu trúc nhiễm sắc thể hoặc giống plasmid có khả năng sao chép cao xảy ra bằng các phương pháp được mô tả ở đây.
Vùng chưa được dịch cũng có thể bao gồm các phần tử tăng cường dịch thuật (TEE). Là một ví dụ không giới hạn, TEE có thể bao gồm những nội dung được mô tả trong Đơn đăng ký Hoa Kỳ số 20090226470, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn và những nội dung đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này.
Dừng codon
Theo một phương án, cấu trúc cơ bản theo sáng chế có thể bao gồm ít nhất hai codon dừng trước vùng 3’ chưa được dịch mã (UTR). Codon dừng có thể được chọn từ TGA, TAA và TAG. Theo một phương án, cấu trúc chính của sáng chế bao gồm codon dừng TGA và một codon dừng bổ sung. Theo một phương án khác, codon dừng bổ sung có thể là TAA. Theo một phương án khác, cấu trúc cơ bản của sáng chế bao gồm ba codon dừng.
Khuếch đại vectơ
Sau đó, vectơ chứa cấu trúc sơ cấp được khuếch đại và plasmit được phân lập và tinh chế bằng cách sử dụng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, chế phẩm maxi sử dụng Bộ Invitrogen PURELINK™ HiPure Maxiprep Kit (Carlsbad, CA).
Tuyến tính hóa plasmid
Sau đó, plasmit có thể được tuyến tính hóa bằng cách sử dụng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này như, nhưng không giới hạn ở, việc sử dụng enzym giới hạn và chất đệm. Phản ứng tuyến tính hóa có thể được tinh chế bằng các phương pháp, chẳng hạn như PURELINK™ PCR Micro Kit (Carlsbad, CA) của Invitrogen và các phương pháp tinh chế dựa trên HPLC, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, HPLC trao đổi anion mạnh, HPLC trao đổi anion yếu, HPLC pha đảo (RP-HPLC), và HPLC tương tác kỵ nước (HIC-HPLC) và Bộ PCR PURELINK™ tiêu chuẩn của Invitrogen (Carlsbad, CA). Phương pháp tinh chế có thể được sửa đổi tùy thuộc vào quy mô của phản ứng tuyến tính hóa được tiến hành. Plasmid được tuyến tính hóa sau đó được sử dụng để tạo ra cDNA cho các phản ứng phiên mã in vitro (IVT).
Tổng hợp mẫu cDNA
Mẫu cDNA có thể được tổng hợp bằng cách cho một plasmid được tuyến tính hóa trải qua phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Bảng 4 là danh sách các đoạn mồi và mẫu dò có thể hữu ích trong các phản ứng PCR theo sáng chế. Cần hiểu rằng việc liệt kê chưa đầy đủ và việc thiết kế đầu dò mồi cho bất kỳ sự khuếch đại nào đều nằm trong khả năng của những người trong lĩnh vực kỹ thuật này. Đầu dò cũng có thể chứa các bazơ được biến đổi về mặt hóa học để tăng độ chính xác của việc ghép cặp bazơ với phân tử mục tiêu và độ bền của liên kết bazơ. Những biến đổi như vậy có thể bao gồm 5-metyl-Cytidine, 2,6-di-amino-purine, 2′-fluoro, photphoro-thioate, hoặc axit nucleic bị khóa.
Theo một phương án, cDNA có thể được đưa đi phân tích trình tự trước khi tiến hành phiên mã.
sản xuất mARN
Quy trình sản xuất mARN hoặc mmARN có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, phiên mã in vitro, loại bỏ mẫu cDNA và làm sạch ARN, cũng như các phản ứng gắn đuôi và/hoặc gắn đuôi mARN.
Phiên âm trong ống nghiệm
CDNA được tạo ra ở bước trước có thể được sao chép bằng hệ thống phiên mã in vitro (IVT). Hệ thống này thường bao gồm bộ đệm phiên mã, nucleotide triphosphate (NTP), chất ức chế RNase và polymerase. NTP có thể được sản xuất nội bộ, có thể được chọn từ nhà cung cấp hoặc có thể được tổng hợp như mô tả ở đây. Các NTP có thể được chọn từ, nhưng không giới hạn ở các NTP được mô tả ở đây bao gồm các NTP tự nhiên và không tự nhiên (được biến đổi). Polymerase này có thể được chọn từ, nhưng không giới hạn ở, T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase và các polymerase đột biến như, nhưng không giới hạn ở, các polymerase có thể kết hợp các axit nucleic biến đổi.
RNA polymerase
Số lượng RNA polymerase hoặc biến thể bất kỳ có thể được sử dụng để thiết kế cấu trúc cơ bản theo sáng chế.
RNA polymerase có thể được sửa đổi bằng cách chèn hoặc xóa các axit amin của chuỗi RNA polymerase. Là một ví dụ không giới hạn, RNA polymerase có thể được biến đổi để thể hiện khả năng kết hợp nucleotit triphosphate đã được biến đổi 2′ so với RNA polymerase không biến đổi (xem Công bố Quốc tế WO2008078180 và Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 8,101,385; được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ của chúng).
Các biến thể có thể thu được bằng cách tiến hóa RNA polymerase, tối ưu hóa trình tự axit amin và/hoặc axit nucleic RNA polymerase và/hoặc bằng cách sử dụng các phương pháp khác đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Là một ví dụ không giới hạn, các biến thể T7 RNA polymerase có thể được tiến hóa bằng cách sử dụng hệ thống tiến hóa có định hướng liên tục do Esvelt et al. (Nature (2011) 472(7344):499-503; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách tham chiếu) trong đó các dòng vô tính của T7 RNA polymerase có thể mã hóa ít nhất một đột biến như, nhưng không giới hạn ở, lysine ở vị trí 93 được thay thế cho threonine ( K93T), I4M, A7T, E63V, V64D, A65E, D66Y, T76N, C125R, S128R, A136T, N165S, G175R, H176 L, Y178H, F182 L, L196F, G198V, D208Y, E222K, S228A, Q239R, T 243N, G259D , M267I, G280C, H300R, D351A, A354S, E356D, L360P, A383V, Y385C, D388Y, S397R, M401T, N410S, K450R, P451T, G452V, E484A, H523 L, H524N, G542V, E 565K, K577E, K577M, N601S, S684Y, L699I, K713E, N748D, Q754R, E775K, A827V, D85iN hoặc L864F. Như một ví dụ không giới hạn khác, các biến thể T7 RNA polymerase có thể mã hóa ít nhất đột biến như được mô tả trong US Pub. Số 20100120024 và 20070117112; toàn bộ được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Các biến thể của RNA polymerase cũng có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, các biến thể thay thế, thay thế axit amin bảo toàn, các biến thể chèn vào, các biến thể xóa và/hoặc dẫn xuất cộng hóa trị.
Theo một phương án, cấu trúc bậc một có thể được thiết kế để được nhận biết bởi các ARN polymeraza kiểu dại hoặc biến thể. Khi làm như vậy, cấu trúc chính có thể được sửa đổi để chứa các vị trí hoặc vùng thay đổi trình tự từ cấu trúc chính kiểu hoang dã hoặc gốc.
Theo một phương án, cấu trúc bậc một có thể được thiết kế để bao gồm ít nhất một sự thay thế và/hoặc gắn vào phía trước của vị trí nhận biết hoặc liên kết RNA polymerase, phía sau của vị trí nhận biết hoặc liên kết RNA polymerase, phía sau của trình tự hộp TATA, phía sau của trình tự hộp TATA. Trình tự hộp TATA của cấu trúc chính nhưng ngược dòng vùng mã hóa của cấu trúc chính, trong 5′UTR, trước 5′UTR và/hoặc sau 5′UTR.
Theo một phương án, 5′UTR của cấu trúc bậc một có thể được thay thế bằng cách chèn ít nhất một vùng và/hoặc chuỗi nucleotit của cùng một bazơ. Vùng và/hoặc chuỗi nucleotit có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở ít nhất 3, ít nhất 4, ít nhất 5, ít nhất 6, ít nhất 7 hoặc ít nhất 8 nucleotit và các nucleotit này có thể là tự nhiên và/hoặc không tự nhiên. Là một ví dụ không giới hạn, nhóm nucleotit có thể bao gồm 5-8 adenin, cytosin, thymine, chuỗi gồm nucleotit bất kỳ khác bộc lộ ở đây và/hoặc tổ hợp của chúng.
Theo một phương án, 5′UTR của cấu trúc bậc một có thể được thay thế bằng cách gắn thêm ít nhất hai vùng và/hoặc chuỗi nucleotit của hai bazơ khác nhau như, nhưng không giới hạn ở, adenin, cytosine, thymine, bất kỳ trong số các bazơ này. các nucleotit khác bộc lộ ở đây và/hoặc tổ hợp của chúng. Ví dụ, 5′UTR có thể được thay thế bằng cách chèn 5-8 bazơ adenine sau đó chèn 5-8 bazơ cytosine. Trong một ví dụ khác, 5′UTR có thể được thay thế bằng cách chèn 5-8 bazơ cytosine sau đó chèn 5-8 bazơ adenin.
Theo một phương án, cấu trúc bậc một có thể bao gồm ít nhất một sự thay thế và/hoặc sự chèn vào phía sau vị trí bắt đầu phiên mã mà có thể được nhận biết bởi ARN polymerase. Như một ví dụ không giới hạn, ít nhất một sự thay thế và/hoặc sự chèn có thể xảy ra ở phía sau vị trí bắt đầu phiên mã bằng cách thay thế ít nhất một axit nucleic ở vùng ngay phía sau vị trí bắt đầu phiên mã (chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, +1 đến +6). Những thay đổi ở vùng nucleotide ngay phía sau vị trí bắt đầu phiên mã có thể ảnh hưởng đến tốc độ bắt đầu, làm tăng giá trị hằng số phản ứng nucleotide triphosphate (NTP) rõ ràng và tăng sự phân ly của các bản phiên mã ngắn từ phức hợp phiên mã xử lý phiên mã ban đầu (Brieba et al, Hóa sinh (2002) ) 41: 5144-5149; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Việc biến đổi, thay thế và/hoặc chèn ít nhất một axit nucleic có thể gây ra đột biến thầm lặng ở trình tự axit nucleic hoặc có thể gây ra đột biến ở trình tự axit amin.
Theo một phương án, cấu trúc bậc một có thể bao gồm sự thay thế ít nhất 1, ít nhất 2, ít nhất 3, ít nhất 4, ít nhất 5, ít nhất 6, ít nhất 7, ít nhất 8, ít nhất 9, ít nhất 10, ít nhất 11, ít nhất 12 hoặc ít nhất 13 bazơ guanin ở phía sau vị trí bắt đầu phiên mã.
Theo một phương án, cấu trúc bậc một có thể bao gồm sự thay thế của ít nhất 1, ít nhất 2, ít nhất 3, ít nhất 4, ít nhất 5 hoặc ít nhất 6 bazơ guanin ở vùng ngay sau vị trí bắt đầu phiên mã. Như một ví dụ không giới hạn, nếu các nucleotit trong vùng là GGGAGA thì các bazơ guanin có thể được thay thế bằng ít nhất 1, ít nhất 2, ít nhất 3 hoặc ít nhất 4 nucleotit adenin. Trong một ví dụ không giới hạn khác, nếu các nucleotit trong vùng là GGGAGA thì các bazơ guanin có thể được thay thế bằng ít nhất 1, ít nhất 2, ít nhất 3 hoặc ít nhất 4 bazơ cytosin. Trong một ví dụ không giới hạn khác, nếu các nucleotit trong vùng là GGGAGA thì các bazơ guanin có thể được thay thế bằng ít nhất 1, ít nhất 2, ít nhất 3 hoặc ít nhất 4 thymin, và/hoặc nucleotit bất kỳ mô tả ở đây.
Theo một phương án, cấu trúc sơ cấp có thể bao gồm ít nhất một sự thay thế và/hoặc sự chèn ngược dòng của codon khởi đầu. Với mục đích làm rõ, người có hiểu biết trung bình trong lĩnh vực kỹ thuật này sẽ đánh giá rằng codon khởi đầu là codon thứ nhất của vùng mã hóa protein trong khi vị trí bắt đầu phiên mã là vị trí bắt đầu phiên mã. Cấu trúc bậc một có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, ít nhất 1, ít nhất 2, ít nhất 3, ít nhất 4, ít nhất 5, ít nhất 6, ít nhất 7 hoặc ít nhất 8 thay thế và/hoặc thêm nucleotit căn cứ. Các bazơ nucleotit có thể được xen vào hoặc thay thế ở 1, ít nhất 1, ít nhất 2, ít nhất 3, ít nhất 4 hoặc ít nhất 5 vị trí phía trước codon khởi đầu. Các nucleotide được chèn vào và/hoặc được thế có thể là cùng một bazơ (ví dụ, tất cả A hoặc tất cả C hoặc tất cả T hoặc tất cả G), hai bazơ khác nhau (ví dụ, A và C, A và T, hoặc C và T), ba bazơ khác nhau các bazơ (ví dụ: A, C và T hoặc A, C và T) hoặc ít nhất bốn bazơ khác nhau. Như một ví dụ không giới hạn, bazơ guanin ngược dòng của vùng mã hóa trong cấu trúc bậc một có thể được thay thế bằng adenin, cytosin, thymine, hoặc nucleotit bất kỳ được mô tả ở đây. Trong một ví dụ không giới hạn khác, việc thay thế các bazơ guanin trong cấu trúc bậc một có thể được thiết kế sao cho để lại một bazơ guanin ở vùng phía sau vị trí bắt đầu phiên mã và trước codon khởi đầu (xem Esvelt và cộng sự. Nature (2011) 472 (7344):499-503; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Như một ví dụ không giới hạn, ít nhất 5 nucleotit có thể được xen vào tại 1 vị trí phía sau vị trí bắt đầu phiên mã nhưng phía trên codon khởi đầu và ít nhất 5 nucleotit này có thể là cùng loại bazơ.
Loại bỏ và làm sạch mẫu cDNA
Mẫu cDNA có thể được loại bỏ bằng cách sử dụng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, xử lý bằng Deoxyribonuclease I (DNase I). Việc làm sạch RNA cũng có thể bao gồm phương pháp tinh chế, chẳng hạn như nhưng không giới hạn ở hệ thống AGENCOURT® CLEANSEQ® của Beckman Coulter (Danvers, MA), các phương pháp tinh chế dựa trên HPLC chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, HPLC trao đổi anion mạnh, HPLC yếu HPLC trao đổi anion, HPLC pha đảo (RP-HPLC) và HPLC tương tác kỵ nước (HIC-HPLC).
Phản ứng giới hạn và/hoặc nối đuôi
Cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA cũng có thể trải qua các phản ứng gắn nắp và/hoặc nối đuôi. Phản ứng đóng nắp có thể được thực hiện bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này để thêm nắp 5’ vào đầu 5’ của cấu trúc bậc một. Các phương pháp đóng nắp bao gồm nhưng không giới hạn ở việc sử dụng enzyme Vaccinia Capping (New England Biolabs, Ipswich, MA).
Phản ứng đuôi poly-A có thể được thực hiện bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, 2′ O-methyltransferase và bằng các phương pháp như được mô tả ở đây. Nếu cấu trúc sơ cấp được tạo ra từ cDNA không bao gồm poly-T, thì có thể có ích nếu thực hiện phản ứng nối đuôi poly-A trước khi làm sạch cấu trúc sơ cấp.
Thanh lọc mRNA
Cấu trúc sơ cấp hoặc quá trình tinh chế mmRNA có thể bao gồm nhưng không giới hạn ở việc làm sạch mRNA hoặc mmRNA, đảm bảo chất lượng và kiểm soát chất lượng. Việc làm sạch mRNA hoặc mmRNA có thể được thực hiện bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, hạt AGENCOURT® (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), hạt poly-T, đầu dò thu giữ LNA™ oligo-T (EXIQON ® Inc, Vedbaek, Đan Mạch) hoặc các phương pháp tinh chế dựa trên HPLC, chẳng hạn như nhưng không giới hạn ở HPLC trao đổi anion mạnh, HPLC trao đổi anion yếu, HPLC pha đảo (RP-HPLC) và HPLC tương tác kỵ nước (HIC-HPLC). Thuật ngữ “đã tinh chế” khi được sử dụng để chỉ polynucleotit như “mARN hoặc mmARN tinh khiết” được dùng để chỉ polynucleotit được tách khỏi ít nhất một chất gây ô nhiễm. Như được sử dụng ở đây, “chất gây ô nhiễm” là chất bất kỳ làm cho chất khác không phù hợp, không tinh khiết hoặc kém chất lượng. Do đó, polynucleotit đã tinh chế (ví dụ, DNA và RNA) tồn tại ở dạng hoặc cấu trúc khác với dạng hoặc cấu trúc mà nó được tìm thấy trong tự nhiên, hoặc ở dạng hoặc cấu trúc khác với dạng tồn tại trước khi đưa nó vào phương pháp xử lý hoặc tinh chế. .
Việc kiểm tra đảm bảo chất lượng và/hoặc kiểm soát chất lượng có thể được tiến hành bằng các phương pháp như, nhưng không giới hạn, điện di trên gel, hấp thụ tia cực tím hoặc HPLC phân tích.
Theo một phương án khác, mARN hoặc mmARN có thể được giải trình tự bằng các phương pháp bao gồm, nhưng không giới hạn ở PCR phiên mã ngược.
Theo một phương án, mARN hoặc mmARN có thể được định lượng bằng cách sử dụng các phương pháp như, nhưng không giới hạn ở, quang phổ tử ngoại khả kiến (UV/Vis). Một ví dụ không giới hạn về máy quang phổ UV/Vis là máy quang phổ NANODROP® (ThermoFisher, Waltham, MA). MRNA hoặc mmRNA đã định lượng có thể được phân tích để xác định xem mRNA hoặc mmRNA có thể có kích thước phù hợp hay không, kiểm tra để chắc chắn rằng không xảy ra sự suy giảm của mRNA hoặc mmRNA. Sự phân hủy của mRNA và/hoặc mmRNA có thể được kiểm tra bằng các phương pháp như, nhưng không giới hạn ở, điện di trên gel agarose, các phương pháp tinh chế dựa trên HPLC, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, HPLC trao đổi anion mạnh, HPLC trao đổi anion yếu, HPLC pha đảo (RP-HPLC) và HPLC tương tác kỵ nước (HIC-HPLC), sắc ký lỏng khối phổ (LCMS), điện di mao quản (CE) và điện di trên gel mao quản (CGE).
Chuỗi tín hiệu
Các cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA cũng có thể mã hóa các đặc điểm bổ sung tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển các polypeptit đến các vị trí có liên quan đến điều trị. Một tính năng hỗ trợ việc vận chuyển protein là chuỗi tín hiệu. Như được sử dụng ở đây, “trình tự tín hiệu” hoặc “peptit tín hiệu” lần lượt là polynucleotit hoặc polypeptit, có chiều dài từ khoảng 9 đến 200 nucleotit (3-60 axit amin) được kết hợp ở đầu 5′ (hoặc N-). đầu cuối) của vùng mã hóa hoặc polypeptit được mã hóa tương ứng. Việc bổ sung các trình tự này dẫn đến việc vận chuyển polypeptide được mã hóa vào mạng lưới nội chất thông qua một hoặc nhiều con đường bài tiết. Một số peptide tín hiệu được tách ra khỏi protein nhờ peptidase tín hiệu sau khi protein được vận chuyển.
Bảng 5 là danh sách đại diện của các trình tự tín hiệu protein có thể được kết hợp để mã hóa bởi các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế.
Trong bảng, SS là tín hiệu bài tiết và MLS là tín hiệu dẫn đầu ty thể. Cấu trúc chính hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được thiết kế để mã hóa bất kỳ chuỗi tín hiệu nào của SEQ ID NO 94-155, hoặc các đoạn hoặc biến thể của chúng. Các trình tự này có thể được bao gồm ở phần đầu của vùng mã hóa polypeptit, ở giữa hoặc ở đầu cuối hoặc cách khác là ở vùng sườn. Hơn nữa, cấu trúc sơ cấp polynucleotit bất kỳ theo sáng chế cũng có thể bao gồm một hoặc nhiều trình tự được xác định bởi SEQ ID NO 32-93. Đây có thể là vùng đầu tiên hoặc vùng sườn.
Các chuỗi tín hiệu bổ sung có thể được sử dụng trong sáng chế bao gồm các chuỗi tín hiệu được dạy trong, ví dụ, các cơ sở dữ liệu như các cơ sở dữ liệu có tại www.signalpeptide.de/ hoặc proline.bic.nus.edu.sg/spdb/. Những mô tả trong US Pat. số 8.124.379; 7.413.875 và 7.385.034 cũng nằm trong phạm vi của sáng chế và toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn.
Các tín hiệu và vị trí phân cắt protein
Theo một phương án, polypeptit theo sáng chế có thể bao gồm ít nhất một tín hiệu phân cắt protein chứa ít nhất một vị trí phân cắt protein. Vị trí phân cắt protein có thể nằm ở đầu N, đầu C, ở khoảng trống bất kỳ giữa đầu N và đầu C, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, nửa đường giữa đầu N và đầu C, giữa đầu N và điểm nửa đường, giữa điểm nửa đường và đầu C và sự kết hợp của chúng.
Các polypeptit theo sáng chế có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, proprotein Convertase (hoặc prohormone Convertase), tín hiệu phân cắt protein trombin hoặc Yếu tố Xa. Proprotein Convertase là một họ gồm chín proteinase, bao gồm bảy proteinase serine giống subtilisin đặc hiệu với axit amin cơ bản có liên quan đến nấm men kexin, được gọi là prohormone Convertase 1/3 (PC1/3), PC2, furin, PC4, PC5/6, được ghép nối enzyme phân cắt axit amin cơ bản 4 (PACE4) và PC7, và hai loại subtilase khác phân cắt ở các gốc không bazơ, được gọi là subtilisin kexin isozyme 1 (SKI-1) và proprotein Convertase subtilisin kexin 9 (PCSK9). Các ví dụ không giới hạn về trình tự axit amin tín hiệu phân cắt protein được liệt kê trong Bảng 7. Trong Bảng 7, “X” dùng để chỉ axit amin bất kỳ, “n” có thể là 0, 2, 4 hoặc 6 axit amin và “*” dùng để chỉ vị trí phân cắt protein. Trong Bảng 7, SEQ ID NO: 31895 đề cập đến khi n=4 và SEQ ID NO: 31896 đề cập đến khi n=6.
Theo một phương án, cấu trúc bậc một và mmRNA theo sáng chế có thể được thiết kế sao cho cấu trúc bậc một hoặc mmRNA chứa ít nhất một tín hiệu phân tách protein được mã hóa. Tín hiệu phân tách protein được mã hóa có thể nằm trước codon khởi đầu, sau codon khởi đầu, trước vùng mã hóa, trong vùng mã hóa, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, nửa chặng trong vùng mã hóa, giữa codon khởi đầu và nửa chặng đường. điểm, giữa điểm nửa đường và codon dừng, sau vùng mã hóa, trước codon dừng, giữa hai codon dừng, sau codon dừng và sự kết hợp của chúng.
Theo một phương án, cấu trúc chính hoặc mmRNA theo sáng chế có thể bao gồm ít nhất một tín hiệu phân tách protein được mã hóa chứa ít nhất một vị trí phân cắt protein. Tín hiệu phân cắt protein được mã hóa có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, enzyme chuyển đổi proprotein (hoặc prohormone chuyển đổi), tín hiệu phân tách protein trombin và/hoặc Yếu tố Xa. Người có hiểu biết sâu về lĩnh vực kỹ thuật này có thể sử dụng Bảng 1 trên đây hoặc các phương pháp đã biết khác để xác định tín hiệu phân tách protein được mã hóa thích hợp để đưa vào cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA theo sáng chế. Ví dụ, bắt đầu với tín hiệu ở Bảng 7 và xem xét các codon của Bảng 1, người ta có thể thiết kế tín hiệu cho cấu trúc bậc một mà có thể tạo ra tín hiệu protein trong polypeptit thu được.
Theo một phương án, polypeptit theo sáng chế bao gồm ít nhất một tín hiệu và/hoặc vị trí phân tách protein.
Là một ví dụ không giới hạn, US Pat. Số 7.374.930 và Nhà xuất bản Hoa Kỳ. Số 20090227660, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn, sử dụng vị trí phân cắt furin để phân tách methionin ở đầu N của GLP-1 trong sản phẩm biểu hiện từ bộ máy Golgi của tế bào. Theo một phương án, polypeptit theo sáng chế bao gồm ít nhất một tín hiệu phân cắt protein và/hoặc vị trí với điều kiện là polypeptit không phải là GLP-1.
Theo một phương án, cấu trúc chính hoặc mmRNA theo sáng chế bao gồm ít nhất một tín hiệu và/hoặc vị trí phân cắt protein được mã hóa.
Theo một phương án, cấu trúc chính hoặc mmRNA theo sáng chế bao gồm ít nhất một tín hiệu phân tách protein được mã hóa và/hoặc vị trí với điều kiện là cấu trúc chính hoặc mmRNA không mã hóa GLP-1.
Theo một phương án, cấu trúc chính hoặc mmRNA theo sáng chế có thể bao gồm nhiều vùng mã hóa. Khi có nhiều vùng mã hóa trong cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế, nhiều vùng mã hóa có thể được phân tách bằng các vị trí phân cắt protein được mã hóa. Là một ví dụ không giới hạn, cấu trúc chính hoặc mmRNA có thể được ký hiệu theo mẫu có thứ tự. Trên mẫu như vậy tuân theo dạng AXBY trong đó A và B là các vùng mã hóa có thể giống hoặc khác nhau và/hoặc có thể mã hóa các polypeptide giống nhau hoặc khác nhau, và X và Y là các tín hiệu phân tách protein được mã hóa có thể mã hóa cùng một loại protein hoặc khác nhau tín hiệu phân cắt. Mẫu thứ hai như vậy có dạng AXYBZ trong đó A và B là các vùng mã hóa có thể giống hoặc khác nhau và/hoặc có thể mã hóa các polypeptit giống nhau hoặc khác nhau, và X, Y và Z là các tín hiệu phân tách protein được mã hóa có thể mã hóa tín hiệu phân cắt protein giống nhau hoặc khác nhau. Mẫu thứ ba có dạng ABXCY trong đó A, B và C là các vùng mã hóa có thể giống hoặc khác nhau và/hoặc có thể mã hóa các polypeptide giống nhau hoặc khác nhau, và X và Y là các tín hiệu phân tách protein được mã hóa có thể mã hóa giống nhau hoặc các tín hiệu phân cắt protein khác nhau.
Theo một phương án, polypeptit, cấu trúc bậc một và mmRNA cũng có thể chứa các trình tự mã hóa vị trí phân cắt protein sao cho các polypeptit, cấu trúc bậc một và mmRNA có thể được giải phóng khỏi vùng mang hoặc phần dung hợp bằng cách xử lý bằng proteaza đặc hiệu để phân cắt protein này địa điểm.
Theo một phương án, polypeptit, cấu trúc bậc một và mmARN theo sáng chế có thể bao gồm trình tự mã hóa peptit 2A. Theo một phương án, trình tự này có thể được sử dụng để phân tách vùng mã hóa của hai hoặc nhiều polypeptit quan tâm. Là một ví dụ không giới hạn, trình tự mã hóa peptit 2A có thể nằm giữa vùng mã hóa A và vùng mã hóa B (A-2Apep-B). Sự hiện diện của peptit 2A sẽ dẫn đến sự phân cắt một protein dài thành protein A, protein B và peptit 2A. Protein A và protein B có thể là các polypeptide được quan tâm giống nhau hoặc khác nhau. Theo một phương án khác, peptit 2A có thể được sử dụng trong các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA theo sáng chế để tạo ra hai, ba, bốn, năm, sáu, bảy, tám, chín, mười hoặc nhiều protein.
Kết hợp bộ điều biến kiểm soát phiên mã
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN theo sáng chế có thể bao gồm ít nhất một bộ điều biến kiểm soát sau phiên mã. Các bộ điều biến kiểm soát sau phiên mã này có thể, nhưng không giới hạn ở, các phân tử nhỏ, hợp chất và trình tự điều hòa. Như một ví dụ không giới hạn, có thể đạt được kiểm soát sau phiên mã bằng cách sử dụng các phân tử nhỏ được xác định bởi PTC Therapeutics Inc. (South Plainfield, NJ) bằng công nghệ sàng lọc GEMS™ (Điều chế biểu hiện gen bằng phân tử nhỏ) của họ.
Bộ điều biến kiểm soát sau phiên mã có thể là bộ điều biến biểu hiện gen được sàng lọc bằng phương pháp được nêu chi tiết trong hoặc bộ điều biến biểu hiện gen được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2006022712, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Các phương pháp xác định trình tự điều hòa RNA liên quan đến kiểm soát dịch mã được mô tả trong Công bố Quốc tế số WO2004067728, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn; các phương pháp xác định các hợp chất điều chỉnh sự biểu hiện phụ thuộc vùng chưa dịch mã của gen được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2004065561, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN theo sáng chế có thể bao gồm ít nhất một bộ điều biến kiểm soát sau phiên mã nằm ở vùng 5’ và/hoặc vùng 3’ chưa được dịch mã của các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN của sáng chế hiện tại
Theo một phương án khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN theo sáng chế có thể bao gồm ít nhất một bộ điều biến kiểm soát sau phiên mã để điều biến việc kết thúc dịch mã sớm. Các bộ điều biến kiểm soát sau phiên mã có thể là các hợp chất được mô tả trong hoặc một hợp chất được tìm thấy bằng các phương pháp được nêu trong Công bố Quốc tế Nso. WO2004010106, WO2006044456, WO2006044682, WO2006044503 và WO2006044505, mỗi nội dung này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Là một ví dụ không giới hạn, hợp chất này có thể liên kết với một vùng của ARN ribosome 28S để điều chỉnh sự kết thúc dịch mã sớm (Xem ví dụ, WO2004010106, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN theo sáng chế có thể bao gồm ít nhất một bộ điều biến kiểm soát sau phiên mã để thay đổi sự biểu hiện protein. Như một ví dụ không giới hạn, sự biểu hiện VEGF có thể được điều chỉnh bằng cách sử dụng các hợp chất được mô tả trong hoặc hợp chất được tìm thấy bằng các phương pháp được mô tả trong Số Công bố Quốc tế WO2005118857, WO2006065480, WO2006065479 và WO2006058088, mỗi chất trong số đó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn trong tài liệu này. toàn bộ.
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN theo sáng chế có thể bao gồm ít nhất một bộ điều biến kiểm soát sau phiên mã để kiểm soát quá trình dịch mã. Theo một phương án, bộ điều biến kiểm soát sau phiên mã có thể là trình tự điều hòa ARN. Là một ví dụ không giới hạn, trình tự điều hòa ARN có thể được xác định bằng các phương pháp được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2006071903, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
III. Sửa đổi
Ở đây, trong polynucleotit (như cấu trúc bậc một hoặc phân tử mARN), thuật ngữ “biến đổi” hoặc, khi thích hợp, “được biến đổi” để chỉ sự biến đổi đối với ribonucleotit A, G, U hoặc C. Nói chung, ở đây, các thuật ngữ này không nhằm mục đích đề cập đến các biến đổi ribonucleotit trong các gốc nắp mARN đầu 5′ xuất hiện tự nhiên. Trong polypeptit, thuật ngữ “biến đổi” dùng để chỉ sự biến đổi so với bộ chính tắc gồm 20 axit amin, nửa)
Các sửa đổi có thể là những sửa đổi khác nhau. Theo một số phương án, vùng mã hóa, vùng sườn và/hoặc vùng đầu cuối có thể chứa một, hai, hoặc nhiều biến đổi nucleoside hoặc nucleoside (tùy ý khác nhau). Theo một số phương án, polynucleotit biến đổi, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA được đưa vào tế bào có thể biểu hiện sự thoái hóa giảm trong tế bào, so với polynucleotit biến đổi, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA.
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmARN có thể bao gồm biến đổi hữu ích bất kỳ, chẳng hạn như đường, nucleobase, hoặc liên kết internucleoside (ví dụ với liên kết photphat/với liên kết phosphodiester/với khung phosphodiester). Một hoặc nhiều nguyên tử của nucleobase pyrimidine có thể được thế hoặc được thế bằng amino được thế tùy ý, thiol được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý (ví dụ, metyl hoặc etyl), hoặc halo (ví dụ, clo hoặc flo). Theo các phương án nhất định, các biến đổi (ví dụ, một hoặc nhiều biến đổi) có mặt trong mỗi đường và liên kết internucleoside. Các biến đổi theo sáng chế có thể là các biến đổi axit ribonucleic (RNA) thành axit deoxyribonucleic (DNA), axit nucleic threose (TNA), axit nucleic glycol (GNA), axit nucleic peptide (PNA), axit nucleic khóa (LNA) hoặc giống lai của chúng). Các sửa đổi bổ sung được mô tả ở đây.
Như được mô tả ở đây, các polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmARN theo sáng chế về cơ bản không tạo ra phản ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào mà mARN được đưa vào. Đặc điểm của phản ứng miễn dịch bẩm sinh được tạo ra bao gồm 1) tăng biểu hiện của các cytokine gây viêm, 2) kích hoạt PRR nội bào (RIG-I, MDA5, v.v. và/hoặc 3) chấm dứt hoặc giảm dịch mã protein.
Theo các phương án nhất định, có thể muốn phân hủy nội bào phân tử axit nucleic biến đổi được đưa vào tế bào. Ví dụ, sự thoái biến của phân tử axit nucleic biến đổi có thể được ưu tiên hơn nếu muốn có thời gian chính xác để sản xuất protein. Do đó, theo một số phương án, sáng chế đề xuất phân tử axit nucleic biến đổi chứa miền thoái hóa, miền này có khả năng bị tác động theo cách có định hướng trong tế bào. Theo một khía cạnh khác, sáng chế đề xuất các polynucleotit bao gồm nucleoside hoặc nucleotit mà có thể phá vỡ sự liên kết của rãnh chính tương tác, ví dụ, liên kết, cộng tác với polynucleotit (ví dụ, trong đó nucleotit biến đổi có ái lực liên kết giảm với đối tác tương tác rãnh chính, so với nucleotit không biến đổi).
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmRNA có thể tùy ý bao gồm các tác nhân khác (ví dụ, tác nhân cảm ứng RNAi, tác nhân RNAi, siRNA, shRNA, miRNA, RNA antisense, ribozyme, DNA xúc tác, tRNA, RNA tạo ra sự hình thành chuỗi xoắn ba, aptamer, vectơ , vân vân.). Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc sơ cấp, hoặc mmRNA có thể bao gồm một hoặc nhiều ARN thông tin (mRNA) và một hoặc nhiều nucleoside hoặc nucleoside biến đổi (ví dụ, phân tử mmRNA). Thông tin chi tiết về các polynucleotide, cấu trúc chính và mmRNA này sẽ được trình bày dưới đây.
Polynucleotide và cấu trúc sơ cấp
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA theo sáng chế bao gồm vùng thứ nhất gồm các nucleoside liên kết mã hóa polypeptit quan tâm, vùng sườn thứ nhất nằm ở đầu 5’ của vùng thứ nhất, và vùng sườn thứ hai nằm ở đầu 3’ của vùng đầu tiên.
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có Công thức (Ia) hoặc Công thức (Ia-1):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- U là O, S, N(Rbạn)không, hoặc C(Rbạn)không, trong đó nu là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi Rbạnđộc lập là H, halo, hoặc alkyl được thế tùy ý;
- một liên kết đơn lẻ hoặc vắng mặt;
- mỗi R1′, R2′, R1″, R2″, R1, R2, R3, R4và R5độc lập, nếu có, là H, halo, hydroxy, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hydroxyalkoxy được thế tùy ý, amino, azido, tùy ý được thế aryl được thế, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, hoặc không có; trong đó sự kết hợp của R3 với một hoặc nhiều R1′, R1″, R2′, R2″, hoặc R5 (ví dụ, sự kết hợp của R1′ và R3, sự kết hợp của R1″ và R3, sự kết hợp của R2′ và R3 , tổ hợp của R2” và R3, hoặc tổ hợp của R5 và R3) có thể liên kết với nhau để tạo thành alkyl được thế tùy ý hoặc heteroalkylen được thế tùy ý và, được lấy cùng với các nguyên tử cacbon mà chúng được gắn vào, tạo ra dị vòng tùy ý được thế (ví dụ, dị vòng hai vòng, ba vòng hoặc bốn vòng); trong đó sự kết hợp của R5 với một hoặc nhiều R1', R1", R2', hoặc R2" (ví dụ, sự kết hợp của R1' và R5, sự kết hợp của R1" và R5, sự kết hợp của R2' và R5, hoặc sự kết hợp của R2” và R5) có thể liên kết với nhau để tạo thành alkyl được thế tùy ý hoặc heteralkylen được thế tùy ý và, được lấy cùng với các nguyên tử cacbon mà chúng được gắn vào, tạo ra dị vòng được thế tùy ý (ví dụ, dị vòng hai vòng, ba vòng, hoặc bốn vòng) ; và trong đó sự kết hợp của R4và một hoặc nhiều R1′, R1", R2′, R2", R3hoặc R5có thể liên kết với nhau để tạo thành alkyl được thế tùy ý hoặc heteralkylen được thế tùy ý và, được lấy cùng với các nguyên tử cacbon mà chúng được gắn vào, tạo ra dị vòng được thế tùy ý (ví dụ, dị vòng hai vòng, ba vòng, hoặc bốn vòng); mỗi m' và m" độc lập là một số nguyên từ 0 đến 3 (ví dụ: từ 0 đến 2, từ 0 đến 1, từ 1 đến 3 hoặc từ 1 đến 2);
- mỗi Y1, Y2và Y3, độc lập là O, S, Se, —NRN1—, alkyl được thế tùy ý, hoặc heteroalkylen tùy ý được thế, trong đó RN1là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, aryl được thế tùy ý, hoặc không có mặt;
- mỗi Y4độc lập là H, hydroxy, thiol, boranyl, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hoặc amino được thế tùy ý;
- mỗi Y5độc lập là O, S, Se, alkyl được thế tùy ý (ví dụ, methylene), hoặc heteralkylene được thế tùy ý;
- n là số nguyên từ 1 đến 100.000; Và
- B là nucleobase (ví dụ, purin, pyrimidine, hoặc dẫn xuất của chúng), trong đó sự kết hợp của B và R1′, sự kết hợp của B và R2′, sự kết hợp của B và R1", hoặc sự kết hợp của B và R2"có thể, cùng với các cacbon mà chúng được gắn vào, tùy ý tạo thành nhóm hai vòng (ví dụ, dị vòng hai vòng) hoặc trong đó tổ hợp của B, R1"và R3hoặc sự kết hợp của B, R2"và R3có thể tùy ý tạo thành nhóm ba vòng hoặc nhóm tứ vòng (ví dụ, dị vòng ba vòng hoặc tứ vòng, như có công thức (IIo)-(IIp) ở đây). Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm ribose biến đổi. Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có Công thức (Ia-2)-(Ia-5) hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó.
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có Công thức (Ib) hoặc Công thức (Ib-1):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- U là O, S, N(Rbạn)không, hoặc C(Rbạn)không, trong đó nu là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi Rbạnđộc lập là H, halo, hoặc alkyl được thế tùy ý;
- là một liên kết đơn hoặc vắng mặt;
- mỗi R1, R3′, R3"và R4độc lập là H, halo, hydroxy, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hydroxyalkoxy được thế tùy ý, amino, azido, aryl được thế tùy ý, được thế tùy ý aminoalkyl, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, hoặc không có; và trong đó sự kết hợp của R1và R3′hoặc sự kết hợp của R1và R3"có thể được sử dụng cùng nhau để tạo thành alkylene được thế tùy ý hoặc heteroalkylene được thế tùy ý (ví dụ, để tạo ra axit nucleic bị khóa);
- mỗi R5độc lập là H, halo, hydroxy, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hoặc không có;
- mỗi Y1, Y2và Y3độc lập là O, S, Se, —NRN1—, alkyl được thế tùy ý, hoặc heteroalkylen tùy ý được thế, trong đó RN1là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hoặc aryl được thế tùy ý;
- mỗi Y4độc lập là H, hydroxy, thiol, boranyl, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hoặc amino được thế tùy ý;
- n là số nguyên từ 1 đến 100.000; Và
- B là một nucleobase.
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có Công thức (Ic):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- U là O, S, N(Rbạn)không, hoặc C(Rbạn)không, trong đó nu là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi Rbạnđộc lập là H, halo, hoặc alkyl được thế tùy ý;
- là một liên kết đơn hoặc vắng mặt;
- mỗi B1, B2, và B3độc lập là nucleobase (ví dụ, purin, pyrimidine, hoặc dẫn xuất của chúng, như được mô tả ở đây), H, halo, hydroxy, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, được thế tùy ý aminoalkoxy, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hydroxyalkoxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, azido, aryl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, hoặc aminoalkynyl được thế tùy ý, trong đó một và chỉ một trong số B1, B2, và B3là một nucleobase;
- mỗi Rb1, Rb2, Rb3, R3và R5độc lập là H, halo, hydroxy, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hydroxyalkoxy được thế tùy ý, amino, azido, aryl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý hoặc aminoalkynyl được thế tùy ý;
- mỗi Y1, Y2và Y3, độc lập là O, S, Se, —NRN1—, alkyl được thế tùy ý, hoặc heteroalkylen tùy ý được thế, trong đó RN1là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hoặc aryl được thế tùy ý;
- mỗi Y4độc lập là H, hydroxy, thiol, boranyl, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hoặc amino được thế tùy ý;
- mỗi Y5độc lập là O, S, Se, alkyl được thế tùy ý (ví dụ, methylene), hoặc heteralkylene được thế tùy ý;
- n là số nguyên từ 1 đến 100.000; Và
- trong đó vòng bao gồm U có thể bao gồm một hoặc nhiều liên kết đôi.
Theo các phương án cụ thể, vòng bao gồm U không có liên kết đôi giữa U—CB3Rb3hoặc giữa CB3Rb3-CB2Rb2.
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có công thức (Id):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- U là O, S, N(Rbạn)không, hoặc C(Rbạn)không, trong đó nu là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi Rbạnđộc lập là H, halo, hoặc alkyl được thế tùy ý;
- mỗi R3độc lập là H, halo, hydroxy, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hydroxyalkoxy được thế tùy ý, amino, azido, aryl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, hoặc aminoalkynyl được thế tùy ý;
- mỗi Y1, Y2và Y3, độc lập là O, S, Se, —NRN1—, alkyl được thế tùy ý, hoặc heteroalkylen tùy ý được thế, trong đó RN1là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hoặc aryl được thế tùy ý;
- mỗi Y4độc lập là H, hydroxy, thiol, boranyl, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hoặc amino được thế tùy ý;
- mỗi Y5độc lập là O, S, alkyl được thế tùy ý (ví dụ, methylene), hoặc heteroralkylene được thế tùy ý;
- n là số nguyên từ 1 đến 100.000; Và
- B là nucleobase (ví dụ, purine, pyrimidine hoặc các dẫn xuất của chúng).
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có công thức (Ie):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- mỗi U' và U'' độc lập là O, S, N(Rbạn)không, hoặc C(Rbạn)không, trong đó nu là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi Rbạnđộc lập là H, halo, hoặc alkyl được thế tùy ý;
- mỗi R6độc lập là H, halo, hydroxy, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hydroxyalkoxy được thế tùy ý, amino, azido, aryl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, hoặc aminoalkynyl được thế tùy ý;
- mỗi Y5′độc lập là O, S, alkyl được thế tùy ý (ví dụ, metylen hoặc etylen), hoặc Heteroalkylene được thế tùy ý;
- n là số nguyên từ 1 đến 100.000; Và
- B là nucleobase (ví dụ, purine, pyrimidine hoặc các dẫn xuất của chúng).
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có Công thức (Nếu) hoặc (Nếu-1):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- mỗi U' và U'' độc lập là O, S, N, N(Rbạn)không, hoặc C(Rbạn)không, trong đó nu là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi Rbạnđộc lập là H, halo, hoặc alkyl được thế tùy ý (ví dụ, U′ là O và U″ là N);
- là một liên kết đơn hoặc vắng mặt;
- mỗi R1′, R2′, R1", R2", R3và R4độc lập là H, halo, hydroxy, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hydroxyalkoxy được thế tùy ý, amino, azido, aryl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, hoặc không có; và trong đó sự kết hợp của R1′và R3, sự kết hợp của R1"và R3, sự kết hợp của R2′và R3, hoặc sự kết hợp của R2"và R3có thể được sử dụng cùng nhau để tạo thành alkylene được thế tùy ý hoặc heteroalkylene được thế tùy ý (ví dụ, để tạo ra axit nucleic bị khóa); mỗi m' và m" độc lập là một số nguyên từ 0 đến 3 (ví dụ: từ 0 đến 2, từ 0 đến 1, từ 1 đến 3 hoặc từ 1 đến 2);
- mỗi Y1, Y2và Y3, độc lập là O, S, Se, —NRN1—, alkyl được thế tùy ý, hoặc heteroalkylen tùy ý được thế, trong đó RN1là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, aryl được thế tùy ý, hoặc không có mặt;
- mỗi Y4độc lập là H, hydroxy, thiol, boranyl, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hoặc amino được thế tùy ý;
- mỗi Y5độc lập là O, S, Se, alkyl được thế tùy ý (ví dụ, methylene), hoặc heteralkylene được thế tùy ý;
- n là số nguyên từ 1 đến 100.000; Và
- B là nucleobase (ví dụ, purine, pyrimidine hoặc các dẫn xuất của chúng).
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia), (Ia-1)-(Ia-3), (Ib)-(If), và (IIa)-(IIp)), vòng bao gồm U có một hoặc hai liên kết đôi.
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), mỗi loại trong số R1, R1′và R1", nếu có mặt, là H. Theo các phương án khác, mỗi R2, R2′và R2", nếu có mặt, độc lập là H, halo (ví dụ, fluoro), hydroxy, alkoxy được thế tùy ý (ví dụ, methoxy hoặc ethoxy), hoặc alkoxyalkoxy được thế tùy ý. Theo các phương án cụ thể, alkoxyalkoxy là —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl). Theo một số phương án, s2 là 0, s1 là 1 hoặc 2, s3 là 0 hoặc 1, và R′ là C1-6alkyl.
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), mỗi loại trong số R2, R2′và R2", nếu có mặt, là H. Theo các phương án khác, mỗi R1, R1′và R1", nếu có mặt, độc lập là H, halo (ví dụ, fluoro), hydroxy, alkoxy được thế tùy ý (ví dụ, methoxy hoặc ethoxy), hoặc alkoxyalkoxy được thế tùy ý. Theo các phương án cụ thể, alkoxyalkoxy là —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl). Theo một số phương án, s2 là 0, s1 là 1 hoặc 2, s3 là 0 hoặc 1, và R′ là C1-6alkyl.
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), mỗi loại trong số R3, R4và R5độc lập là H, halo (ví dụ, fluoro), hydroxy, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý (ví dụ, methoxy hoặc ethoxy), hoặc alkoxyalkoxy được thế tùy ý. Theo các phương án cụ thể, R3là H, R4là H, R5là H hoặc R3, R4và R5đều là H. Theo các phương án cụ thể, R3là C1-6alkyl, R4là C1-6alkyl, R5là C1-6alkyl hoặc R3, R4và R5tất cả đều là C1-6alkyl. Theo các phương án cụ thể, R3và R4đều là H và R5là C1-6alkyl.
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), R3và R5liên kết với nhau để tạo thành alkyl được thế tùy ý hoặc heteralkylen được thế tùy ý và, cùng với các nguyên tử cacbon mà chúng được gắn vào, tạo ra dị vòng được thế tùy ý (ví dụ, dị vòng hai vòng, ba vòng, hoặc bốn vòng, như trans-3′,4′ chất tương tự, trong đó R3và R5liên kết với nhau để tạo thành heteralkylene (ví dụ, -(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3—, trong đó mỗi b1, b2 và b3 độc lập là một số nguyên từ 0 đến 3).
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), R3và một hoặc nhiều R1′, R1", R2′, R2"hoặc R5liên kết với nhau để tạo thành alkyl được thế tùy ý hoặc heteralkylen được thế tùy ý và, được lấy cùng với các nguyên tử cacbon mà chúng được gắn vào, tạo ra dị vòng được thế tùy ý (ví dụ, dị vòng hai vòng, ba vòng, hoặc bốn vòng, R3và một hoặc nhiều R1′, R1", R2′, R2"hoặc R5liên kết với nhau để tạo thành heteralkylene (ví dụ, -(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3—, trong đó mỗi b1, b2 và b3 độc lập là một số nguyên từ 0 đến 3).
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), R5và một hoặc nhiều R1′, R1", R2′hoặc R2"liên kết với nhau để tạo thành alkyl được thế tùy ý hoặc heteralkylen được thế tùy ý và, được lấy cùng với các nguyên tử cacbon mà chúng được gắn vào, tạo ra dị vòng được thế tùy ý (ví dụ, dị vòng hai vòng, ba vòng, hoặc bốn vòng, R5và một hoặc nhiều R1′, R1", R2′hoặc R2"liên kết với nhau để tạo thành heteralkylene (ví dụ, -(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3—, trong đó mỗi b1, b2 và b3 độc lập là một số nguyên từ 0 đến 3).
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), mỗi Y2độc lập là O, S, hoặc —NRN1—, trong đó RN1là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hoặc aryl được thế tùy ý. Theo các phương án cụ thể, Y2là NRN1—, trong đó RN1là H hoặc alkyl được thế tùy ý (ví dụ, C1-6alkyl, chẳng hạn như metyl, etyl, isopropyl, hoặc n-propyl).
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), mỗi Y3độc lập là O hoặc S.
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), R1là H; mỗi R2độc lập là H, halo (ví dụ, fluoro), hydroxy, alkoxy được thế tùy ý (ví dụ, methoxy hoặc ethoxy), hoặc alkoxyalkoxy được thế tùy ý (ví dụ, —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl, chẳng hạn như trong đó s2 là 0, s1 là 1 hoặc 2, s3 là 0 hoặc 1, và R′ là C1-6alkyl); mỗi Y2độc lập là O hoặc —NRN1—, trong đó RN1là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hoặc aryl tùy ý được thế (ví dụ, trong đó RN1là H hoặc alkyl được thế tùy ý (ví dụ, C1-6alkyl, chẳng hạn như metyl, etyl, isopropyl, hoặc n-propyl)); và mỗi Y3độc lập là O hoặc S (ví dụ: S). Theo các phương án khác, R3là H, halo (ví dụ, fluoro), hydroxy, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý (ví dụ, methoxy hoặc ethoxy), hoặc alkoxyalkoxy được thế tùy ý. Trong các phương án khác nữa, mỗi Y1độc lập là O hoặc —NRN1—, trong đó RN1là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hoặc aryl tùy ý được thế (ví dụ, trong đó RN1là H hoặc alkyl được thế tùy ý (ví dụ, C1-6alkyl, chẳng hạn như metyl, etyl, isopropyl, hoặc n-propyl)); và mỗi Y4độc lập là H, hydroxy, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hoặc amino được thế tùy ý.
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), mỗi R1độc lập là H, halo (ví dụ, fluoro), hydroxy, alkoxy được thế tùy ý (ví dụ, methoxy hoặc ethoxy), hoặc alkoxyalkoxy được thế tùy ý (ví dụ, —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl, chẳng hạn như trong đó s2 là 0, s1 là 1 hoặc 2, s3 là 0 hoặc 1, và R′ là C1-6alkyl); R2là H; mỗi Y2độc lập là O hoặc —NRN1—, trong đó RN1là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hoặc aryl tùy ý được thế (ví dụ, trong đó RN1là H hoặc alkyl được thế tùy ý (ví dụ, C1-6alkyl, chẳng hạn như metyl, etyl, isopropyl, hoặc n-propyl)); và mỗi Y3độc lập là O hoặc S (ví dụ: S). Theo các phương án khác, R3là H, halo (ví dụ, fluoro), hydroxy, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý (ví dụ, methoxy hoặc ethoxy), hoặc alkoxyalkoxy được thế tùy ý. Trong các phương án khác nữa, mỗi Y1độc lập là O hoặc —NRN1—, trong đó RN1là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hoặc aryl tùy ý được thế (ví dụ, trong đó RN1là H hoặc alkyl được thế tùy ý (ví dụ, C1-6alkyl, chẳng hạn như metyl, etyl, isopropyl, hoặc n-propyl)); và mỗi Y4độc lập là H, hydroxy, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hoặc amino được thế tùy ý.
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), vòng bao gồm U có cấu hình β-D (ví dụ: β-D-ribo).
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), vòng bao gồm U có cấu hình α-L (ví dụ: α-L-ribo).
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), một hoặc nhiều B hơn không phải là pseudouridine (ψ) hoặc 5-methyl-cytidine (m5C). Theo một số phương án, khoảng 10% đến khoảng 100% trong số n nucleobase B không phải là ψ hoặc m5C (ví dụ: từ 10% đến 20%, từ 10% đến 35%, từ 10% đến 50%, từ 10% đến 60%, từ 10% đến 75%, từ 10% đến 90%, từ 10% đến 95%, từ 10% đến 98%, từ 10% đến 99%, từ 20% đến 35%, từ 20% đến 50%, từ 20% đến 60%, từ 20% đến 75%, từ 20% đến 90 %, từ 20% đến 95%, từ 20% đến 98%, từ 20% đến 99%, từ 20% đến 100%, từ 50% đến 60%, từ 50% đến 75%, từ 50% đến 90% , từ 50% đến 95%, từ 50% đến 98%, từ 50% đến 99%, từ 50% đến 100%, từ 75% đến 90%, từ 75% đến 95%, từ 75% đến 98%, từ 75% đến 99% và từ 75% đến 100% của n số B không phải là ψ hoặc m5C). Theo một số phương án, B không phải là ψ hoặc m5C.
Theo một số phương án về polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, các công thức (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr)), khi B là nucleobase chưa biến đổi được chọn từ cytosine, guanine, uracil và adenine, sau đó ít nhất một trong số Y1, Y2hoặc Y3không phải là O
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm ribose biến đổi. Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có Công thức (IIa)-(IIc):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó. Theo các phương án cụ thể, U là O hoặc C(Rbạn)không, trong đó nu là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi Rbạnđộc lập là H, halo, hoặc alkyl được thế tùy ý (ví dụ, U là —CH2— hoặc —CH—). Theo các phương án khác, mỗi R1, R2, R3, R4và R5độc lập là H, halo, hydroxy, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hydroxyalkoxy được thế tùy ý, amino, azido, aryl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, hoặc không có mặt (ví dụ, mỗi R1và R2độc lập là H, halo, hydroxy, alkyl được thế tùy ý, hoặc alkoxy được thế tùy ý; mỗi R3và R4độc lập là H hoặc alkyl được thế tùy ý; và R5là H hoặc hydroxy), và là liên kết đơn hoặc liên kết đôi.
Theo các phương án cụ thể, polynucleotit hoặc mmRNA bao gồm n số nucleoside liên kết có công thức (IIb-1)-(IIb-2):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó. Theo một số phương án, U là O hoặc C(Rbạn)không, trong đó nu là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi Rbạnđộc lập là H, halo, hoặc alkyl được thế tùy ý (ví dụ, U là —CH2— hoặc —CH—). Theo các phương án khác, mỗi R1và R2độc lập là H, halo, hydroxy, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hydroxyalkoxy được thế tùy ý, amino, azido, aryl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, hoặc không có mặt (ví dụ, mỗi R1và R2độc lập là H, halo, hydroxy, alkyl được thế tùy ý, hoặc alkoxy được thế tùy ý, ví dụ, H, halo, hydroxy, alkyl, hoặc alkoxy). Theo các phương án cụ thể, R2là hydroxy hoặc alkoxy được thế tùy ý (ví dụ, methoxy, ethoxy, hoặc bất kỳ được mô tả ở đây).
Theo các phương án cụ thể, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm n số nucleoside liên kết có công thức (IIc-1)-(IIc-4):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó. Theo một số phương án, U là O hoặc C(Rbạn)không, trong đó nu là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi Rbạnđộc lập là H, halo, hoặc alkyl được thế tùy ý (ví dụ, U là —CH2— hoặc —CH—). Theo một số phương án, mỗi R1, R2và R3độc lập là H, halo, hydroxy, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hydroxyalkoxy được thế tùy ý, amino, azido, aryl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, hoặc không có mặt (ví dụ, mỗi R1và R2độc lập là H, halo, hydroxy, alkyl được thế tùy ý, hoặc alkoxy được thế tùy ý, ví dụ, H, halo, hydroxy, alkyl, hoặc alkoxy; và mỗi R3độc lập là H hoặc alkyl được thế tùy ý)). Theo các phương án cụ thể, R2là alkoxy được thế tùy ý (ví dụ, methoxy hoặc ethoxy, hoặc bất kỳ được mô tả ở đây). Theo các phương án cụ thể, R1là alkyl được thế tùy ý, và R2là hydroxy. Theo các phương án khác, R1là hydroxy và R2là alkyl được thế tùy ý. Theo các phương án khác, R3là alkyl được thế tùy ý.
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm ribose biến đổi không vòng. Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có Công thức (IId)-(IIf):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó.
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm hexitol được biến đổi mạch hở. Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết với công thức (IIg)-(IIj):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó.
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm gốc đường có vòng ribose co lại hoặc nở ra. Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có công thức (IIk)-(IIm):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó mỗi loại R1′, R1", R2′và R2"độc lập là H, halo, hydroxy, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, hoặc không có; và trong đó sự kết hợp của R2′và R3hoặc sự kết hợp của R2"và R3có thể được sử dụng cùng nhau để tạo thành alkyl được thế tùy ý hoặc heteroalkylen được thế tùy ý.
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm ribose biến đổi bị khóa. Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có công thức (IIn):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó R3′là O, S, hoặc —NRN1—, trong đó RN1là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hoặc aryl và R được thế tùy ý3"là alkylene được thế tùy ý (ví dụ, —CH2—, —CH2CH2—, hoặc —CH2CH2CH2—) hoặc Heteroalkylene tùy ý được thế (ví dụ, —CH2NH—, —CH2CH2NH—, —CH2VÀ2—, hoặc —CH2CH2VÀ2—)(ví dụ: R.S3′là O và R3"là alkylene được thế tùy ý (ví dụ, —CH2—, —CH2CH2—, hoặc —CH2CH2CH2-)).
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm n số nucleoside liên kết có công thức (IIn-1)-(II-n2):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó R3′là O, S, hoặc —NRN1—, trong đó RN1là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hoặc aryl và R được thế tùy ý3"là alkylene được thế tùy ý (ví dụ, —CH2—, —CH2CH2—, hoặc —CH2CH2CH2—) hoặc Heteroalkylene tùy ý được thế (ví dụ, —CH2NH—, —CH2CH2NH—, —CH2VÀ2—, hoặc —CH2CH2VÀ2—) (ví dụ: R.S3′là O và R3"là alkylene được thế tùy ý (ví dụ, —CH2—, —CH2CH2—, hoặc —CH2CH2CH2-)).
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm ribose biến đổi bị khóa mà tạo thành dị vòng bốn vòng. Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có công thức (IIo):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó R12a, R12c, T1′, T1", T2′, T2", V1và V3như được mô tả ở đây.
Công thức bất kỳ trong số các polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA có thể bao gồm một hoặc nhiều nucleobase được mô tả ở đây (ví dụ, các công thức (b1)-(b43)).
Theo một phương án, sáng chế đề xuất các phương pháp điều chế polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, trong đó polynucleotit này bao gồm n số nucleoside có Công thức (Ia), như được xác định ở đây:
phương pháp bao gồm phản ứng của hợp chất có công thức (IIIa), như được xác định ở đây:
với RNA polymerase và mẫu cDNA.
Theo một phương án khác, sáng chế đề xuất phương pháp khuếch đại polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm ít nhất một nucleotit (ví dụ, phân tử mmRNA), phương pháp này bao gồm: cho hợp chất có công thức (IIIa), như được xác định ở đây, với: cho hợp chất có công thức (IIIa) phản ứng với mồi, mẫu cDNA và RNA polymerase.
Theo một phương án, sáng chế đề xuất phương pháp điều chế polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm ít nhất một nucleotit (ví dụ, phân tử mmRNA), trong đó polynucleotit này bao gồm n số nucleoside có Công thức (Ia), như được xác định ở đây:
phương pháp bao gồm phản ứng của hợp chất có công thức (IIIa-1), như được xác định ở đây:
với RNA polymerase và mẫu cDNA.
Theo một phương án khác, sáng chế đề xuất phương pháp khuếch đại polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm ít nhất một nucleotit (ví dụ, phân tử mmARN), phương pháp này bao gồm:
-
- phản ứng hợp chất có công thức (IIIa-1), như được xác định ở đây, với mồi, mẫu cDNA, và RNA polymerase.
Theo một phương án, sáng chế đề xuất phương pháp điều chế mARN biến đổi chứa ít nhất một nucleotit (ví dụ, phân tử mmARN), trong đó polynucleotit này bao gồm n số nucleoside có công thức (Ia-2), như được xác định ở đây:
phương pháp bao gồm phản ứng của hợp chất có công thức (IIIa-2), như được xác định ở đây:
với RNA polymerase và mẫu cDNA.
Theo một phương án khác, sáng chế đề xuất phương pháp khuếch đại mARN biến đổi chứa ít nhất một nucleotit (ví dụ, phân tử mmARN), phương pháp này bao gồm:
-
- phản ứng hợp chất có công thức (IIIa-2), như được xác định ở đây, với đoạn mồi, mẫu cDNA, và RNA polymerase.
Theo một số phương án, phản ứng có thể được lặp lại từ 1 đến khoảng 7.000 lần. Theo phương án bất kỳ trong số các phương án ở đây, B có thể là nucleobase có công thức (b1)-(b43).
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmRNA có thể tùy ý bao gồm các vùng xung quanh 5′ và/hoặc 3′, được mô tả ở đây.
Các phân tử RNA biến đổi (mmRNA)
Sáng chế cũng đề cập đến các khối xây dựng, ví dụ, ribonucleoside biến đổi, ribonucleotit biến đổi, của các phân tử ARN biến đổi (mmRNA). Ví dụ, các khối xây dựng này có thể hữu ích để điều chế các polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmARN theo sáng chế.
Theo một số phương án, phân tử khối xây dựng có công thức (IIIa) hoặc (IIIa-1):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó các nhóm thế như được mô tả ở đây (ví dụ, đối với Công thức (Ia) và (Ia-1)), và trong đó khi B là nucleobase không biến đổi được chọn từ cytosine, guanine, uracil và adenine, thì ít nhất một trong số Y1, Y2hoặc Y3không phải là O
Theo một số phương án, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có công thức (IVa)-(IVb):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó B được mô tả ở đây (ví dụ, chất bất kỳ trong số (b1)-(b43)). Theo các phương án cụ thể, Công thức (IVa) hoặc (IVb) được kết hợp với uracil được biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b1)-(b9), (b21)-(b23), và (b28)-(b31), chẳng hạn như công thức (b1), (b8), (b28), (b29) hoặc (b30)). Theo các phương án cụ thể, công thức (IVa) hoặc (IVb) được kết hợp với cytosine biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b10)-(b14), (b24), (b25), và (b32)-(b36), chẳng hạn như công thức (b10) hoặc (b32)). Theo các phương án cụ thể, công thức (IVa) hoặc (IVb) được kết hợp với guanin biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b15)-(b17) và (b37)-(b40)). Theo các phương án cụ thể, công thức (IVa) hoặc (IVb) được kết hợp với adenin biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b18)-(b20) và (b41)-(b43)).
Theo một số phương án, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có công thức (IVc)-(IVk):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó B được mô tả ở đây (ví dụ, chất bất kỳ trong số (b1)-(b43)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IVc)-(IVk) được kết hợp với uracil được biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b1)-(b9), (b21)-(b23), và (b28)-(b31 ), chẳng hạn như công thức (b1), (b8), (b28), (b29) hoặc (b30)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IVc)-(IVk) được kết hợp với cytosine biến đổi (ví dụ, một công thức bất kỳ trong số các công thức (b10)-(b14), (b24), (b25), và (b32)-(b36 ), chẳng hạn như công thức (b10) hoặc (b32)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IVc)-(IVk) được kết hợp với guanin biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b15)-(b17) và (b37)-(b40)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IVc)-(IVk) được kết hợp với adenin biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b18)-(b20) và (b41)-(b43)).
Theo các phương án khác, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có công thức (Va) hoặc (Vb):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó B được mô tả ở đây (ví dụ, chất bất kỳ trong số (b1)-(b43)).
Theo các phương án khác, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có công thức (IXa)-(IXd):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó B được mô tả ở đây (ví dụ, chất bất kỳ trong số (b1)-(b43)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXa)-(IXd) được kết hợp với uracil được sửa đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b1)-(b9), (b21)-(b23), và (b28)-(b31 ), chẳng hạn như công thức (b1), (b8), (b28), (b29) hoặc (b30)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXa)-(IXd) được kết hợp với cytosine biến đổi (ví dụ, một công thức bất kỳ trong số các công thức (b10)-(b14), (b24), (b25), và (b32)-(b36 ), chẳng hạn như công thức (b10) hoặc (b32)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXa)-(IXd) được kết hợp với guanin biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b15)-(b17) và (b37)-(b40)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXa)-(IXd) được kết hợp với adenin biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b18)-(b20) và (b41)-(b43)).
Theo các phương án khác, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có công thức (IXe)-(IXg):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó B được mô tả ở đây (ví dụ, chất bất kỳ trong số (b1)-(b43)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXe)-(IXg) được kết hợp với uracil được sửa đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b1)-(b9), (b21)-(b23), và (b28)-(b31 ), chẳng hạn như công thức (b1), (b8), (b28), (b29) hoặc (b30)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXe)-(IXg) được kết hợp với cytosine biến đổi (ví dụ, một công thức bất kỳ trong số các công thức (b10)-(b14), (b24), (b25), và (b32)-(b36 ), chẳng hạn như công thức (b10) hoặc (b32)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXe)-(IXg) được kết hợp với guanin biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b15)-(b17) và (b37)-(b40)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXe)-(IXg) được kết hợp với adenin biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b18)-(b20) và (b41)-(b43)).
Theo các phương án khác, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có công thức (IXh)-(IXk):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó B được mô tả ở đây (ví dụ, chất bất kỳ trong số (b1)-(b43)). Theo các phương án cụ thể, một trong các Công thức (IXh)-(IXk) được kết hợp với uracil được sửa đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b1)-(b9), (b21)-(b23), và (b28)-(b31 ), chẳng hạn như công thức (b1), (b8), (b28), (b29) hoặc (b30)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXh)-(IXk) được kết hợp với cytosine biến đổi (ví dụ, một công thức bất kỳ trong số các công thức (b10)-(b14), (b24), (b25), và (b32)-(b36 ), chẳng hạn như công thức (b10) hoặc (b32)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXh)-(IXk) được kết hợp với guanin biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b15)-(b17) và (b37)-(b40)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXh)-(IXk) được kết hợp với adenin biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b18)-(b20) và (b41)-(b43)).
Theo các phương án khác, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có công thức (IXl)-(IXr):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó mỗi r1 và r2, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 5 (ví dụ, từ 0 đến 3, từ 1 đến 3, hoặc từ 1 đến 5) và B như được mô tả ở đây ( ví dụ: bất kỳ một trong (b1)-(b43)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXl)-(IXr) được kết hợp với uracil được sửa đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b1)-(b9), (b21)-(b23), và (b28)-(b31 ), chẳng hạn như công thức (b1), (b8), (b28), (b29) hoặc (b30)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXl)-(IXr) được kết hợp với cytosine biến đổi (ví dụ, một công thức bất kỳ trong số các công thức (b10)-(b14), (b24), (b25), và (b32)-(b36 ), chẳng hạn như công thức (b10) hoặc (b32)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXl)-(IXr) được kết hợp với guanin biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b15)-(b17) và (b37)-(b40)). Theo các phương án cụ thể, một trong các công thức (IXl)-(IXr) được kết hợp với adenin biến đổi (ví dụ, một trong các công thức bất kỳ trong số các công thức (b18)-(b20) và (b41)-(b43)).
Theo một số phương án, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có thể được chọn từ nhóm bao gồm:
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó mỗi r, độc lập, là một số nguyên từ 0 đến 5 (ví dụ, từ 0 đến 3, từ 1 đến 3, hoặc từ 1 đến 5).
Theo một số phương án, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có thể được chọn từ nhóm bao gồm:
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó mỗi r, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 5 (ví dụ, từ 0 đến 3, từ 1 đến 3, hoặc từ 1 đến 5) và s1 như được mô tả ở đây.
Theo một số phương án, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào axit nucleic (ví dụ, ARN, mARN, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA), là uridine biến đổi (ví dụ, được chọn từ nhóm bao gồm:
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó Y1, Y3, Y4, Y6và r như được mô tả ở đây (ví dụ: mỗi r độc lập là một số nguyên từ 0 đến 5, chẳng hạn như từ 0 đến 3, từ 1 đến 3 hoặc từ 1 đến 5)).
Theo một số phương án, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, là cytidin biến đổi (ví dụ, được chọn từ nhóm bao gồm:
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó Y1, Y3, Y4, Y6và r như được mô tả ở đây (ví dụ: mỗi r độc lập là một số nguyên từ 0 đến 5, chẳng hạn như từ 0 đến 3, từ 1 đến 3 hoặc từ 1 đến 5)). Ví dụ, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có thể là:
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó mỗi r, độc lập, là một số nguyên từ 0 đến 5 (ví dụ, từ 0 đến 3, từ 1 đến 3, hoặc từ 1 đến 5).
Theo một số phương án, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, là adenosin biến đổi (ví dụ, được chọn từ nhóm bao gồm:
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó Y1, Y3, Y4, Y6và r như được mô tả ở đây (ví dụ: mỗi r độc lập là một số nguyên từ 0 đến 5, chẳng hạn như từ 0 đến 3, từ 1 đến 3 hoặc từ 1 đến 5)).
Theo một số phương án, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, là guanosin biến đổi (ví dụ, được chọn từ nhóm bao gồm:
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó Y1, Y3, Y4, Y6và r như được mô tả ở đây (ví dụ: mỗi r độc lập là một số nguyên từ 0 đến 5, chẳng hạn như từ 0 đến 3, từ 1 đến 3 hoặc từ 1 đến 5)).
Theo một số phương án, sự biến đổi hóa học có thể bao gồm việc thay thế nhóm C ở C-5 của vòng (ví dụ, đối với nucleoside pyrimidine, như cytosine hoặc uracil) bằng N (ví dụ, thay thế nhóm >CH ở C-5 bằng >NRN1nhóm, trong đó RN1 là H hoặc alkyl được thế tùy ý). Ví dụ, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có thể là:
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó mỗi r, độc lập, là một số nguyên từ 0 đến 5 (ví dụ, từ 0 đến 3, từ 1 đến 3, hoặc từ 1 đến 5).
Theo một phương án khác, sự biến đổi hóa học có thể bao gồm việc thay thế hydro ở C-5 của cytosine bằng quầng (ví dụ, Br, Cl, F, hoặc I) hoặc alkyl được thế tùy ý (ví dụ, metyl). Ví dụ, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có thể là:
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó mỗi r, độc lập, là một số nguyên từ 0 đến 5 (ví dụ, từ 0 đến 3, từ 1 đến 3, hoặc từ 1 đến 5).
Theo một phương án khác nữa, biến đổi hóa học có thể bao gồm vòng ngưng tụ được tạo thành bởi NH2ở vị trí C-4 và nguyên tử cacbon ở vị trí C-5. Ví dụ, phân tử khối xây dựng, mà có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, có thể là:
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó mỗi r, độc lập, là một số nguyên từ 0 đến 5 (ví dụ, từ 0 đến 3, từ 1 đến 3, hoặc từ 1 đến 5).
Sửa đổi về đường
Các nucleoside và nucleotit biến đổi (ví dụ, các phân tử khối xây dựng), có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, ARN hoặc mARN, như được mô tả ở đây), có thể được biến đổi trên đường của axit ribonucleic. Ví dụ, nhóm 2’ hydroxyl (OH) có thể được biến đổi hoặc thay thế bằng một số nhóm thế khác nhau. Các chất thay thế được lấy làm ví dụ ở vị trí 2′ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, H, quầng, C được thế tùy ý1-6alkyl; tùy ý thay thế C1-6kiềm; tùy ý thay thế C6-10aryloxy; tùy ý thay thế C3-8xycloalkyl; tùy ý thay thế C3-8xycloalkoxy; tùy ý thay thế C6-10aryloxy; tùy ý thay thế C6-10aryl-C1-6alkoxy, tùy ý thay thế C1-12(heterocyclyl)oxy; đường (ví dụ, ribose, pentose, hoặc đường bất kỳ được mô tả ở đây); một polyetylenglycol (PEG), —O(CH2CH2O), CH2CH2HOẶC, trong đó R là H hoặc alkyl được thế tùy ý và n là số nguyên từ 0 đến 20 (ví dụ: từ 0 đến 4, từ 0 đến 8, từ 0 đến 10, từ 0 đến 16, từ 1 đến 4, từ 1 đến 8, từ 1 đến 10, từ 1 đến 16, từ 1 đến 20, từ 2 đến 4, từ 2 đến 8, từ 2 đến 10, từ 2 đến 16, từ 2 đến 20, từ 4 đến 8, từ 4 đến 10, từ 4 đến 16 và từ 4 đến 20); Axit nucleic “bị khóa” (LNA) trong đó 2′-hydroxyl được nối với nhau bằng C1-6alkylene hoặc C1-6cầu nối dị alkylene với cacbon 4′ của cùng loại đường ribose, trong đó các cầu nối ví dụ bao gồm cầu nối methylene, propylene, ete, hoặc amino; aminoalkyl, như được định nghĩa ở đây; aminoalkoxy, như được định nghĩa ở đây; amino như được định nghĩa ở đây; và axit amin, như được định nghĩa ở đây. Nói chung, RNA bao gồm nhóm đường ribose, là vòng 5 cạnh có oxy. Các nucleotit biến đổi được lấy làm ví dụ, không giới hạn bao gồm sự thay thế oxy trong ribose (ví dụ, bằng S, Se, hoặc alkylene, như methylene hoặc ethylene); bổ sung liên kết đôi (ví dụ: thay thế ribose bằng cyclopentenyl hoặc cyclohexenyl); sự co vòng của ribose (ví dụ, để tạo thành vòng 4 cạnh của cyclobutane hoặc oxetane); sự mở rộng vòng của ribose (ví dụ, để tạo thành vòng 6 hoặc 7 cạnh có thêm cacbon hoặc nguyên tử khác loại, chẳng hạn như đối với anhydrohexitol, altritol, mannitol, cyclohexanyl, cyclohexenyl và morpholino cũng có khung chính là photphoramidate); dạng đa vòng (ví dụ: tricyclo; và dạng "mở khóa", chẳng hạn như axit nucleic glycol (GNA) (ví dụ: R-GNA hoặc S-GNA, trong đó ribose được thay thế bằng các đơn vị glycol gắn với liên kết phosphodiester), axit nucleic threose (TNA) , trong đó ribose được thay thế bằng α-L-threofuranosyl-(3′→2′)) và axit nucleic peptide (PNA, trong đó các liên kết 2-amino-ethyl-glycine thay thế xương sống ribose và phosphodiester. Nhóm đường cũng có thể). chứa một hoặc nhiều nguyên tử cacbon có cấu hình hóa học lập thể ngược lại với cấu hình hóa học lập thể của carbon tương ứng trong ribose. Do đó, polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc phân tử mmRNA có thể bao gồm các nucleotide chứa, ví dụ, arabinose, dưới dạng đường.
Sửa đổi trên Nucleobase
Sáng chế đề xuất nucleoside và nucleoside biến đổi. Như được mô tả ở đây, “nucleoside” được định nghĩa là hợp chất chứa phân tử đường (ví dụ, pentose hoặc ribose) hoặc dẫn xuất của chúng kết hợp với bazơ hữu cơ (ví dụ, purine hoặc pyrimidine) hoặc dẫn xuất của chúng (cũng được đề cập ở đây là “nucleobase”). Như được mô tả ở đây, “nucleotit” được định nghĩa là nucleoside bao gồm nhóm phosphat. Các nucleotit biến đổi có thể được tổng hợp bằng phương pháp hữu ích bất kỳ, như được mô tả ở đây (ví dụ, về mặt hóa học, enzym, hoặc tái tổ hợp để bao gồm một hoặc nhiều nucleoside biến đổi hoặc không tự nhiên).
Việc ghép cặp bazơ nucleotit biến đổi không chỉ bao gồm các cặp bazơ adenosine-thymine, adenosine-uracil, hoặc guanosine-cytosine chuẩn, mà còn bao gồm các cặp bazơ được tạo thành giữa các nucleotit và/hoặc các nucleotit biến đổi bao gồm các bazơ không chuẩn hoặc đã biến đổi, trong đó sự sắp xếp hydro chất cho liên kết và chất nhận liên kết hydro cho phép liên kết hydro giữa bazơ phi tiêu chuẩn và bazơ tiêu chuẩn hoặc giữa hai cấu trúc bazơ phi tiêu chuẩn bổ sung. Một ví dụ về sự ghép cặp bazơ không chuẩn như vậy là sự ghép cặp bazơ giữa nucleotide biến đổi inosine và adenine, cytosine hoặc uracil.
Nucleoside và nucleotit biến đổi có thể bao gồm nucleobase biến đổi. Ví dụ về nucleobase được tìm thấy trong RNA bao gồm, nhưng không giới hạn ở adenine, guanine, cytosine và uracil. Ví dụ về nucleobase được tìm thấy trong DNA bao gồm, nhưng không giới hạn ở adenine, guanine, cytosine và thymine. Các nucleobase này có thể được biến đổi hoặc được thay thế hoàn toàn để tạo ra các polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc phân tử mmRNA có các đặc tính được tăng cường, ví dụ, tính kháng các nucleaza thông qua việc phá vỡ liên kết của phần liên kết rãnh chính. Bảng 8 dưới đây xác định các mặt hóa học của từng nucleotide chính tắc. Các vòng tròn xác định các nguyên tử bao gồm các vùng hóa học tương ứng.
Theo một số phương án, B là uracil được biến đổi. Các uracil biến đổi được lấy làm ví dụ bao gồm các chất có Công thức (b1)-(b5):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- là liên kết đơn hoặc đôi;
- mỗi T1′, T1", T2′và T2"độc lập là H, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, hoặc thioalkoxy được thế tùy ý, hoặc tổ hợp của T1′và T1"hoặc sự kết hợp của T2′và T2"kết hợp với nhau (ví dụ như trong T2) để tạo thành O (oxo), S (thio) hoặc Se (seleno);
- mỗi V1và V2độc lập là O, S, N(Rvb)nv, hoặc C(Rvb)nv, trong đó nv là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi Rvbđộc lập là H, halo, axit amin được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, haloalkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkenyl được thế tùy ý, tùy ý hydroxyalkynyl được thế, aminoalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ N, như bất kỳ được mô tả ở đây, ví dụ, trifluoroacetyl), aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, acylaminoalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ N, chẳng hạn như bất kỳ được mô tả ở đây, ví dụ, trifluoroacetyl), alkoxycarbonylalkyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkenyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkynyl được thế tùy ý, hoặc alkynyloxy được thế tùy ý (ví dụ, tùy ý được thế bằng nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây, như các nhóm thế được chọn từ (1)-(21) đối với alkyl);
- R10là H, halo, axit amin được thế tùy ý, hydroxy, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkenyl được thế tùy ý, hydroxyalkynyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, được thế tùy ý alkoxy, alkoxycarbonylalkyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkenyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkynyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkoxy được thế tùy ý, carboxyalkoxy được thế tùy ý, carboxyalkyl được thế tùy ý, hoặc carbamoylalkyl được thế tùy ý;
- R11là H hoặc alkyl được thế tùy ý;
- R12alà H, alkyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkenyl được thế tùy ý, hydroxyalkynyl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, hoặc aminoalkynyl được thế tùy ý, carboxyalkyl được thế tùy ý (ví dụ, tùy ý được thế bằng hydroxy), carboxyalkoxy được thế tùy ý, tùy ý được thế carboxyaminoalkyl, hoặc carbamoylalkyl được thế tùy ý; Và
- R12clà H, halo, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkenyl được thế tùy ý, hydroxyalkynyl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, hoặc aminoalkynyl được thế tùy ý.
Các uracil biến đổi được lấy làm ví dụ khác bao gồm các chất có Công thức (b6)-(b9):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó, trong đó là liên kết đơn hoặc liên kết đôi; mỗi T1′, T1", T2′và T2"độc lập là H, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, hoặc thioalkoxy được thế tùy ý, hoặc tổ hợp của T1′và T1"kết hợp với nhau (ví dụ như trong T) hoặc sự kết hợp của T2′và T2"kết hợp với nhau (ví dụ như trong T2) để tạo thành O (oxo), S (thio), hoặc Se (seleno) hoặc mỗi T1và T2độc lập là O (oxo), S (thio) hoặc Se (seleno);
-
- mỗi W1và W2độc lập là N(RCủa)bây giờhoặc C(RCủa)bây giờ, trong đó nw là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi RCủađộc lập là H, alkyl được thế tùy ý, hoặc alkoxy được thế tùy ý;
- mỗi V3độc lập là O, S, N(RVà)nv, hoặc C(RVà)nv, trong đó nv là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi RVàđộc lập là H, halo, axit amin được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkenyl được thế tùy ý, hydroxyalkynyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, nitrocyclyl được thế tùy ý, alkheterocyclyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, tùy ý Alkenyloxy được thế, hoặc alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ N, như nhóm bất kỳ được mô tả ở đây, ví dụ, trifluoroacetyl, hoặc sulfoalkyl), aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, acylaminoalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ N, như nhóm bất kỳ được mô tả ở đây, ví dụ, trifluoroacetyl), alkoxycarbonylalkyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkenyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkynyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkyl được thế tùy ý, carboxyalkyl được thế tùy ý (ví dụ, tùy ý được thế bằng hydroxy và /hoặc nhóm bảo vệ O), carboxyalkoxy được thế tùy ý, carboxyaminoalkyl được thế tùy ý, hoặc carbamoylalkyl được thế tùy ý (ví dụ, tùy ý được thế bằng nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây, chẳng hạn như các nhóm thế được chọn từ (1)-(21) cho alkyl), và trong đó RVàvà R12cđược lấy cùng với các nguyên tử cacbon mà chúng gắn vào có thể tạo thành xycloalkyl tùy ý, aryl được thế tùy ý, hoặc dị vòng được thế tùy ý (ví dụ, vòng 5 hoặc 6 cạnh);
- R12alà H, alkyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkenyl được thế tùy ý, hydroxyalkynyl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, carboxyalkyl được thế tùy ý (ví dụ, tùy ý được thế bằng hydroxy và/hoặc nhóm bảo vệ O) , carboxyalkoxy được thế tùy ý, carboxyaminoalkyl được thế tùy ý, carbamoylalkyl được thế tùy ý, hoặc không có;
- R12blà H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkenyl được thế tùy ý, hydroxyalkynyl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, alkaryl được thế tùy ý, dị vòng được thế tùy ý, alkheterocyclyl được thế tùy ý , axit amin được thế tùy ý, alkoxycarbonylacyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkoxy được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkenyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkynyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkoxy được thế tùy ý, carboxyalkyl được thế tùy ý (ví dụ, tùy ý được thế bằng hydroxy và/hoặc nhóm bảo vệ O), carboxyalkoxy được thế tùy ý, carboxyaminoalkyl được thế tùy ý, hoặc carbamoylalkyl được thế tùy ý,
- trong đó sự kết hợp của R12bvà T1′hoặc sự kết hợp của R12bvà R12ccó thể liên kết với nhau để tạo thành dị vòng tùy ý được thế; Và
- R12clà H, halo, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, hoặc aminoalkynyl được thế tùy ý.
Các uracil biến đổi được lấy làm ví dụ khác bao gồm các uracil có Công thức (b28)-(b31):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- mỗi T1và T2độc lập là O (oxo), S (thio) hoặc Se (seleno);
- mỗi RVb′và RVb"độc lập là H, halo, axit amin được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, haloalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkenyl được thế tùy ý, hydroxyalkynyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, tùy ý alkynyloxy được thế, aminoalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ N, như bất kỳ được mô tả ở đây, ví dụ, trifluoroacetyl, hoặc sulfoalkyl), aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, acylaminoalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng N- nhóm bảo vệ, như nhóm bất kỳ được mô tả ở đây, ví dụ, trifluoroacetyl), alkoxycarbonylalkyl tùy ý được thế, alkoxycarbonylalkenyl tùy ý được thế, alkoxycarbonylalkynyl tùy ý được thế, alkoxycarbonylalkyl tùy ý được thế, alkoxycarbonylalkyl tùy ý được thế, carboxyalkyl tùy ý được thế (ví dụ, tùy ý được thế bằng hydroxy và/hoặc O- nhóm bảo vệ), carboxyalkoxy được thế tùy ý, carboxyaminoalkyl được thế tùy ý, hoặc carbamoylalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế tùy ý bằng nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây, chẳng hạn như các nhóm thế được chọn từ (1)-(21) cho alkyl) (ví dụ, RVb′là alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, hoặc aminoalkyl được thế tùy ý, ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ N, như nhóm bất kỳ được mô tả ở đây, ví dụ, trifloaxetyl, hoặc sulfoalkyl);
- R12alà H, alkyl được thế tùy ý, carboxyaminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ N, như nhóm bất kỳ được mô tả ở đây, ví dụ, trifluoroacetyl, hoặc sulfoalkyl), aminoalkenyl được thế tùy ý, hoặc aminoalkynyl được thế tùy ý; Và
- R12blà H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkenyl được thế tùy ý, hydroxyalkynyl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ N , chẳng hạn như bất kỳ được mô tả ở đây, ví dụ, trifluoroacetyl, hoặc sulfoalkyl),
- alkoxycarbonylacyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkoxy được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkenyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkynyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkoxy được thế tùy ý, carboxyalkoxy được thế tùy ý, carboxyalkyl được thế tùy ý, hoặc carbamoylalkyl được thế tùy ý.
Theo các phương án cụ thể, T1là O (oxo) và T2là S (thio) hoặc Se (seleno). Theo các phương án khác, T1là S (thio) và T2là O (oxo) hoặc Se (seleno). Theo một số phương án, RVb′là H, alkyl được thế tùy ý, hoặc alkoxy được thế tùy ý.
Theo các phương án khác, mỗi R12avà R12bđộc lập là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hoặc hydroxyalkyl được thế tùy ý. Theo các phương án cụ thể, R12alà H. Theo các phương án khác, cả R12avà R12blà H.
Theo một số phương án, mỗi RVb′của R12bđộc lập, là aminoalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ N, như bất kỳ được mô tả ở đây, ví dụ, trifloacetyl, hoặc sulfoalkyl), aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, hoặc acylaminoalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng Nhóm bảo vệ N, như nhóm bất kỳ được mô tả ở đây, ví dụ, trifluoroacetyl). Theo một số phương án, amino và/hoặc alkyl của aminoalkyl được thế tùy ý được thế bằng một hoặc nhiều alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, sulfoalkyl được thế tùy ý, carboxy được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ O), tùy ý hydroxy được thế (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ O), carboxyalkyl tùy ý được thế (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ O), alkoxycarbonylalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ O), hoặc nhóm bảo vệ N. Theo một số phương án, aminoalkyl được thế tùy ý được thế bằng sulfoalkyl được thế tùy ý hoặc alkenyl được thế tùy ý. Theo các phương án cụ thể, R12avà RVb"đều là H. Theo các phương án cụ thể, T1là O (oxo) và T2là S (thio) hoặc Se (seleno).
Theo một số phương án, RVb′là alkoxycarbonylalkyl tùy ý được thế hoặc carbamoylalkyl tùy ý được thế.
Theo các phương án cụ thể, nhóm thế tùy chọn cho R12a, R12b, R12choặc RVàlà một nhóm polyethylen glycol (ví dụ: -(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl); hoặc nhóm amino-polyethylene glycol (ví dụ, —NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và mỗi RN1độc lập là hydro hoặc C được thay thế tùy ý1-6alkyl).
Theo một số phương án, B là cytosin được biến đổi. Cytosin biến đổi được lấy làm ví dụ bao gồm các hợp chất có công thức (b10)-(b14):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- mỗi T3′và T3"độc lập là H, alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, hoặc thioalkoxy được thế tùy ý, hoặc tổ hợp của T3′và T3"kết hợp với nhau (ví dụ như trong T3) để tạo thành O (oxo), S (thio) hoặc Se (seleno);
- mỗi V4độc lập là O, S, N(RVc)nv, hoặc C(RVc)nv, trong đó nv là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi RV.C, độc lập, là H, halo, axit amin được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, nitrocyclyl được thế tùy ý, alkheterocyclyl được thế tùy ý, hoặc alkynyloxy được thế tùy ý (ví dụ, tùy ý được thế bằng nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây, chẳng hạn như các nhóm thế được chọn từ (1)-(21) cho alkyl), trong đó hỗn hợp của R13bvà RVccó thể được sử dụng cùng nhau để tạo thành dị vòng tùy ý được thế;
- mỗi V5độc lập là N(RVd)nv, hoặc C(RVd)nv, trong đó nv là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi RVdđộc lập là H, halo, axit amin được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, nitrocyclyl được thế tùy ý, alkheterocyclyl được thế tùy ý, hoặc alkynyloxy được thế tùy ý (ví dụ, được thế tùy ý) với nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây, chẳng hạn như các nhóm thế được chọn từ (1)-(21) cho alkyl) (ví dụ, V5là —CH hoặc N);
- mỗi R13avà R13bđộc lập là H, acyl được thế tùy ý, axyloxyalkyl được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, hoặc alkoxy được thế tùy ý, trong đó hỗn hợp của R13bvà R14có thể được sử dụng cùng nhau để tạo thành dị vòng tùy ý được thế;
- mỗi R14độc lập là H, halo, hydroxy, thiol, acyl được thế tùy ý, axit amin được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, haloalkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ O ), hydroxyalkenyl được thế tùy ý, hydroxyalkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, axyloxyalkyl được thế tùy ý, amino được thế tùy ý (ví dụ, —NHR, trong đó R là H, alkyl, aryl, hoặc phosphoryl), azido, aryl được thế tùy ý, dị vòng được thế tùy ý, alkheterocyclyl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, hoặc aminoalkyl được thế tùy ý; Và
- mỗi R15và R16độc lập là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, hoặc alkynyl được thế tùy ý.
Các cytosin biến đổi được lấy làm ví dụ khác bao gồm các cytosin có Công thức (b32)-(b35):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- mỗi T1và T3độc lập là O (oxo), S (thio) hoặc Se (seleno);
- mỗi R13avà R13bđộc lập là H, acyl được thế tùy ý, axyloxyalkyl được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, hoặc alkoxy được thế tùy ý, trong đó hỗn hợp của R13bvà R14có thể được sử dụng cùng nhau để tạo thành dị vòng tùy ý được thế;
- mỗi R14độc lập là H, halo, hydroxy, thiol, acyl được thế tùy ý, axit amin được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, haloalkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ O ), hydroxyalkenyl được thế tùy ý, hydroxyalkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, axyloxyalkyl được thế tùy ý, amino được thế tùy ý (ví dụ, —NHR, trong đó R là H, alkyl, aryl, hoặc phosphoryl), azido, aryl được thế tùy ý, dị vòng được thế tùy ý, alkheterocyclyl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý (ví dụ, hydroxyalkyl, alkyl, alkenyl, hoặc alkynyl), aminoalkenyl được thế tùy ý, hoặc aminoalkynyl được thế tùy ý; Và
- mỗi R15và R16độc lập là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, hoặc alkynyl được thế tùy ý (ví dụ, R15là H và R16là H hoặc alkyl được thế tùy ý).
Theo một số phương án, R15là H và R16là H hoặc alkyl được thế tùy ý. Theo các phương án cụ thể, R14là H, acyl hoặc hydroxyalkyl. Theo một số phương án, R14là hào quang. Theo một số phương án, cả R14và R15là H. Theo một số phương án, cả R15và R16là H. Theo một số phương án, mỗi R14và R15và R16là H. Theo các phương án khác, mỗi R13avà R13bđộc lập là H hoặc alkyl được thế tùy ý.
Các ví dụ không giới hạn khác về cytosin biến đổi bao gồm các hợp chất có công thức (b36):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- mỗi R13bđộc lập là H, acyl được thế tùy ý, axyloxyalkyl được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, hoặc alkoxy được thế tùy ý, trong đó hỗn hợp của R13bvà R14bcó thể được sử dụng cùng nhau để tạo thành dị vòng tùy ý được thế;
- mỗi R14avà R14bđộc lập là H, halo, hydroxy, thiol, acyl được thế tùy ý, axit amin được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, haloalkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý (ví dụ, được thế bằng nhóm bảo vệ O ), hydroxyalkenyl được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, alkynyloxy được thế tùy ý, aminoalkoxy được thế tùy ý, alkoxyalkoxy được thế tùy ý, axyloxyalkyl được thế tùy ý, amino tùy ý được thế (ví dụ, —NHR, trong đó R là H, alkyl, aryl, phosphoryl, aminoalkyl được thế tùy ý, hoặc carboxyaminoalkyl được thế tùy ý), azido, aryl được thế tùy ý, dị vòng được thế tùy ý, alkheterocyclyl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, hoặc aminoalkynyl được thế tùy ý; Và
- mỗi R15độc lập là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, hoặc alkynyl được thế tùy ý.
Theo các phương án cụ thể, R14blà axit amin được thế tùy ý (ví dụ, lysin được thế tùy ý). Theo một số phương án, R14alà H
Theo một số phương án, B là guanin biến đổi. Guanin biến đổi được lấy làm ví dụ bao gồm các hợp chất có công thức (b15)-(b17):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- mỗi T4', T4", T5′, T5", T6′và T6"độc lập là H, alkyl được thế tùy ý, hoặc alkoxy được thế tùy ý, và trong đó hỗn hợp của T4'và T4"(ví dụ như trong T4) hoặc sự kết hợp của T5′và T5"(ví dụ như trong T5) hoặc sự kết hợp của T6′và T6"(ví dụ như trong T6) liên kết với nhau tạo thành O (oxo), S (thio), hoặc Se (seleno);
- mỗi V5và V6độc lập là O, S, N(RVd)nv, hoặc C(RVd)nv, trong đó nv là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi RVdđộc lập là H, halo, thiol, axit amin được thế tùy ý, cyano, amidine, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý , hoặc alkynyloxy được thế tùy ý (ví dụ, tùy ý được thế bằng nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây, chẳng hạn như các nhóm thế được chọn từ (1)-(21) cho alkyl), thioalkoxy được thế tùy ý, hoặc amino được thế tùy ý; Và
- mỗi R17, R18, R19a, R19b, R21, R22, R23và R24độc lập là H, halo, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, amino được thế tùy ý, hoặc axit amin được thế tùy ý.
Guanosin biến đổi được lấy làm ví dụ bao gồm các hợp chất có công thức (b37)-(b40):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- mỗi T4'độc lập là H, alkyl được thế tùy ý, hoặc alkoxy được thế tùy ý, và mỗi T4độc lập là O (oxo), S (thio) hoặc Se (seleno);
- mỗi R18, R19a, R19bvà R21độc lập là H, halo, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, amino được thế tùy ý, hoặc axit amin được thế tùy ý.
Theo một số phương án, R18là H hoặc alkyl được thế tùy ý. Theo các phương án khác, T4là oxo. Theo một số phương án, mỗi R19avà R19bđộc lập là H hoặc alkyl được thế tùy ý.
Theo một số phương án, B là adenin được biến đổi. Các adenin biến đổi được lấy làm ví dụ bao gồm các hợp chất có công thức (b18)-(b20):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- mỗi V7độc lập là O, S, N(RĐã)nv, hoặc C(RĐã)nv, trong đó nv là số nguyên từ 0 đến 2 và mỗi RĐãđộc lập là H, halo, axit amin được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkenyloxy được thế tùy ý, hoặc alkynyloxy được thế tùy ý (ví dụ, tùy ý được thế bằng nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây, chẳng hạn như những chất được chọn từ (1)-(21) cho alkyl);
- mỗi R25độc lập là H, halo, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, hoặc amino được thế tùy ý;
- mỗi R26avà R26bđộc lập là H, acyl được thế tùy ý, axit amin được thế tùy ý, carbamoylalkyl được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkenyl được thế tùy ý, hydroxyalkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, hoặc polyethylene glycol nhóm (ví dụ: —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl); hoặc nhóm amino-polyethylene glycol (ví dụ, —NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và mỗi RN1độc lập là hydro hoặc C được thay thế tùy ý1-6alkyl);
- mỗi R27độc lập là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý hoặc amino được thế tùy ý;
- mỗi R28độc lập là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, hoặc alkynyl được thế tùy ý; Và
- mỗi R29độc lập là H, acyl được thế tùy ý, axit amin được thế tùy ý, carbamoylalkyl được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkenyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, hoặc amino được thế tùy ý.
Các adenin biến đổi được lấy làm ví dụ bao gồm các hợp chất có công thức (b41)-(b43):
hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của nó,
-
- trong đó
- mỗi R25độc lập là H, halo, thiol, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, hoặc amino được thế tùy ý;
- mỗi R26avà R26bđộc lập là H, acyl được thế tùy ý, axit amin được thế tùy ý, carbamoylalkyl được thế tùy ý, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, hydroxyalkyl được thế tùy ý, hydroxyalkenyl được thế tùy ý, hydroxyalkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, hoặc polyethylene glycol nhóm (ví dụ: —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl); hoặc nhóm amino-polyethylene glycol (ví dụ, —NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và mỗi RN1độc lập là hydro hoặc C được thay thế tùy ý1-6alkyl); Và
- mỗi R27độc lập là H, alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, thioalkoxy được thế tùy ý, hoặc amino được thế tùy ý.
Theo một số phương án, R26alà H và R26blà alkyl được thế tùy ý. Theo một số phương án, mỗi R26avà R26bđộc lập, là alkyl được thế tùy ý. Theo các phương án cụ thể, R27là alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, hoặc thioalkoxy được thế tùy ý. Theo các phương án khác, R25là alkyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, hoặc thioalkoxy được thế tùy ý.
Theo các phương án cụ thể, nhóm thế tùy chọn cho R26a, R26bhoặc R29là một nhóm polyethylen glycol (ví dụ: -(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl); hoặc nhóm amino-polyethylene glycol (ví dụ, —NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và mỗi RN1độc lập là hydro hoặc C được thay thế tùy ý1-6alkyl).
Theo một số phương án, B có thể có Công thức (b21):
trong đó X12độc lập là O, S, alkylene được thế tùy ý (ví dụ, methylene), hoặc Heteroalkylene được thế tùy ý, xa là số nguyên từ 0 đến 3, và R12avà T2như được mô tả ở đây.
Theo một số phương án, B có thể có Công thức (b22):
trong đó R10′độc lập, là alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, aryl được thế tùy ý, dị vòng được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkenyl được thế tùy ý, tùy ý được thế alkoxycarbonylalkynyl, alkoxycarbonylalkoxy được thế tùy ý, carboxyalkoxy được thế tùy ý, carboxyalkyl được thế tùy ý, hoặc carbamoylalkyl được thế tùy ý, và R11, R12a, T1và T2như được mô tả ở đây.
Theo một số phương án, B có thể có Công thức (b23):
trong đó R10là dị vòng được thế tùy ý (ví dụ, furyl được thế tùy ý, thienyl được thế tùy ý, hoặc pyrrolyl được thế tùy ý), aryl được thế tùy ý (ví dụ, phenyl được thế tùy ý hoặc naphthyl được thế tùy ý), hoặc nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây (ví dụ, đối với R10); và trong đó R11(ví dụ: H hoặc nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây), R12a(ví dụ: H hoặc nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây), T1(ví dụ, oxo hoặc nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây) và T2(ví dụ, oxo hoặc nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây) đều như được mô tả ở đây. Theo một số phương án, B có thể có Công thức (b24):
trong đó R14′độc lập, là alkyl được thế tùy ý, alkenyl được thế tùy ý, alkynyl được thế tùy ý, aryl được thế tùy ý, dị vòng được thế tùy ý, alkaryl được thế tùy ý, alkheterocyclyl được thế tùy ý, aminoalkyl được thế tùy ý, aminoalkenyl được thế tùy ý, aminoalkynyl được thế tùy ý, alkoxy được thế tùy ý, được thế tùy ý alkoxycarbonylalkenyl, alkoxycarbonylalkynyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkyl được thế tùy ý, alkoxycarbonylalkoxy được thế tùy ý, carboxyalkoxy được thế tùy ý, carboxyalkyl được thế tùy ý, hoặc carbamoylalkyl được thế tùy ý, và R13a, R13b, R15và T3như được mô tả ở đây.
Theo một số phương án, B có thể có Công thức (b25):
trong đó R14′là dị vòng được thế tùy ý (ví dụ, furyl được thế tùy ý, thienyl được thế tùy ý, hoặc pyrrolyl được thế tùy ý), aryl được thế tùy ý (ví dụ, phenyl được thế tùy ý hoặc naphthyl được thế tùy ý), hoặc nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây (ví dụ, đối với R14hoặc R14′); và trong đó R13a(ví dụ: H hoặc nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây), R13b(ví dụ: H hoặc nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây), R15(ví dụ: H hoặc nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây) và T3(ví dụ, oxo hoặc nhóm thế bất kỳ được mô tả ở đây) đều như được mô tả ở đây.
Theo một số phương án, B là nucleobase được chọn từ nhóm bao gồm cytosine, guanine, adenine, và uracil. Theo một số phương án, B có thể là:
Theo một số phương án, nucleobase được cải biến là uracil được cải biến. Các nucleobase và nucleoside ví dụ có uracil biến đổi bao gồm pseudouridine (ψ), pyridin-4-one ribonucleoside, 5-aza-uridine, 6-aza-uridine, 2-thio-5-aza-uridine, 2-thio-uridine (s2U), 4-thio-uridine (s4U), 4-thio-pseudouridin, 2-thio-pseudouridin, 5-hydroxy-uridine (ho5U), 5-aminoallyl-uridine, 5-halo-uridine (ví dụ, 5-iodo-uridine hoặc 5-bromo-uridine), 3-metyl-uridine (m3U), 5-metoxy-uridine (mo5U), axit uridine 5-oxyacetic (cmo5U), este metyl axit uridine 5-oxyacetic (mcmo5U), 5-carboxymetyl-uridine (cm5U), 1-carboxymetyl-pseudouridin, 5-carboxyhydroxymetyl-uridine (chm5U), este metyl 5-carboxyhydroxymetyl-uridine (mchm5U), 5-metoxycacbonylmetyl-uridin (mcm5U), 5-metoxycarbonylmetyl-2-thio-uridine (mcm5s2U), 5-aminometyl-2-thio-uridine (nm5s2U), 5-metylaminometyl-uridin (mnm5U), 5-metylaminometyl-2-thio-uridine (mnm5s2U), 5-metylaminometyl-2-seleno-uridine (mnm5với2U), 5-carbamoylmetyl-uridin (ncm5U), 5-carboxymetylaminometyl-uridin (cmnm5U), 5-carboxymetylaminometyl-2-thio-uridin (cmnm5s2U), 5-propynyl-uridine, 1-propynyl-pseudouridine, 5-taurinomethyl-uridine (τm5U), 1-taurinometyl-pseudouridin, 5-taurinometyl-2-thio-uridine(m5S2U), 1-taurinometyl-4-thio-pseudouridine, 5-metyl-uridine (m5U, tức là có nucleobase deoxythymine), 1-methylpseudouridine (m1ψ), 5-metyl-2-thio-uridine (m5S2U), 1-metyl-4-thio-pseudouridin (m1S4ψ), 4-thio-1-metyl-pseudouridin, 3-metyl-pseudouridin (m3ψ), 2-thio-1-metyl-pseudouridin, 1-metyl-1-deaza-pseudouridin, 2-thio-1-metyl-1-deaza-pseudouridin, dihydrouridine (D), dihydropseudouridin, 5,6-dihydrouridine, 5-metyl-dihydrouridine (m5D), 2-thio-dihydrouridine, 2-thio-dihydropseudouridin, 2-metoxy-uridine, 2-metoxy-4-thio-uridine, 4-metoxy-pseudouridine, 4-metoxy-2-thio-pseudouridine, N1-metyl -pseudouridine (còn được gọi là 1-methylpseudouridine (m1ψ)), uridine 3-(3-amino-3-carboxypropyl)uridine (acp3U), 1-metyl-3-(3-amino-3-carboxypropyl)pseudouridin (acp3ψ), 5-(isopentenylaminometyl)uridine (inm5U), 5-(isopentenylaminometyl)-2-thio-uridine (inm5s2U), α-thio-uridine, 2′-O-metyl-uridine (Urn), 5,2′-O-dimethyl-uridine (m5Um), 2′-O-metyl-pseudouridin (ψm), 2-thio-2′-O-metyl-uridine (s2Um), 5-metoxycarbonylmetyl-2′-O-metyl-uridine (mcm5Um), 5-carbamoylmetyl-2′-O-metyl-uridine (ncm5Um), 5-carboxymetylaminometyl-2′-O-metyl-uridin (cmnm5Um), 3,2′-O-dimetyl-uridine (m3Um), 5-(isopentenylaminometyl)-2′-O-metyl-uri din (inm5Um), 1-thio-uridine, deoxythymidine, 2′-F-ara-uridine, 2′-F-uridine, 2′-OH-ara-uridine, 5-(2-carbomethoxyvinyl) uridine, và 5-[3 -(1-E-propenylamino)uridine.
Theo một số phương án, nucleobase được cải biến là cytosin được cải biến. Các nucleobase và nucleoside ví dụ có cytosine biến đổi bao gồm 5-aza-cytidine, 6-aza-cytidine, pseudoisocytidine, 3-metyl-cytidine (m3C), N4-acetyl-cytidin (ac4C), 5-formyl-cytidine (f5C), N4-metyl-cytidin (m4C), 5-metyl-cytidin (m5C), 5-halo-cytidine (ví dụ, 5-iodo-cytidine), 5-hydroxymethyl-cytidine (hm5C), 1-metyl-pseudoisocytidine, pyrrolo-cytidine, pyrrolo-pseudoisocytidine, 2-thio-cytidine (s2C), 2-thio-5-metyl-cytidin, 4-thio-pseudoisocytidin, 4-thio-1-metyl-pseudoisocytidin, 4-thio-1-metyl-1-deaza-pseudoisocytidin, 1-metyl-1-deaza -pseudoisocytidine, zebularine, 5-aza-zebularine, 5-methyl-zebularine, 5-aza-2-thio-zebularine, 2-thio-zebularine, 2-methoxy-cytidine, 2-methoxy-5-methyl-cytidine, 4 -metoxy-pseudoisocytidin, 4-metoxy-1-metyl-pseudoisocytidin, lysidin (k2C), α-thio-cytidine, 2′-O-methyl-cytidine (Cm), 5,2′-O-dimethyl-cytidine (m5Cm), N4-axetyl-2′-O-metyl-cytidin (ac4Cm), N4,2′-O-dimetyl-cytidin (m4Cm), 5-formyl-2′-O-metyl-cytidin (f5Cm), N4,N4,2′-0-trimetyl-cytidin (m42Cm), 1-thio-cytidine, 2′-F-ara-cytidine, 2′-F-cytidine, và 2′-OH-ara-cytidine.
Theo một số phương án, nucleobase được biến đổi là adenin được biến đổi. Các nucleobase và nucleoside ví dụ có adenin biến đổi bao gồm 2-amino-purine, 2,6-diaminopurine, 2-amino-6-halo-purine (ví dụ, 2-amino-6-clo-purine), 6-halo-purine ( ví dụ: 6-chloro-purine), 2-amino-6-methyl-purine, 8-azido-adenosine, 7-deaza-adenine, 7-deaza-8-aza-adenine, 7-deaza-2-amino-purine , 7-deaza-8-aza-2-amino-purine, 7-deaza-2,6-diaminopurine, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurine, 1-metyl-adenosine (m1A), 2-metyl-adenin (m2A), N6-metyl-adenosine (m6A), 2-metylthio-N6-metyl-adenosine (ms2tôi6A), N6-isopentenyl-adenosine (i6A), 2-metylthio-N6-isopentenyl-adenosine (ms2Tôi6A), N6-(cis-hydroxyisopentenyl)adenosine (io6A), 2-metylthio-N6-(cis-hydroxyisopentenyl)adenosine (ms2io6A), N6-glycinylcarbamoyl-adenosine (g6A), N6-threonylcarbamoyl-adenosine (t6A), N6-metyl-N6-threonylcarbamoyl-adenosine (m6t6A), 2-metylthio-N6-threonylcarbamoyl-adenosine (ms2g6A), N6,N6-dimetyl-adenosin (m62A), N6-hydroxynorvalylcarbamoyl-adenosin (hn6A), 2-metylthio-N6-hydroxynorvalylcarbamoyl-adenosine (ms2hn6A), N6-acetyl-adenosine (ac6A), 7-metyl-adenin, 2-metylthio-adenin, 2-metoxy-adenin, α-thio-adenosin, 2′-O-metyl-adenosin (Am), N6,2′-O-dimetyl-adenosin ( tôi6Am), N6,N6,2′-O-trimetyl-adenosine (m62Am), 1,2′-O-dimetyl-adenosine (m1Am), 2′-O-ribosyladenosine (photphat) (Ar(p)), 2-amino-N6-metyl-purine, 1-thio-adenosine, 8-azido-adenosine, 2′-F-ara-adenosine, 2′-F-adenosine, 2′-OH-ara-adenosine và N6-(19-amino-pentaoxanonadecyl)-adenosine.
Theo một số phương án, nucleobase được cải biến là guanin được cải biến. Các nucleobase và nucleoside ví dụ có guanin biến đổi bao gồm inosin (I), 1-metyl-inosine (m1I), wyosine (imG), methylwyosine (mimG), 4-demethyl-wyosine (imG-14), isowyosine (imG2), wybutosine (yW), peroxywybutosine (o2yW), hydroxywybutosine (OHyW), hydroxywybutosine chưa được biến đổi (OHyW*), 7-deaza-guanosine, queuosine (Q), epoxyqueuosine (oQ), galactosyl-queuosine (galQ), mannosyl-queuosine (manQ), 7-cyano-7 -deaza-guanosine (preQ0), 7-aminomethyl-7-deaza-guanosine (preQ1), Archaeosine (G+), 7-deaza-8-aza-guanosine, 6-thio-guanosine, 6-thio-7-deaza-guanosine, 6-thio-7-deaza-8-aza-guanosine, 7-metyl-guanosine (m7G), 6-thio-7-metyl-guanosin, 7-metyl-inosin, 6-metoxy-guanosin, 1-metyl-guanosin (m1G), N2-metyl-guanosine (m2G), N2,N2-dimetyl-guanosin (m22G), N2,7-dimetyl-guanosin (m2,7G), N2,N2,7-dimetyl-guanosin (m2,2,7G), 8-oxo-guanosin, 7-metyl-8-oxo-guanosin, 1-metyl-6-thio-guanosin, N2-metyl-6-thio-guanosin, N2,N2-dimetyl-6-thio-guanosin , α-thio-guanosine, 2′-O-metyl-guanosine (Gm), N2-metyl-2′-O-metyl-guanosine (m2Gm), N2,N2-dimetyl-2′-O-metyl-guanosin (m22Gm), 1-metyl-2′-O-metyl-guanosin (m1Gm), N2,7-dimetyl-2′-O-metyl-guanosin (m2,7Gm), 2′-O-metyl-inosine (Im), 1,2′-O-dimethyl-inosine (m1Im), và 2′-O-ribosylguanosine (photphat) (Gr(p)).
nucleobase của nucleotide có thể được chọn độc lập từ purine, pyrimidine, chất tương tự purine hoặc pyrimidine. Ví dụ, mỗi nucleobase có thể được chọn độc lập từ adenine, cytosine, guanine, uracil, hoặc hypoxanthine. Theo một phương án khác, nucleobase cũng có thể bao gồm, ví dụ, các dẫn xuất tự nhiên và tổng hợp của bazơ, bao gồm pyrazolo[3,4-d]pyrimidine, 5-metylcytosin (5-me-C), 5-hydroxymetyl cytosin, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, 6-methyl và các dẫn xuất alkyl khác của adenine và guanine, 2-propyl và các dẫn xuất alkyl khác của adenine và guanine, 2-thiouracil, 2-thiothymine và 2-thiocytosine, 5-propynyl uracil và cytosine , 6-azo uracil, cytosine và thymine, 5-uracil (pseudouracil), 4-thiouracil, 8-halo (ví dụ: 8-bromo), 8-amino, 8-thiol, 8-thioalkyl, 8-hydroxyl và 8 loại khác -các adenin và guanin được thế, 5-halo, đặc biệt là 5-bromo, 5-trifluoromethyl và các uracil và cytosine được thế 5 khác, 7-methylguanine và 7-methyladenine, 8-azaguanine và 8-azaadenine, deazaguanine, 7-deazaguanine, 3- deazaguanin, deazaadenine, 7-deazaadenine, 3-deazaadenine, pyrazolo[3,4-d]pyrimidine, imidazo[1,5-a]1,3,5 triazinon, 9-deazapurin, imidazo[4,5-d]pyrazine , thiazolo[4,5-d]pyrimidine, pyrazin-2-ones, 1,2,4-triazine, pyridazine; và 1,3,5 triazine. Khi các nucleotit được mô tả bằng cách viết tắt A, G, C, T hoặc U, mỗi chữ cái đề cập đến bazơ đại diện và/hoặc dẫn xuất của chúng, ví dụ, A bao gồm adenine hoặc các chất tương tự adenine, ví dụ, 7-deaza adenine).
Sửa đổi liên kết Internucleoside
Các nucleotit biến đổi, có thể được kết hợp vào polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc phân tử mmRNA, có thể được biến đổi trên liên kết internucleoside (ví dụ, xương sống phosphat). Ở đây, trong phạm vi khung polynucleotit, cụm từ “photphat” và “photphodiester” được sử dụng thay thế cho nhau. Các nhóm photphat xương sống có thể được sửa đổi bằng cách thay thế một hoặc nhiều nguyên tử oxy bằng một nhóm thế khác. Hơn nữa, nucleoside và nucleoside biến đổi có thể bao gồm việc thay thế toàn bộ gốc phosphat không biến đổi bằng một liên kết internucleoside khác như được mô tả ở đây. Ví dụ về các nhóm photphat biến đổi bao gồm, nhưng không giới hạn ở, photphorothioat, photphoroselenat, borano photphat, este borano photphat, hydro photphat, photphoramidat, photphođiamidat, alkyl hoặc aryl photphat, và photphotester. Phosphorodithioate có cả oxy không liên kết được thay thế bằng lưu huỳnh. Chất liên kết photphat cũng có thể được biến đổi bằng cách thay thế oxy liên kết bằng nitơ (phosphoramidat cầu nối), lưu huỳnh (phosphorothioat cầu nối) và cacbon (methylene-phosphonate cầu nối).
Phần photphat thay thế α-thio được cung cấp để mang lại sự ổn định cho các polyme RNA và DNA thông qua các liên kết xương sống photphorothioate không tự nhiên. DNA và RNA Phosphorothioate có khả năng kháng nuclease tăng lên và do đó có thời gian bán hủy dài hơn trong môi trường tế bào. Các polynucleotide liên kết với photphorothioate, cấu trúc sơ cấp hoặc phân tử mmRNA được cho là cũng sẽ làm giảm phản ứng miễn dịch bẩm sinh thông qua khả năng liên kết/kích hoạt yếu hơn của các phân tử miễn dịch bẩm sinh của tế bào.
Theo các phương án cụ thể, nucleoside biến đổi bao gồm alpha-thio-nucleoside (ví dụ, 5′-O-(1-thiophotphat)-adenosin, 5′-O-(1-thiophotphat)-cytidin (α-thio-cytidin), 5′-O-(1-thiophosphate)-guanosine, 5′-O-(1-thiophosphate)-uridine, hoặc 5′-O-(1-thiophosphate)-pseudouridine).
Các liên kết internucleoside khác có thể được sử dụng theo sáng chế, bao gồm các liên kết internucleoside không chứa nguyên tử phospho, được mô tả dưới đây.
Sự kết hợp của đường biến đổi, nucleobase và liên kết internucleoside
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmARN theo sáng chế có thể bao gồm tổ hợp các dạng biến đổi đường, nucleobase, và/hoặc liên kết internucleoside. Những kết hợp này có thể bao gồm bất kỳ một hoặc nhiều sửa đổi nào được mô tả ở đây. Ví dụ, nucleotit bất kỳ được mô tả ở đây có các công thức (Ia), (Ia-1)-(Ia-3), (Ib)-(If), (IIa)-(IIp), (IIb-1), ( IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IV1), và (IXa)-(IXr) có thể được kết hợp với bất kỳ của các nucleobase được mô tả ở đây (ví dụ, trong các công thức (b1)-(b43) hoặc bất kỳ công thức nào khác được mô tả ở đây).
Tổng hợp các polypeptide, cấu trúc sơ cấp và phân tử mmRNA
Polypeptit, cấu trúc bậc một, và phân tử mmARN để sử dụng theo sáng chế có thể được điều chế theo kỹ thuật hữu ích bất kỳ, như được mô tả ở đây. Các nucleoside và nucleoside biến đổi được sử dụng trong quá trình tổng hợp các polynucleotit, cấu trúc bậc một, và các phân tử mmRNA bộc lộ ở đây có thể được điều chế từ các nguyên liệu ban đầu sẵn có bằng cách sử dụng các phương pháp và quy trình chung sau đây. Khi cung cấp các điều kiện quy trình điển hình hoặc ưu tiên (ví dụ: nhiệt độ phản ứng, thời gian, tỷ lệ mol của chất phản ứng, dung môi, áp suất, v.v.), một nghệ nhân lành nghề sẽ có thể tối ưu hóa và phát triển các điều kiện quy trình bổ sung. Các điều kiện phản ứng tối ưu có thể khác nhau tùy theo chất phản ứng hoặc dung môi cụ thể được sử dụng, nhưng những điều kiện như vậy có thể được xác định bởi người có hiểu biết trung bình trong lĩnh vực này bằng các quy trình tối ưu hóa thông thường.
Các quy trình được mô tả ở đây có thể được theo dõi theo phương pháp thích hợp bất kỳ đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Ví dụ, sự hình thành sản phẩm có thể được theo dõi bằng phương pháp quang phổ, chẳng hạn như quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (ví dụ,1H hoặc13C) quang phổ hồng ngoại, quang phổ kế (ví dụ, tia cực tím nhìn thấy được), hoặc khối phổ, hoặc bằng sắc ký như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc sắc ký lớp mỏng.
Việc điều chế các polypeptit, cấu trúc bậc một, và các phân tử mmRNA theo sáng chế có thể liên quan đến việc bảo vệ và khử bảo vệ các nhóm hóa học khác nhau. Nhu cầu bảo vệ và hủy bảo vệ cũng như việc lựa chọn các nhóm bảo vệ thích hợp có thể được xác định dễ dàng bởi chuyên gia trong lĩnh vực này. Tính chất hóa học của các nhóm bảo vệ có thể được tìm thấy, ví dụ, ở Greene và cộng sự,Nhóm bảo vệ trong tổng hợp hữu cơ,2d. Ed., Wiley & Sons, 1991, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Các phản ứng của các quy trình được mô tả ở đây có thể được thực hiện trong các dung môi thích hợp, có thể được lựa chọn dễ dàng bởi một trong những người có kỹ năng trong lĩnh vực tổng hợp hữu cơ. Các dung môi thích hợp về cơ bản có thể không phản ứng với nguyên liệu ban đầu (chất phản ứng), chất trung gian hoặc sản phẩm ở nhiệt độ mà phản ứng được thực hiện, tức là nhiệt độ có thể nằm trong khoảng từ nhiệt độ đóng băng của dung môi đến nhiệt độ sôi của dung môi. Một phản ứng nhất định có thể được thực hiện trong một dung môi hoặc hỗn hợp của nhiều dung môi. Tùy thuộc vào bước phản ứng cụ thể, có thể chọn dung môi thích hợp cho bước phản ứng cụ thể.
Việc phân giải hỗn hợp racemic của nucleoside và nucleotit biến đổi có thể được thực hiện bằng phương pháp bất kỳ trong số nhiều phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Một phương pháp ví dụ bao gồm quá trình kết tinh lại phân đoạn bằng cách sử dụng “axit phân giải bất đối” là một axit hữu cơ tạo muối, có hoạt tính quang học. Các chất phân giải thích hợp cho phương pháp tái kết tinh phân đoạn là, ví dụ, các axit có hoạt tính quang học, như dạng D và L của axit tartaric, axit diaxetylttartaric, axit dibenzoyltartaric, axit mandelic, axit malic, axit lactic hoặc các axit camphorsulfonic có hoạt tính quang học khác nhau. Việc phân giải hỗn hợp chủng tộc cũng có thể được thực hiện bằng cách rửa giải trên cột được nhồi chất phân giải có hoạt tính quang học (ví dụ, dinitrobenzoylphenylglycine). Thành phần dung môi rửa giải thích hợp có thể được xác định bởi chuyên gia trong lĩnh vực kỹ thuật này. Các nucleoside và nucleotide biến đổi (ví dụ, các phân tử khối xây dựng) có thể được điều chế theo các phương pháp tổng hợp được mô tả trong Ogata và cộng sự, J. Org. Chem. 74:2585-2588 (2009); Purmal và cộng sự, Nucl. Axit Res. 22(1): 72-78, (1994); f*ckuhara và cộng sự, Hóa sinh, 1(4): 563-568 (1962); và Xu và cộng sự, Tứ diện, 48(9): 1729-1740 (1992), mỗi trong số đó được kết hợp toàn bộ bằng cách tham chiếu.
Các polypeptit, cấu trúc bậc một, và mmARN theo sáng chế có thể được biến đổi đồng nhất hoặc không dọc theo toàn bộ chiều dài của phân tử. Ví dụ, một hoặc nhiều hoặc tất cả các loại nucleotit (ví dụ, purine hoặc pyrimidine, hoặc một hoặc nhiều hoặc tất cả các loại A, G, U, C) có thể hoặc không thể được biến đổi đồng nhất trong polynucleotit theo sáng chế, hoặc trong vùng trình tự xác định trước của chúng (ví dụ: một hoặc nhiều vùng trình tự được biểu thị trong
Các dạng biến đổi đường, biến đổi nucleotide khác nhau và/hoặc các liên kết internucleoside (ví dụ, các cấu trúc xương sống) có thể tồn tại ở các vị trí khác nhau trong polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA. Người có hiểu biết trung bình trong lĩnh vực kỹ thuật này sẽ đánh giá cao rằng các chất tương tự nucleotit hoặc (các) biến đổi khác có thể nằm ở (các) vị trí bất kỳ của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN sao cho chức năng của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN không hề giảm đi đáng kể. Một sửa đổi cũng có thể là một sửa đổi đầu cuối 5′ hoặc 3′. Polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA có thể chứa từ khoảng 1% đến khoảng 100% các nucleotit biến đổi (liên quan đến hàm lượng nucleotit tổng thể, hoặc liên quan đến một hoặc nhiều loại nucleotit, tức là một hoặc nhiều loại A, G, U hoặc C) hoặc bất kỳ tỷ lệ phần trăm can thiệp nào (ví dụ: từ 1% đến 20%, từ 1% đến 25%, từ 1% đến 50%, từ 1% đến 60%, từ 1% đến 70%, từ 1% đến 80%, từ 1% đến 90%, từ 1% đến 95%, từ 10% đến 20%, từ 10% đến 25%, từ 10% đến 50%, từ 10% đến 60%, từ 10% đến 70 %, từ 10% đến 80%, từ 10% đến 90%, từ 10% đến 95%, từ 10% đến 100%, từ 20% đến 25%, từ 20% đến 50%, từ 20% đến 60% , từ 20% đến 70%, từ 20% đến 80%, từ 20% đến 90%, từ 20% đến 95%, từ 20% đến 100%, từ 50% đến 60%, từ 50% đến 70%, từ 50% đến 80%, từ 50% đến 90%, từ 50% đến 95%, từ 50% đến 100%, từ 70% đến 80%, từ 70% đến 90%, từ 70% đến 95%, từ 70% đến 100%, từ 80% đến 90%, từ 80% đến 95%, từ 80% đến 100%, từ 90% đến 95%, từ 90% đến 100% và từ 95% đến 100%).
Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm pyrimidine được biến đổi (ví dụ, uracil/uridine/U được biến đổi hoặc cytosine/cytidine/C được biến đổi). Theo một số phương án, uracil hoặc uridine (thường là: U) trong polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc phân tử mmRNA có thể được thay thế bằng từ khoảng 1% đến khoảng 100% uracil biến đổi hoặc uridine biến đổi (ví dụ, từ 1% đến 20). %, từ 1% đến 25%, từ 1% đến 50%, từ 1% đến 60%, từ 1% đến 70%, từ 1% đến 80%, từ 1% đến 90%, từ 1% đến 95% , từ 10% đến 20%, từ 10% đến 25%, từ 10% đến 50%, từ 10% đến 60%, từ 10% đến 70%, từ 10% đến 80%, từ 10% đến 90%, từ 10% đến 95%, từ 10% đến 100%, từ 20% đến 25%, từ 20% đến 50%, từ 20% đến 60%, từ 20% đến 70%, từ 20% đến 80%, từ 20% đến 90%, từ 20% đến 95%, từ 20% đến 100%, từ 50% đến 60%, từ 50% đến 70%, từ 50% đến 80%, từ 50% đến 90%, từ 50 % đến 95%, từ 50% đến 100%, từ 70% đến 80%, từ 70% đến 90%, từ 70% đến 95%, từ 70% đến 100%, từ 80% đến 90%, từ 80% đến 95%, từ 80% đến 100%, từ 90% đến 95%, từ 90% đến 100%, và từ 95% đến 100% của uracil biến đổi hoặc uridine biến đổi). Uracil hoặc uridine cải biến có thể được thay thế bằng hợp chất có cấu trúc đơn nhất hoặc bằng nhiều hợp chất có cấu trúc khác nhau (ví dụ, 2, 3, 4 hoặc nhiều cấu trúc đơn nhất, như được mô tả ở đây). Theo một số phương án, cytosine hoặc cytidine (thường là: C) trong polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc phân tử mmRNA có thể được thay thế bằng từ khoảng 1% đến khoảng 100% cytosine được biến đổi hoặc cytidine được biến đổi (ví dụ, từ 1% đến 20). %, từ 1% đến 25%, từ 1% đến 50%, từ 1% đến 60%, từ 1% đến 70%, từ 1% đến 80%, từ 1% đến 90%, từ 1% đến 95% , từ 10% đến 20%, từ 10% đến 25%, từ 10% đến 50%, từ 10% đến 60%, từ 10% đến 70%, từ 10% đến 80%, từ 10% đến 90%, từ 10% đến 95%, từ 10% đến 100%, từ 20% đến 25%, từ 20% đến 50%, từ 20% đến 60%, từ 20% đến 70%, từ 20% đến 80%, từ 20% đến 90%, từ 20% đến 95%, từ 20% đến 100%, từ 50% đến 60%, từ 50% đến 70%, từ 50% đến 80%, từ 50% đến 90%, từ 50 % đến 95%, từ 50% đến 100%, từ 70% đến 80%, từ 70% đến 90%, từ 70% đến 95%, từ 70% đến 100%, từ 80% đến 90%, từ 80% đến 95%, từ 80% đến 100%, từ 90% đến 95%, từ 90% đến 100%, và từ 95% đến 100% của cytosine biến đổi hoặc cytidine biến đổi). Cytosin hoặc cytidin cải biến có thể được thay thế bằng hợp chất có cấu trúc đơn nhất hoặc bằng nhiều hợp chất có cấu trúc khác nhau (ví dụ, 2, 3, 4 hoặc nhiều cấu trúc đơn nhất, như được mô tả ở đây). Theo một số phương án, sáng chế đề xuất các phương pháp tổng hợp polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, vùng thứ nhất, vùng sườn thứ nhất, hoặc vùng sườn thứ hai) bao gồm n số nucleoside liên kết có công thức (Ia-1):
bao gồm:
a) phản ứng với nucleotit có công thức (IV-1):
với hợp chất photphoramit có công thức (V-1):
trong đó Y9là H, hydroxy, phosphoryl, pyrophosphate, sunfat, amino, thiol, axit amin được thế tùy ý, hoặc peptit (ví dụ, bao gồm từ 2 đến 12 axit amin); và mỗi P1, P2, và P3độc lập là một nhóm bảo vệ phù hợp; và biểu thị sự hỗ trợ vững chắc; để đề xuất polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmARN có công thức (VI-1):
và b) oxy hóa hoặc lưu huỳnh hóa polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmARN có công thức (V) để tạo ra polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmARN có công thức (VII-1):
và c) loại bỏ các nhóm bảo vệ để tạo ra polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmARN có công thức (Ia).
Theo một số phương án, các bước a) và b) được lặp lại từ 1 đến khoảng 10.000 lần. Theo một số phương án, phương pháp này còn bao gồm nucleotit (ví dụ, phân tử mmARN) được chọn từ nhóm bao gồm A, C, G và U adenosin, cytosine, guanosine, và uracil. Theo một số phương án, nucleobase có thể là pyrimidine hoặc dẫn xuất của nó. Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA có thể dịch được.
Các thành phần khác của polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmARN là tùy chọn, và có lợi theo một số phương án. Ví dụ, vùng 5′ không được dịch mã (UTR) và/hoặc 3′UTR được đề xuất, trong đó một trong hai hoặc cả hai có thể chứa một hoặc nhiều biến đổi nucleotit khác nhau một cách độc lập. Theo các phương án như vậy, các biến đổi nucleotit cũng có thể có mặt ở vùng dịch mã. Sáng chế cũng đề xuất các polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmRNA chứa trình tự Kozak.
Các quy trình tổng hợp ví dụ của nucleotit biến đổi, mà được kết hợp vào axit nucleic biến đổi hoặc mmARN biến đổi, ví dụ, ARN hoặc mARN, được nêu dưới đây trong Sơ đồ 1 đến Sơ đồ 11. Sơ đồ 1 cung cấp phương pháp chung để phosphoryl hóa các nucleoside, bao gồm cả nucleoside biến đổi.
Các nhóm bảo vệ khác nhau có thể được sử dụng để kiểm soát phản ứng. Ví dụ, Sơ đồ 2 đề xuất việc sử dụng nhiều bước bảo vệ và khử bảo vệ để thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa ở vị trí 5’ của đường, thay vì nhóm 2’ và 3’ hydroxyl.
Các nucleotide biến đổi có thể được tổng hợp theo bất kỳ cách hữu ích nào. Các sơ đồ 3, 4 và 7 đề xuất các phương pháp ví dụ để tổng hợp các nucleotit biến đổi có bazơ nucleobase purin biến đổi; và Sơ đồ 5 và 6 đề xuất các phương pháp ví dụ để tổng hợp các nucleotit biến đổi có pseudouridine hoặc pseudoisocytidine biến đổi tương ứng.
Các sơ đồ 8 và 9 đưa ra các quy trình tổng hợp ví dụ về nucleotit biến đổi. Sơ đồ 10 đề xuất phương pháp xúc tác sinh học không giới hạn để sản xuất nucleotit.
Sơ đồ 11 cung cấp sự tổng hợp mẫu của uracil đã biến đổi, trong đó vị trí N1 được sửa đổi bằng R12b, như được cung cấp ở nơi khác, và vị trí 5′ của ribose bị phosphoryl hóa. T, T2, R12a, R12b, và r như được cung cấp ở đây. Sự tổng hợp này, cũng như các phiên bản được tối ưu hóa của nó, có thể được sử dụng để biến đổi các nucleobase pyrimidine và nucleobase purine khác (xem ví dụ, Công thức (b1)-(b43)) và/hoặc để cài đặt một hoặc nhiều nhóm photphat (ví dụ, ở vị trí 5 ′ vị trí của đường). Phản ứng alkyl hóa này cũng có thể được sử dụng để bao gồm một hoặc nhiều nhóm alkyl được thế tùy ý ở nhóm phản ứng bất kỳ (ví dụ, nhóm amino) trong nucleobase bất kỳ được mô tả ở đây (ví dụ, các nhóm amino trong mặt ghép cặp bazơ Watson-Crick của cytosine, uracil , adenine và guanine).
Sự kết hợp của các nucleotide trong mmRNA
Các ví dụ khác về nucleotit biến đổi và tổ hợp nucleotit biến đổi được nêu dưới đây trong Bảng 9. Những tổ hợp nucleotit biến đổi này có thể được sử dụng để tạo ra polypeptit, cấu trúc bậc một, hoặc mmARN theo sáng chế. Trừ khi có ghi chú khác, các nucleotit biến đổi có thể được thay thế hoàn toàn cho các nucleotit tự nhiên của axit nucleic biến đổi hoặc mmARN theo sáng chế. Như một ví dụ không giới hạn, uridine nucleotit tự nhiên có thể được thay thế bằng nucleoside biến đổi được mô tả ở đây. Trong một ví dụ không giới hạn khác, uridine nucleotit tự nhiên có thể được thay thế một phần (ví dụ, khoảng 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45 %, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% hoặc 99,9%) với ít nhất một trong số nucleoside biến đổi bộc lộ ở đây.
Các ví dụ khác về tổ hợp nucleotit biến đổi được nêu dưới đây trong Bảng 10. Những tổ hợp nucleotit biến đổi này có thể được sử dụng để tạo ra polypeptit, cấu trúc bậc một, hoặc mmARN theo sáng chế.
Theo một số phương án, ít nhất 25% cytosine được thay thế bằng hợp chất có công thức (b10)-(b14) (ví dụ, ít nhất khoảng 30%, ít nhất khoảng 35%, ít nhất khoảng 40%, ít nhất khoảng 450 %, ít nhất khoảng 500%, ít nhất khoảng 550%, ít nhất khoảng 600%, ít nhất khoảng 650%, ít nhất khoảng 700%, ít nhất khoảng 7500 ít nhất khoảng 800%, ít nhất khoảng 850%, ít nhất khoảng 900%, ít nhất khoảng 95%, hoặc khoảng 100%).
Theo một số phương án, ít nhất 250% uracil được thay thế bằng hợp chất có công thức (b1)-(b9) (ví dụ, ít nhất khoảng 30%, ít nhất khoảng 35%, ít nhất khoảng 40%, ít nhất khoảng 45 % ít nhất khoảng 50%, ít nhất khoảng 55% ít nhất khoảng 60%, ít nhất khoảng 65%, ít nhất khoảng 70%, ít nhất khoảng 75% ít nhất khoảng 80%, ít nhất khoảng 85%, ít nhất khoảng 900%, ít nhất khoảng 95%, hoặc khoảng 100%).
Theo một số phương án, ít nhất 25% cytosine được thay thế bằng hợp chất có công thức (b10)-(b14), và ít nhất 25% uracil được thay thế bằng hợp chất có công thức (b1)-(b9) (ví dụ , ít nhất khoảng 30%, ít nhất khoảng 35%, ít nhất khoảng 40%, ít nhất khoảng 45%, ít nhất khoảng 50%, ít nhất khoảng 55%, ít nhất khoảng 60%, ít nhất khoảng 65%, tại ít nhất khoảng 70%, ít nhất khoảng 75%, ít nhất khoảng 80%, ít nhất khoảng 85%, ít nhất khoảng 90%, ít nhất khoảng 95%, hoặc khoảng 100%).
IV. Thành phần dược phẩm Xây dựng, quản lý, phân phối và định lượng
Sáng chế đề xuất các polynucleotit, cấu trúc bậc một, chế phẩm và phức hợp mmRNA kết hợp với một hoặc nhiều tá dược dược dụng. Dược phẩm có thể tùy ý bao gồm một hoặc nhiều hoạt chất bổ sung, ví dụ: chất có tác dụng chữa bệnh và/hoặc phòng bệnh. Những cân nhắc chung trong công thức và/hoặc sản xuất dược phẩm có thể được tìm thấy, ví dụ, trongRemington: Khoa học và Thực hành Dược21sted., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (được đưa vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một số phương án, chế phẩm được sử dụng cho người, bệnh nhân hoặc đối tượng là người. Với mục đích của sáng chế, cụm từ “hoạt chất” thường dùng để chỉ các polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA được phân phối như được mô tả ở đây.
Mặc dù phần mô tả dược phẩm được cung cấp ở đây chủ yếu đề cập đến dược phẩm thích hợp để sử dụng cho con người, nhưng người thợ lành nghề sẽ hiểu rằng các chế phẩm này thường thích hợp để sử dụng cho động vật bất kỳ khác, ví dụ, cho động vật không phải người. , ví dụ. động vật có vú không phải con người. Sự biến đổi dược phẩm thích hợp để sử dụng cho con người nhằm tạo ra các chế phẩm phù hợp để sử dụng cho nhiều loài động vật đã được hiểu rõ và nhà dược lý thú y có tay nghề thông thường có thể thiết kế và/hoặc thực hiện sự biến đổi đó chỉ bằng thử nghiệm thông thường, nếu có. Đối tượng được dự tính sử dụng dược phẩm bao gồm, nhưng không giới hạn ở con người và/hoặc các loài linh trưởng khác; động vật có vú, bao gồm các động vật có vú có liên quan đến thương mại như gia súc, lợn, ngựa, cừu, mèo, chó, chuột nhắt và/hoặc chuột cống; và/hoặc chim, bao gồm các loài chim có liên quan đến thương mại như gia cầm, gà, vịt, ngỗng và/hoặc gà tây.
Các chế phẩm chứa dược phẩm được mô tả ở đây có thể được bào chế bằng phương pháp bất kỳ đã biết hoặc được phát triển sau này trong lĩnh vực dược lý học. Nói chung, các phương pháp điều chế này bao gồm bước đưa hoạt chất vào kết hợp với tá dược và/hoặc một hoặc nhiều thành phần phụ khác, sau đó, nếu cần thiết và/hoặc mong muốn, chia, tạo hình và/hoặc đóng gói sản phẩm thành dạng đơn vị đơn liều hoặc đa liều mong muốn.
Dược phẩm theo sáng chế có thể được bào chế, đóng gói và/hoặc bán với số lượng lớn, dưới dạng một đơn vị liều và/hoặc dưới dạng nhiều liều đơn vị. Như được sử dụng ở đây, “liều đơn vị” là lượng riêng biệt của dược phẩm chứa lượng hoạt chất được xác định trước. Lượng thành phần hoạt chất thường bằng với liều lượng của hoạt chất sẽ được sử dụng cho đối tượng và/hoặc một phần thuận tiện của liều lượng như, ví dụ, một nửa hoặc một phần ba liều lượng như vậy .
Lượng tương đối của hoạt chất, tá dược dược dụng và/hoặc thành phần bổ sung bất kỳ trong dược phẩm theo sáng chế sẽ khác nhau, tùy thuộc vào đặc tính, kích thước và/hoặc tình trạng của đối tượng được điều trị và hơn nữa tùy thuộc vào đường mà chế phẩm sẽ được sử dụng. Ví dụ, chế phẩm này có thể chứa từ 0,1% đến 100%, ví dụ, từ 0,5 đến 50%, từ 1-30%, từ 5-80%, ít nhất 80% (w/w) hoạt chất.
Công thức
Polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmRNA theo sáng chế có thể được bào chế bằng cách sử dụng một hoặc nhiều tá dược để: (1) tăng độ ổn định; (2) tăng cường chuyển hóa tế bào; (3) cho phép giải phóng kéo dài hoặc chậm (ví dụ, từ công thức dự trữ polynucleotide, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA); (4) thay đổi sự phân bố sinh học (ví dụ: nhắm mục tiêu polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA đến các mô hoặc loại tế bào cụ thể); (5) tăng cường dịch mã protein in vivo; và/hoặc (6) thay đổi cấu hình giải phóng protein được mã hóa in vivo. Ngoài các tá dược truyền thống như bất kỳ và tất cả các dung môi, môi trường phân tán, chất pha loãng hoặc các chất lỏng khác, chất hỗ trợ phân tán hoặc huyền phù, chất hoạt động bề mặt, chất đẳng trương, chất làm đặc hoặc chất nhũ hóa, chất bảo quản, tá dược theo sáng chế có thể bao gồm, không có giới hạn, lipidoid, liposom, hạt nano lipid, polyme, lipoplexes, hạt nano vỏ lõi, peptit, protein, tế bào được chuyển nhiễm bằng polynucleotide, cấu trúc sơ cấp, hoặc mmRNA (ví dụ, để cấy ghép vào đối tượng), hyaluronidase, mô phỏng hạt nano và tổ hợp của chúng. Do đó, chế phẩm theo sáng chế có thể bao gồm một hoặc nhiều tá dược, mỗi tá dược với lượng cùng nhau làm tăng độ ổn định của polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, làm tăng sự chuyển hóa tế bào bởi polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, làm tăng sự biểu hiện của polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc protein được mã hóa mmRNA và/hoặc làm thay đổi cấu hình giải phóng của polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc protein được mã hóa mmRNA. Hơn nữa, cấu trúc bậc một và mmARN theo sáng chế có thể được tạo ra bằng cách sử dụng các hạt nano axit nucleic tự lắp ráp.
Các chế phẩm chứa dược phẩm được mô tả ở đây có thể được bào chế bằng phương pháp bất kỳ đã biết hoặc được phát triển sau này trong lĩnh vực dược lý học. Nói chung, các phương pháp điều chế này bao gồm bước kết hợp hoạt chất với tá dược và/hoặc một hoặc nhiều thành phần phụ khác.
Dược phẩm theo sáng chế có thể được bào chế, đóng gói và/hoặc bán với số lượng lớn, dưới dạng một đơn vị liều, và/hoặc dưới dạng nhiều liều đơn vị. Như được sử dụng ở đây, “liều đơn vị” được dùng để chỉ lượng riêng biệt của dược phẩm bao gồm lượng hoạt chất được xác định trước. Lượng thành phần hoạt chất thường có thể bằng với liều lượng của hoạt chất sẽ được sử dụng cho đối tượng và/hoặc một phần thuận tiện của liều lượng đó bao gồm nhưng không giới hạn ở một nửa hoặc một phần ba lượng đó. một liều lượng.
Lượng tương đối của hoạt chất, tá dược dược dụng, và/hoặc thành phần bổ sung bất kỳ trong dược phẩm theo sáng chế có thể khác nhau, tùy thuộc vào đặc tính, kích thước và/hoặc tình trạng của đối tượng được điều trị và hơn nữa tùy thuộc vào theo lộ trình mà chế phẩm sẽ được sử dụng. Ví dụ, chế phẩm có thể chứa từ 0,1% đến 99% (w/w) hoạt chất.
Theo một số phương án, chế phẩm được mô tả ở đây có thể chứa ít nhất một mmRNA. Như một ví dụ không giới hạn, chế phẩm này có thể chứa 1, 2, 3, 4 hoặc 5 mmRNA. Theo một phương án, chế phẩm này có thể chứa các protein mã hóa mARN biến đổi được chọn từ các nhóm như, nhưng không giới hạn ở, protein của người, protein thú y, protein vi khuẩn, protein sinh học, kháng thể, protein gây miễn dịch, peptit và protein điều trị, protein được tiết, protein màng huyết tương , protein tế bào chất và khung tế bào, protein liên kết màng nội bào, protein nhân, protein liên quan đến bệnh ở người và/hoặc protein liên quan đến các bệnh không phải ở người. Theo một phương án, chế phẩm này chứa ít nhất ba protein mã hóa mARN biến đổi. Theo một phương án, chế phẩm này chứa ít nhất năm protein mã hóa mARN biến đổi.
Ngoài ra, dược phẩm có thể bao gồm tá dược dược dụng, mà, như được sử dụng ở đây, bao gồm, nhưng không giới hạn ở, bất kỳ và tất cả các dung môi, môi trường phân tán, chất pha loãng hoặc chất lỏng khác, chất hỗ trợ phân tán hoặc huyền phù, chất hoạt động bề mặt, chất đẳng trương , chất làm đặc hoặc chất nhũ hóa, chất bảo quản, và chất tương tự, tùy theo dạng bào chế cụ thể mong muốn. Nhiều tá dược khác nhau để bào chế dược phẩm và các kỹ thuật bào chế dược phẩm này đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này (xem Remington: Khoa học và Thực hành Dược phẩm, 21stPhiên bản, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ). Việc sử dụng môi trường tá dược thông thường có thể được dự tính trong phạm vi của sáng chế, ngoại trừ trường hợp môi trường tá dược thông thường bất kỳ có thể không tương thích với một chất hoặc các dẫn xuất của nó, chẳng hạn như bằng cách tạo ra tác dụng sinh học không mong muốn hoặc tương tác theo cách có hại với (các) thành phần bất kỳ khác của dược phẩm.
Theo một số phương án, kích thước hạt của hạt nano lipid có thể tăng lên và/hoặc giảm đi. Sự thay đổi về kích thước hạt có thể giúp chống lại phản ứng sinh học, chẳng hạn như nhưng không giới hạn ở tình trạng viêm hoặc có thể làm tăng tác dụng sinh học của mRNA biến đổi được truyền vào động vật có vú.
Tá dược dược dụng được sử dụng trong sản xuất dược phẩm bao gồm, nhưng không giới hạn ở, chất pha loãng trơ, chất hoạt động bề mặt và/hoặc chất nhũ hóa, chất bảo quản, chất đệm, chất bôi trơn, và/hoặc dầu. Các tá dược như vậy có thể tùy ý được đưa vào công thức dược phẩm theo sáng chế.
Lipidoid
Sự tổng hợp lipidoid đã được mô tả rộng rãi và các công thức chứa các hợp chất này đặc biệt thích hợp để phân phối polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA (xem Mahon và cộng sự, Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454; Schroeder và cộng sự, J Intern Med. . 2010 267:9-21; Akinc và cộng sự, Nat Biotechnol 2008 26:561-569; Love và cộng sự, Proc Natl Acad Sci USA 2010 107:1864-1869; USA. 2011 108:12996-3001; tất cả đều được đưa vào đây một cách trọn vẹn).
Mặc dù các lipidoid này đã được sử dụng để vận chuyển hiệu quả các phân tử RNA can thiệp sợi đôi nhỏ ở loài gặm nhấm và các loài linh trưởng không phải con người (xem Akinc và cộng sự, Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Frank-Kamenetsky và cộng sự, Proc Natl Acad Sci Hoa Kỳ 2008 105:11915-11920; Akinc và cộng sự, Mol Ther. 2009 17:872-879; Love và cộng sự, Proc Natl Acad Sci Hoa Kỳ 107:1864-1869; 2011 29:1005-1010; tất cả đều được đưa vào đây một cách trọn vẹn), sáng chế mô tả công thức và cách sử dụng của chúng trong việc phân phối các polynucleotit sợi đơn, cấu trúc sơ cấp, hoặc mmRNA. Các phức hợp, mixen, liposom hoặc hạt có thể được điều chế có chứa các lipidoid này và do đó, có thể mang lại sự phân phối hiệu quả polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA, tùy theo việc tạo ra protein được mã hóa, sau khi tiêm chế phẩm lipidoid qua đường dùng cục bộ và/hoặc hệ thống. Các phức hợp lipid của polynucleotit, cấu trúc sơ cấp, hoặc mmRNA có thể được sử dụng bằng nhiều cách khác nhau bao gồm, nhưng không giới hạn ở đường tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp hoặc dưới da.
Việc phân phối axit nucleic in vivo có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều thông số, bao gồm nhưng không giới hạn ở thành phần công thức, bản chất của quá trình PEGylation hạt, mức độ nạp, tỷ lệ oligonucleotide trên lipid và các thông số sinh lý chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở hạt kích thước (Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Ví dụ, những thay đổi nhỏ về độ dài chuỗi neo của lipid poly(ethylene glycol) (PEG) có thể dẫn đến những ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả in vivo. Công thức chứa các lipidoid khác nhau, bao gồm nhưng không giới hạn ở penta[3-(1-laurylaminopropionyl)]-triethylenetetramine hydrochloride (TETA-5LAP; hay còn gọi là 98N12-5, xem Murugaiah và cộng sự, Hóa sinh phân tích, 401:61 (2010) ; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn), C12-200 (bao gồm các dẫn xuất và biến thể), và MD1, có thể được thử nghiệm về hoạt tính in vivo.
Lipitoid được đề cập ở đây là “98N12-5” được bộc lộ bởi Akinc và cộng sự, Mol Ther. 2009 17:872-879 và được đưa toàn bộ vào bằng cách tham chiếu. (Nhìn thấy
Lipidoid được đề cập ở đây là “C12-200” được tiết lộ bởi Love và cộng sự, Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869 (xem
Theo một phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA được bào chế bằng lipidoid để sử dụng trong đường tĩnh mạch toàn thân có thể nhắm mục tiêu vào gan. Ví dụ, chế phẩm tiêm tĩnh mạch được tối ưu hóa cuối cùng sử dụng polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, và chứa thành phần phân tử lipid gồm 42% 98N12-5, 48% cholesterol và 10% PEG-lipid với tỷ lệ trọng lượng cuối cùng là khoảng 7,5 trên 1 tổng lipid trên polynucleotide, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, và chiều dài chuỗi alkyl C14 trên lipid PEG, với kích thước hạt trung bình khoảng 50-60 nm, có thể dẫn đến sự phân bố của chế phẩm lớn hơn 90% đối với gan. (xem Akinc và cộng sự, Mol Ther. 2009 17:872-879; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Trong một ví dụ khác, chế phẩm tiêm tĩnh mạch sử dụng C12-200 (xem đơn tạm thời của Hoa Kỳ số 61/175.770 và đơn quốc tế được công bố WO2010129709, mỗi đơn trong số đó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ) lipidoid có thể có tỷ lệ mol là 50/10/38,5 /1,5 của C12-200/disteroylphosphatidyl choline/cholesterol/PEG-DMG, với tỷ lệ trọng lượng là 7 trên 1 lipid tổng số trên polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA và kích thước hạt trung bình là 80 nm có thể có hiệu quả để cung cấp polynucleotide, cấu trúc chính, hoặc mmRNA đối với tế bào gan (xem Love và cộng sự, Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869 được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Theo một phương án khác, chế phẩm chứa lipidoid MD1 có thể được sử dụng để phân phối hiệu quả polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA đến tế bào gan in vivo. Đặc điểm của các công thức lipidoid được tối ưu hóa cho đường tiêm bắp hoặc tiêm dưới da có thể thay đổi đáng kể tùy thuộc vào loại tế bào đích và khả năng khuếch tán của công thức qua ma trận ngoại bào vào dòng máu. Mặc dù kích thước hạt nhỏ hơn 150 nm có thể được yêu cầu để phân phối tế bào gan hiệu quả do kích thước của cửa sổ nội mô (xem Akinc và cộng sự, Mol Ther. 2009 17:872-879 ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn), việc sử dụng polynucleotit, cấu trúc sơ cấp, hoặc mmRNA được tạo ra từ lipidoid để phân phối công thức này đến các loại tế bào khác bao gồm, nhưng không giới hạn ở, tế bào nội mô, tế bào tủy và tế bào cơ có thể không bị giới hạn kích thước tương tự. Việc sử dụng các công thức lipidoid để cung cấp siRNA in vivo đến các tế bào không phải tế bào gan khác như tế bào dòng tủy và nội mạc đã được báo cáo (xem Akinc và cộng sự, Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Leuschner và cộng sự, Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010; Cho và cộng sự. Adv. Mater.quần quèHội nghị dân gian quốc tế Judah, Cambridge, MA ngày 8-9 tháng 10 năm 2010; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Phân phối hiệu quả đến các tế bào tủy, chẳng hạn như bạch cầu đơn nhân, các công thức lipidoid có thể có tỷ lệ mol thành phần tương tự. Các tỷ lệ khác nhau của lipidoid và các thành phần khác bao gồm nhưng không giới hạn ở disteroylphosphatidyl choline, cholesterol và PEG-DMG, có thể được sử dụng để tối ưu hóa công thức của polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA để phân phối đến các loại tế bào khác nhau bao gồm nhưng không giới hạn với tế bào gan, tế bào dòng tủy, tế bào cơ, v.v. Ví dụ, tỷ lệ mol thành phần có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, 50% C12-200, 10% disteroylphosphatidyl choline, 38,5% cholesterol và % 1,5 PEG-DMG ( xem Leuschner và cộng sự, Nat Biotechnol 2011 29:1005-1010; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Việc sử dụng các công thức lipidoid để phân phối axit nucleic cục bộ đến các tế bào (như, nhưng không giới hạn ở, tế bào mỡ và tế bào cơ) thông qua việc phân phối dưới da hoặc tiêm bắp, có thể không yêu cầu tất cả các thành phần công thức mong muốn để phân phối toàn thân, và như vậy có thể chỉ bao gồm lipidoid và polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA.
Sự kết hợp của các lipidoid khác nhau có thể được sử dụng để cải thiện hiệu quả của việc sản xuất protein theo hướng polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA vì lipidoid có thể làm tăng sự chuyển hóa tế bào bởi polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA; và/hoặc tăng khả năng dịch mã protein (xem Whitehead và cộng sự, Mol. Ther. 2011, 19:1688-1694, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Liposome, Lipoplexes và hạt nano lipid
Polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra bằng cách sử dụng một hoặc nhiều liposom, lipoplexes, hoặc hạt nano lipid. Theo một phương án, dược phẩm chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA bao gồm liposom. Liposome là các túi được điều chế nhân tạo, có thể chủ yếu bao gồm lớp lipid kép và có thể được sử dụng làm phương tiện vận chuyển để cung cấp chất dinh dưỡng và công thức dược phẩm. Liposome có thể có các kích cỡ khác nhau, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, túi đa lớp (MLV) có thể có đường kính hàng trăm nanomet và có thể chứa một loạt các lớp kép đồng tâm được ngăn cách bởi các ngăn chứa nước hẹp, một túi đơn bào nhỏ (SUV) có có thể có đường kính nhỏ hơn 50 nm và túi đơn lớp lớn (LUV) có thể có đường kính từ 50 đến 500 nm. Thiết kế liposome có thể bao gồm nhưng không giới hạn ở opsonin hoặc phối tử để cải thiện sự gắn kết của liposome với mô không khỏe mạnh hoặc để kích hoạt các sự kiện như, nhưng không giới hạn ở, nhập bào. Liposome có thể chứa độ pH thấp hoặc cao để cải thiện việc phân phối các công thức dược phẩm.
Sự hình thành liposome có thể phụ thuộc vào các đặc tính hóa lý, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn, công thức dược phẩm được gắn vào và các thành phần liposome, bản chất của môi trường trong đó các túi lipid được phân tán, nồng độ hiệu quả của chất bị gắn vào và tiềm năng của nó. độc tính, bất kỳ quá trình bổ sung nào liên quan đến quá trình ứng dụng và/hoặc phân phối các túi, kích thước tối ưu, độ đa phân tán và thời hạn sử dụng của các túi cho ứng dụng dự định, cũng như khả năng tái sản xuất theo từng mẻ và khả năng sản xuất quy mô lớn các sản phẩm liposome an toàn và hiệu quả.
Theo một phương án, dược phẩm được mô tả ở đây có thể bao gồm, không giới hạn, liposom như các liposom được tạo thành từ liposom 1,2-dioleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DODMA), liposom DiLa2 từ Marina Biotech (Bothell, WA), 1,2 -dilinoleyloxy-3-dimethylaminopropan (DLin-DMA), 2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane (DLin-KC2-DMA), và MC3 (US20100324120; ở đây được đưa vào bằng cách viện dẫn toàn bộ) và liposome có thể cung cấp các loại thuốc phân tử nhỏ như, nhưng không giới hạn ở DOXIL® của Janssen Biotech, Inc. (Horsham, PA).
Theo một phương án, dược phẩm mô tả ở đây có thể bao gồm, không giới hạn, liposom như các liposome được tạo thành từ quá trình tổng hợp các hạt plasmit-lipid ổn định (SPLP) hoặc hạt lipid axit nucleic ổn định (SNALP) trước đây đã được mô tả và cho thấy là thích hợp. đối với việc cung cấp oligonucleotide in vitro và in vivo (xem Wheeler và cộng sự. Liệu pháp gen. 1999 6:271-281; Zhang và cộng sự. Liệu pháp gen. 1999 6:1438-1447; Jeffs và cộng sự. Pharm Res. 2005 22:362- 372; Morrissey và cộng sự, Nat Biotechnol 2005 2:1002-1007; Zimmermann và cộng sự, Nature. 2006 441:111-114; Công nghệ sinh học tự nhiên 2010 28:172-176; Judge và cộng sự J Clin Invest 2009 119:661-673;Hum Gene There.2008 19:125-132; tất cả đều được đưa vào đây một cách trọn vẹn). Phương pháp sản xuất ban đầu của Wheeler et al. là một phương pháp lọc máu bằng chất tẩy rửa, sau này được cải tiến bởi Jeffs et al. và được gọi là phương pháp hình thành mụn nước tự phát. Công thức liposome bao gồm 3 đến 4 thành phần lipid ngoài polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA. Ví dụ, liposome có thể chứa, nhưng không giới hạn ở, 55% cholesterol, 20% disteroylphosphatidyl choline (DSPC), 10% PEG-S-DSG, và 15% 1,2-dioleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DODMA ), theo mô tả của Jeffs et al. Một ví dụ khác, các công thức liposome nhất định có thể chứa, nhưng không giới hạn ở, 48% cholesterol, 20% DSPC, 2% PEG-c-DMA, và 30% lipid cation, trong đó lipid cation có thể là 1,2-distearloxy- N,N-dimethylaminopropane (DSDMA), DODMA, DLin-DMA, hoặc 1,2-dilinolenyloxy-3-dimethylaminopropane (DLenDMA), như được mô tả bởi Heyes và cộng sự.
Theo một phương án, dược phẩm có thể bao gồm liposom có thể được tạo ra để phân phối mmRNA mà có thể mã hóa ít nhất một chất gây miễn dịch. MmRNA có thể được bao bọc bởi liposome và/hoặc nó có thể được chứa trong lõi nước mà sau đó có thể được bao bọc bởi liposome (xem International Pub. Nos. WO2012031046, WO2012031043, WO2012030901 và WO2012006378; mỗi trong số đó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ). Theo một phương án khác, mmRNA mà có thể mã hóa chất gây miễn dịch có thể được bào chế ở dạng nhũ tương dầu trong nước cation trong đó hạt nhũ tương bao gồm lõi dầu và lipid cation mà có thể tương tác với mmRNA đang neo phân tử vào hạt nhũ tương (xem International Pub. Số WO2012006380 được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Theo một phương án khác nữa, chế phẩm lipid có thể bao gồm ít nhất là lipid cation, một lipid có thể tăng cường sự chuyển hóa và ít nhất một lipid chứa nhóm đầu ưa nước được liên kết với gốc lipid (Nhà xuất bản Quốc tế. Số WO2011076807 và Nhà xuất bản Hoa Kỳ Số. 20110200582; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Theo một phương án khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA mã hóa chất sinh miễn dịch có thể được tạo ra trong túi lipid mà có thể có các liên kết ngang giữa các lớp lipid kép được chức năng hóa (xem US Pub. No. 20120177724, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA có thể được tạo ra trong túi lipid mà có thể có các liên kết ngang giữa các lớp lipid kép được chức năng hóa.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN có thể được bào chế ở dạng liposom bao gồm lipit cation. Liposome có thể có tỷ lệ mol của các nguyên tử nitơ trong lipid cation với photphat trong RNA (tỷ lệ N:P) nằm trong khoảng từ 1:1 đến 20:1 như được mô tả trong Công bố Quốc tế số WO2013006825, ở đây được đưa vào đây bằng cách viện dẫn trong phần của nó. toàn bộ. Theo một phương án khác, liposom có thể có tỷ lệ N:P lớn hơn 20:1 hoặc nhỏ hơn 1:1.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA có thể được bào chế ở dạng phức hợp polycation-lipid. Việc tạo ra phức hợp polycation-lipid có thể được thực hiện bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc như được mô tả trong US Pub. Số 20120178702, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Là một ví dụ không giới hạn, polycation có thể bao gồm peptit cation hoặc polypeptit như, nhưng không giới hạn ở, polylysin, polyornithin và/hoặc polyarginin và peptit cation được mô tả trong International Pub. Số WO2012013326; ở đây được đưa toàn bộ vào bằng cách viện dẫn. Theo một phương án khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA có thể được bào chế ở phức hợp polycation-lipid mà có thể bao gồm thêm lipid trung tính như, nhưng không giới hạn ở, cholesterol hoặc dioleoyl phosphatidyletanolamin (DOPE).
Công thức liposome có thể bị ảnh hưởng nhưng không giới hạn ở việc lựa chọn thành phần lipid cation, mức độ bão hòa lipid cation, bản chất của PEGylation, tỷ lệ của tất cả các thành phần và các thông số sinh lý như kích thước. Trong một ví dụ của Semple et al. (Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách tham chiếu), công thức liposome bao gồm 57,1% lipid cation, 7,1% dipalmitoylphosphatidylcholine, 34,3% cholesterol và 1,4% PEG-c- DMA. Một ví dụ khác, việc thay đổi thành phần của lipid cation có thể phân phối siRNA đến các tế bào trình diện kháng nguyên khác nhau một cách hiệu quả hơn (Basha và cộng sự. Mol Ther. 2011 19:2186-2200; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một số phương án, tỷ lệ PEG trong công thức hạt nano lipid (LNP) có thể tăng hoặc giảm và/hoặc độ dài chuỗi cacbon của lipid PEG có thể được biến đổi từ C14 thành C18 để thay đổi dược động học và/hoặc sự phân bố sinh học của LNP công thức. Như một ví dụ không giới hạn, chế phẩm LNP có thể chứa tỷ lệ mol lipid của PEG-c-DOMG từ 1-5% so với lipid cation, DSPC và cholesterol. Theo một phương án khác, PEG-c-DOMG có thể được thay thế bằng PEG lipid như, nhưng không giới hạn ở, PEG-DSG (1,2-Distearoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol) hoặc PEG-DPG (1,2- Dipalmitoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol). Lipid cation có thể được chọn từ lipid bất kỳ đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 và DLin-KC2-DMA.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được tạo ra ở dạng hạt nano lipid như các hạt được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2012170930, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, lipid cation có thể được chọn từ, nhưng không giới hạn ở, lipid cation được mô tả trong Số công bố quốc tế WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259 , WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865 và WO2008103276, Hoa Kỳ Pat. Số 7.893.302, 7.404.969 và 8.283.333 và Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ số US20100036115 và US20120202871; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo một phương án khác, lipid cation có thể được chọn từ, nhưng không giới hạn ở, công thức A được mô tả trong Số công bố quốc tế WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, W O2012054365 và WO2012044638; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo một phương án khác nữa, lipit cation có thể được chọn từ, nhưng không giới hạn ở, công thức CLI-CLXXIX theo Công bố Quốc tế số WO2008103276, công thức CLI-CLXXIX của Pat. Số 7,893,302, công thức CLI-CLXXXXII của Pat. số 7.404.969 và công thức I-VI của Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ số US20100036115; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Như một ví dụ không giới hạn, lipit cation có thể được chọn từ (20Z,23Z)—N,N-dimethylnonacosa-20,23-dien-10-amin, (17Z,20Z)—N,N-dimemylhexacosa-17, 20-dien-9-amin, (1Z,19Z)—N5N-dimetylpentacosa-1 6,19-dien-8-amin, (13Z,16Z)—N,N-dimethyldocosa-13,16-dien-5-amin , (12Z,15Z)—N,N-dimetylhenicosa-12,15-dien-4-amin, (14Z,17Z)—N,N-dimethyltricosa-14,17-dien-6-amin, (15Z,18Z) —N,N-dimetyltetracosa-15,18-dien-7-amin, (18Z,21Z)—N,N-dimetylheptacosa-18,21-dien-10-amin, (15Z,18Z)—N,N-dimethyltetracosa -15,18-dien-5-amin, (14Z,17Z)—N,N-dimethyltricosa-14,17-dien-4-amin, (19Z,22Z)—N,N-dimeihyloctacosa-19,22-dien -9-amin, (18Z,21 Z)—N,N-dimetylheptacosa-18,21-dien-8-amin, (17Z,20Z)—N,N-dimetylhexacosa-17,20-dien-7-amin, (16Z,19Z)—N,N-dimetylpentacosa-16,19-dien-6-amin, (22Z,25Z)—N,N-dimetylhentriaconta-22,25-dien-10-amin, (21 Z,24Z) —N,N-dimetyltriaconta-21,24-dien-9-amin, (18Z)—N,N-dimetylheptacos-18-en-10-amin, (17Z)—N,N-dimethylhexacos-17-en-9 -amin, (19Z,22Z)—N,N-dimetyloctacosa-19,22-dien-7-amin, N,N-dimetylheptacosan-10-amin, (20Z,23Z)—N-etyl-N-metylnonacosa-20 ,23-dien-10-amin, 1-[(11Z,14Z)-1-nonylicosa-11,14-dien-1-yl]pyrolidin, (20Z)—N,N-dimetylheptacos-20-en-1 O -amin, (15Z)—N,N-dimetyl eptacos-15-en-1 O-amin, (14Z)—N,N-dimetylnonacos-14-en-10-amin, (17Z)—N,N-dimetylnonacos -17-en-10-amin, (24Z)—N,N-dimetyltritriacont-24-en-10-amin, (20Z)—N,N-dimetylnonacos-20-en-1 O-amin, (22Z)— N,N-dimetylhentriacont-22-en-10-amin, (16Z)—N,N-dimetylpentacos-16-en-8-amin, (12Z,15Z)—N,N-dimetyl-2-nonylhenicosa-12, 15-dien-1-amin, (13Z,16Z)—N,N-dimetyl-3-nonyldocosa-13,16-dien-1-amin, N,N-dimetyl-1-[(1S,2R)-2 -octylcyclopropyl]eptadecan-8-amin, 1-[(1S,2R)-2-hexylcyclopropyl]-N,N-dimethylnonadecan-10-amin, N,N-dimetyl-1-[(1S,2R)-2- octylcyclopropyl]nonadecan-10-amin, N,N-dimetyl-21-[(1S,2R)-2-octylcyclopropyl]henicosan-10-amin,N,N-dimetyl-1-[(1S,2S)-2- {[(1R,2R)-2-pentylcycIopropyl]metyl}cyclopropyl]nonadecan-10-amin,N,N-dimetyl-1-[(1S,2R)-2-octylcyclopropyl]hexadecan-8-amin, N,N -dimetyl-[(1R,2S)-2-undecyIcyclopropyl]tetradecan-5-amin, N,N-dimetyl-3-{7-[(1S,2R)-2-octylcyclopropyl]heptyl}dodecan-1-amin, 1-[(1R,2S)-2-hepty lcyclopropyl]-N,N-dimetyloctadecan-9-amin, 1-[(1S,2R)-2-decylcyclopropyl]-N,N-dimetylpentadecan-6-amin, N ,N-dimetyl-1-[(1S,2R)-2-octylcyclopropyl]pentadecan-8-amin, R—N,N-dimetyl-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -yloxy]-3-(octyloxy)propan-2-amin, S—N,N-dimetyl-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]-3-(octyloxy) propan-2-amin, 1-{2-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]-1-[(octyloxy)metyl]etyl}pyrrolidin, (2S)—N,N -dimetyl-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]-3-[(5Z)-oct-5-en-1-yloxy]propan-2-amin, 1- {2-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]-1-[(octyloxy)metyl]etyl}azetidine, (2S)-1-(hexyloxy)-N,N-dimetyl -3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]propan-2-amin, (2S)-1-(heptyloxy)-N,N-dimetyl-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]propan-2-amin, N,N-dimetyl-1-(nonyloxy)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]propan-2-amin, N,N-dimetyl-1-[(9Z)-octadec-9-en-1-yloxy]- 3-(octyloxy)propan-2-amin; (2S)—N,N-dimetyl-1-[(6Z,9Z,12Z)-octadeca-6,9,12-trien-1-yloxy]-3-(octyloxy)propan-2-amin, (2S) -1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-yloxy]-N,N-dimetyl-3-(pentyloxy)propan-2-amin, (2S)-1-(hexyloxy)- 3-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-yloxy]-N,N-dimetylpropan-2-amin, 1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1 -yloxy]-N,N-dimetyl-3-(octyloxy)propan-2-amin, 1-[(13Z,16Z)-docosa-13,16-dien-1-yloxy]-N,N-dimetyl-3 -(octyloxy)propan-2-amin, (2S)-1-[(13Z,16Z)-docosa-13,16-dien-1-yloxy]-3-(hexyloxy)-N,N-dimethylpropan-2- amin, (2S)-1-[(13Z)-docos-13-en-1-yloxy]-3-(hexyloxy)-N,N-dimetylpropan-2-amin, 1-[(13Z)-docos-13 -en-1-yloxy]-N,N-dimetyl-3-(octyloxy)propan-2-amin, 1-[(9Z)-hexadec-9-en-1-yloxy]-N,N-dimetyl-3 -(octyloxy)propan-2-amin, (2R)—N,N-dimetyl-H(1-metoylo ctyl)oxy]-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]propan-2-amin, (2R)-1-[(3,7-dimethyloctyl)oxy]-N,N-dimetyl-3 -[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]propan-2-amin, N,N-dimetyl-1-(octyloxy)-3-({8-[(1S,2S) -2-{[(1R,2R)-2-pentylcyclopropyl]metyl}cyclopropyl]octyl}oxy)propan-2-amin, N,N-dimetyl-1-{[8-(2-oclylcyclopropyl)octyl]oxy} -3-(octyloxy)propan-2-amine và (11E,20Z,23Z)—N,N-dimethylnonacosa-11,20,2-trien-10-amine hoặc muối dược dụng hoặc chất đồng phân lập thể của chúng.
Theo một phương án, lipid có thể là lipid có thể phân tách được như lipid được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2012170889, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, lipit cation có thể được tổng hợp bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc như được mô tả trong Số công bố quốc tế WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259 , WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724 và WO201021865; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, chế phẩm LNP của polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA có thể chứa PEG-c-DOMG với tỷ lệ mol lipid là 3%. Theo một phương án khác, polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA của chế phẩm LNP có thể chứa PEG-c-DOMG với tỷ lệ mol lipid là 1,5%.
Theo một phương án, dược phẩm chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA có thể bao gồm ít nhất một trong số các lipit PEGylat hóa được mô tả trong Công bố quốc tế số 2012099755, được đưa vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, chế phẩm LNP có thể chứa PEG-DMG 2000 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phophoetanolamine-N-[metoxy(polyethylene glycol)-2000). Theo một phương án, chế phẩm LNP có thể chứa PEG-DMG 2000, một lipit cation đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và ít nhất một thành phần khác. Theo một phương án khác, chế phẩm LNP có thể chứa PEG-DMG 2000, một lipit cation đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này, DSPC và cholesterol. Là một ví dụ không giới hạn, chế phẩm LNP có thể chứa PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC và cholesterol. Như một ví dụ không giới hạn khác, công thức LNP có thể chứa PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC và cholesterol theo tỷ lệ mol 2:40:10:48 (xem ví dụ, Geall và cộng sự, Phân phối tự khuếch đại không chứa vi-rút vắc xin RNA, PNAS 2012; PMID: 22908294; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Như một ví dụ không giới hạn khác, ARN biến đổi được mô tả ở đây có thể được bào chế ở dạng hạt nano để được phân phối bằng đường tiêm truyền như được mô tả trong US Pub. số 20120207845; ở đây được đưa toàn bộ vào bằng cách viện dẫn. Theo một phương án, công thức LNP có thể được bào chế bằng các phương pháp được mô tả trong Số Công bố Quốc tế WO2011127255 hoặc WO2008103276, mỗi phương pháp trong số đó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ. Như một ví dụ không giới hạn, ARN biến đổi được mô tả ở đây có thể được bao bọc trong các công thức LNP như được mô tả trong WO2011127255 và/hoặc WO2008103276; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo một phương án, chế phẩm LNP được mô tả ở đây có thể chứa chế phẩm polycation. Là một ví dụ không giới hạn, chế phẩm polycation có thể được chọn từ công thức 1-60 của Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ số US20050222064; ở đây được đưa toàn bộ vào bằng cách viện dẫn. Theo một phương án khác, chế phẩm LNP chứa chế phẩm polycation có thể được sử dụng để phân phối ARN biến đổi được mô tả ở đây in vivo và/hoặc in vitro.
Theo một phương án, chế phẩm LNP được mô tả ở đây còn có thể chứa phân tử tăng cường tính thấm. Các phân tử tăng cường tính thấm không giới hạn được mô tả trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ số US20050222064; ở đây được đưa toàn bộ vào bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, dược phẩm có thể được bào chế ở dạng liposom như, nhưng không giới hạn ở, liposom DiLa2 (Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTICLES® (Marina Biotech, Bothell, WA), DOPC trung tính (1,2-dioleoyl -sn-glycero-3-phosphocholine) dựa trên liposome (ví dụ, phân phối siRNA cho bệnh ung thư buồng trứng (Landen và cộng sự. Sinh học & Trị liệu Ung thư 2006 5(12)1708-1713); ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn) và được phủ hyaluronan liposome (Trị liệu yên tĩnh, Israel).
Các chế phẩm hạt nano có thể là hạt nano cacbohydrat bao gồm chất mang cacbohydrat và phân tử axit nucleic biến đổi (ví dụ, mmARN). Như một ví dụ không giới hạn, chất mang cacbohydrat có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, phytoglycogen hoặc chất dạng glycogen được biến đổi bằng anhydrit, phtoglycogen octenyl succinat, phytoglycogen beta-dextrin, phytoglycogen beta-dextrin được biến đổi bằng anhydrit. (Xem ví dụ: Công bố quốc tế số WO2012109121; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Các công thức hạt nano lipid có thể được cải thiện bằng cách thay thế lipid cation bằng lipid cation có khả năng phân hủy sinh học được gọi là hạt nano lipid được loại bỏ nhanh chóng (reLNP). Lipit cation có thể ion hóa, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, DLinDMA, DLin-KC2-DMA và DLin-MC3-DMA, đã được chứng minh là tích tụ trong huyết tương và các mô theo thời gian và có thể là nguồn gây độc tiềm tàng. Sự chuyển hóa nhanh chóng của các lipid được loại bỏ nhanh chóng có thể cải thiện khả năng dung nạp và chỉ số điều trị của các hạt nano lipid theo mức độ từ liều 1 mg/kg đến liều 10 mg/kg ở chuột. Việc đưa vào một liên kết este bị phân hủy bằng enzyme có thể cải thiện đặc tính phân hủy và chuyển hóa của thành phần cation, trong khi vẫn duy trì hoạt động của công thức reLNP. Liên kết este có thể nằm bên trong chuỗi lipid hoặc nó có thể nằm ở đầu cuối của chuỗi lipid. Liên kết este bên trong có thể thay thế bất kỳ cacbon nào trong chuỗi lipid.
Theo một phương án, liên kết este bên trong có thể nằm ở một trong hai phía của cacbon bão hòa. Các ví dụ không giới hạn về reLNP bao gồm,
Theo một phương án, phản ứng miễn dịch có thể được tạo ra bằng cách phân phối hạt nano lipid mà có thể bao gồm loài nano, polyme và chất sinh miễn dịch. (Ấn phẩm Hoa Kỳ số 20120189700 và Công bố quốc tế số WO2012099805; mỗi ấn phẩm này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Polyme có thể bao bọc các loài nano hoặc bao bọc một phần các loài nano. Chất gây miễn dịch này có thể là protein tái tổ hợp, ARN biến đổi và/hoặc cấu trúc sơ cấp được mô tả ở đây. Theo một phương án, hạt nano lipid có thể được bào chế để sử dụng trong vắc-xin như, nhưng không giới hạn ở, chống lại mầm bệnh.
Các hạt nano lipid có thể được thiết kế để thay đổi tính chất bề mặt của các hạt để các hạt nano lipid có thể xuyên qua hàng rào niêm mạc. Chất nhầy nằm trên các mô niêm mạc như, nhưng không giới hạn ở, miệng (ví dụ: màng miệng, thực quản và mô amidan), nhãn khoa, đường tiêu hóa (ví dụ: dạ dày, ruột non, ruột già, đại tràng, trực tràng), mũi, đường hô hấp. (ví dụ: màng mũi, họng, khí quản và phế quản), bộ phận sinh dục (ví dụ: màng âm đạo, cổ tử cung và niệu đạo). Các hạt nano lớn hơn 10-200 nm được ưu tiên vì hiệu quả bọc thuốc cao hơn và khả năng cung cấp sự phân phối bền vững của nhiều loại thuốc được cho là quá lớn để khuếch tán nhanh qua các hàng rào niêm mạc. Chất nhầy liên tục được tiết ra, bong ra, loại bỏ hoặc tiêu hóa và tái chế nên hầu hết các hạt bị mắc kẹt có thể được loại bỏ khỏi mô niêm mạc trong vòng vài giây hoặc trong vòng vài giờ. Các hạt nano polyme lớn (đường kính 200 nm-500 nm) được phủ dày đặc bằng polyethylene glycol (PEG) có trọng lượng phân tử thấp khuếch tán qua chất nhầy chỉ thấp hơn 4 đến 6 lần so với các hạt tương tự khuếch tán trong nước (Lai et al. PNAS 2007 104(5):1482-487; Lai và cộng sự. Adv Drug Deliv Rev. 2009 61(2): 158-171; mỗi nội dung này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Sự vận chuyển các hạt nano có thể được xác định bằng cách sử dụng tốc độ thẩm thấu và/hoặc kỹ thuật kính hiển vi huỳnh quang bao gồm, nhưng không giới hạn ở, phục hồi huỳnh quang sau quá trình tẩy trắng (FRAP) và theo dõi nhiều hạt có độ phân giải cao (MPT). Như một ví dụ không giới hạn, chế phẩm có thể xuyên qua hàng rào niêm mạc có thể được bào chế như được mô tả trong US Pat. Số 8.241.670, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Hạt nano lipid được thiết kế để xuyên qua chất nhầy có thể bao gồm vật liệu polyme (tức là lõi polyme) và/hoặc liên hợp polyme-vitamin và/hoặc co-polyme ba khối. Vật liệu polyme có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, polyamine, polyete, polyamit, polyeste, polycacbamate, polyureas, polycarbonate, poly(styren), polyimide, polysulfone, polyuretan, polyaxetylen, polyetylen, polyethyeneimine, polyisocyanat, polyacrylat, polymethacrylat, polyacrylonitriles và polyarylat. Vật liệu polyme có thể phân hủy sinh học và/hoặc tương thích sinh học. Vật liệu polyme có thể được chiếu xạ bổ sung. Như một ví dụ không giới hạn, vật liệu polyme có thể được chiếu xạ gamma (Xem ví dụ, Ứng dụng quốc tế số WO201282165, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Các ví dụ không giới hạn về polyme cụ thể bao gồm poly(caprolacton) (PCL), polyme etylen vinyl axetat (EVA), poly(axit lactic) (PLA), poly(axit L-lactic) (PLLA), poly(axit glycolic) ( PGA), poly(axit lactic-co-glycolic axit) (PLGA), poly(axit L-lactic-co-glycolic) (PLLGA), poly(D,L-lactide) (PDLA), poly(L-lactide ) (PLLA), poly(D,L-lactide-co-caprolacton), poly(D,L-lactide-co-caprolactone-co-glycolide), poly(D,L-lactide-co-PEO-co-D ,L-lactide), poly(D,L-lactide-co-PPO-co-D,L-lactide), polyalkyl cyanoacralate, polyurethane, poly-L-lysine (PLL), hydroxypropyl methacrylate (HPMA), polyethyleneglycol, poly - Axit L-glutamic, poly(axit hydroxy), polyanhydrit, polyorthoeste, poly(ester amit), polyamit, poly(ete ete), polycarbonat, polyalkylene như polyetylen và polypropylen, polyalkylene glycol như poly(ethylene glycol) (PEG ), polyalkylene oxit (PEO), polyalkylene terephthalate như poly(ethylene terephthalate), rượu polyvinyl (PVA), polyvinyl ete, polyvinyl este như poly(vinyl axetat), polyvinyl halogenua như poly(vinyl clorua) (PVC), polyvinylpyrrolidone, polysiloxan, polystyren (PS), polyuretan, dẫn xuất xenluloza như alkyl xenluloza, hydroxyalkyl xenluloza, ete xenlulo, este xenlulo, nitro xenlulo, hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose, polyme của axit acrylic, như poly(metyl(meth)acrylat) ( PMMA), poly(etyl(met)acrylat), poly(butyl(met)acrylat), poly(isobutyl(met)acrylat), poly(hexyl(met)acrylat), poly(isodecyl(met)acrylat), poly( lauryl(met)acrylat), poly(phenyl(meth)acrylat), poly(metyl acrylat), poly(isopropyl acrylat), poly(isobutyl acrylat), poly(octadecyl acrylat) và copolyme và hỗn hợp của chúng, polydioxanone và copolyme của chúng, polyhydroxyalkanoat, polypropylen fumarat, polyoxymetylen, poloxamer, poly(ortho) este, poly(axit butyric), poly(axit valeric), poly(lactit-co-caprolacton), và trietylen cacbonat, polyvinylpyrolidon. Hạt nano lipid có thể được phủ hoặc liên kết với một chất đồng trùng hợp như, nhưng không giới hạn ở, chất đồng trùng hợp khối (như chất đồng trùng hợp khối polyete-polyamit phân nhánh được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2013012476, ở đây được đưa vào bằng cách viện dẫn trong phần của nó). toàn bộ) và (poly(ethylene glycol))-(poly(propylene oxit))-(poly(ethylene glycol)) triblock copolyme (xem ví dụ: Ấn bản Hoa Kỳ 20120121718 và Ấn bản Hoa Kỳ 20100003337 và Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 8,263,665; mỗi bản trong số này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Chất đồng trùng hợp có thể là một loại polyme thường được coi là an toàn (GRAS) và sự hình thành hạt nano lipid có thể theo cách mà không tạo ra thực thể hóa học mới nào. Ví dụ, hạt nano lipid có thể bao gồm các poloxamer phủ các hạt nano PLGA mà không tạo thành các thực thể hóa học mới mà vẫn có khả năng thấm nhanh vào chất nhầy của con người (Yang và cộng sự. Angew. Chem. Int. Ed. 2011 50:2597-2600; được đưa vào đây bằng cách tham khảo toàn bộ).
Vitamin của polyme-vitamin liên hợp có thể là vitamin E. Phần vitamin của hỗn hợp có thể được thay thế bằng các thành phần thích hợp khác như, nhưng không giới hạn ở, vitamin A, vitamin E, các vitamin khác, cholesterol, nửa kỵ nước, hoặc thành phần kỵ nước của các chất hoạt động bề mặt khác (ví dụ: chuỗi sterol, axit béo, chuỗi hydrocarbon và chuỗi alkylene oxit).
Hạt nano lipid được thiết kế để xuyên qua chất nhầy có thể bao gồm các chất biến đổi bề mặt như, nhưng không giới hạn ở, mmRNA, protein anion (ví dụ, albumin huyết thanh bò), chất hoạt động bề mặt (ví dụ, chất hoạt động bề mặt cation như ví dụ dimethyldioctadecyl-amoni bromua), đường hoặc dẫn xuất đường (ví dụ: cyclodextrin), axit nucleic, polyme (ví dụ: heparin, polyethylene glycol và poloxamer), chất làm tan chất nhầy (ví dụ: N-acetylcystein, ngải cứu, bromelain, papain, clerodendrum, acetylcystein, bromhexine, carbocisteine, eprazinone, mesna, ambroxol, sobrerol, domiodol, letosteine, stepronin, tiopronin, gelsolin, thymosin β4 dornase alfa, neltenexine, erdosteine) và các DNase khác nhau bao gồm rhDNase. Tác nhân thay đổi bề mặt có thể được nhúng hoặc gắn vào bề mặt của hạt hoặc được xử lý (ví dụ, bằng cách phủ, hấp phụ, liên kết cộng hóa trị hoặc quá trình khác) trên bề mặt của hạt nano lipid. (xem ví dụ, Ấn phẩm Hoa Kỳ 20100215580 và Ấn phẩm Hoa Kỳ 20080166414; mỗi ấn bản này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Các hạt nano lipid xuyên qua chất nhầy có thể bao gồm ít nhất một mmRNA được mô tả ở đây. MmRNA có thể được bao bọc trong hạt nano lipid và/hoặc được bố trí trên bề mặt của hạt. MmRNA có thể được liên kết cộng hóa trị với hạt nano lipid. Các chế phẩm chứa các hạt nano lipid thấm qua chất nhầy có thể bao gồm nhiều hạt nano. Hơn nữa, chế phẩm này có thể chứa các hạt mà có thể tương tác với chất nhầy và làm thay đổi đặc tính cấu trúc và/hoặc tính chất kết dính của chất nhầy xung quanh để làm giảm sự bám dính của chất nhầy mà có thể làm tăng sự phân phối các hạt nano lipid xuyên qua chất nhầy đến mô niêm mạc.
Theo một phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA được bào chế ở dạng lipoplex, chẳng hạn như, không giới hạn ở hệ thống ATUPLEX™, hệ thống DACC, hệ thống DBTC và công nghệ siRNA-lipoplex khác của Silence Therapeutics (London, Vương quốc Anh ), STEMFECT™ từ STEMGENT® (Cambridge, MA) và polyethylenimine (PEI) hoặc phân phối axit nucleic có mục tiêu và không có mục tiêu dựa trên protamine (Aleku và cộng sự. Cancer Res. 2008 68:9788-9798; Strumberg và cộng sự . Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78; Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel và cộng sự, Gene Ther 2006 13:1360-1370; . 2010 23:334-344; Kaufmann và cộng sự. Microvasc Res 2010 80:286-293Weide và cộng sự J Immunother. 2009 32:498-507; Ý kiến của chuyên gia. . Biol. Ther. 4:1285-1294; Fotin-Mleczek và cộng sự, 2011 J. Immunother. Proc Natl Acad Sci Hoa Kỳ 2007 6;Hum Gene There.2008 19:125-132; tất cả đều được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ).
Theo một phương án, các công thức như vậy cũng có thể được tạo ra hoặc chế phẩm được thay đổi sao cho chúng được hướng một cách thụ động hoặc chủ động đến các loại tế bào khác nhau in vivo, bao gồm nhưng không giới hạn ở tế bào gan, tế bào miễn dịch, tế bào khối u, tế bào nội mô, tế bào trình diện kháng nguyên và bạch cầu ( Akinc và cộng sự Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Song và cộng sự, Nat Biotechnol 2005 23:709-717; J Clin Invest 2009 119:661-673; Microvasc Res 2010 80:286-293; Santel và cộng sự, Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel và cộng sự, Gene Ther 2006 13:1360-1370; 334-344; Basha và cộng sự, Mol. 2011 19:2186-2200; Fenske và Cullis, Expert Opin Drug Deliv. Peer và Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133; tất cả đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Một ví dụ về việc nhắm mục tiêu thụ động của các chế phẩm vào tế bào gan bao gồm các chế phẩm hạt nano lipid dựa trên DLin-DMA, DLin-KC2-DMA và DLin-MC3-DMA đã được chứng minh là có khả năng liên kết với apolipoprotein E và thúc đẩy sự liên kết và hấp thu của các chế phẩm này vào tế bào gan. tế bào gan in vivo (Akinc et al. Mol Ther. 2010 18:1357-1364; ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Các công thức cũng có thể được nhắm mục tiêu có chọn lọc thông qua sự biểu hiện của các phối tử khác nhau trên bề mặt của chúng như được minh họa bởi nhưng không bị giới hạn bởi folate, transferrin, N-acetylgalactosamine (GalNAc) và các phương pháp nhắm mục tiêu vào kháng thể (Kolhatkar và cộng sự, Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197-206;Mặt trước Biosci.2011 16:1388-1412; Yu và cộng sự, Mol Membr Biol. 2010 27:286-298; Patil và cộng sự, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008 25:1-61; Benoit và cộng sự, Đại phân tử sinh học. 2011 12:2708-2714; Zhao và cộng sự, Chuyên gia Opin Drug Deliv. 2008 5:309-319; Akinc và cộng sự, Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Srinivasan và cộng sự, Phương pháp Mol Biol. 2012 820:105-116; Ben-Arie và cộng sự, Phương pháp Mol Biol. 2012 757:497-507; Bản phát hành kiểm soát ngang hàng 2010 J. 20:63-68; Peer và cộng sự, Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:4095-4100; Kim và cộng sự, Phương pháp Mol Biol. 2011 721:339-353; Subramanya và cộng sự, Mol Ther. 2010 18:2028-2037; Song và cộng sự, Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Peer và cộng sự, Khoa học. 2008 319:627-630; Peer và Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133; tất cả đều được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ).
Theo một phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA được bào chế ở dạng hạt nano lipid rắn. Hạt nano lipid rắn (SLN) có thể ở dạng hình cầu với đường kính trung bình từ 10 đến 1000 nm. SLN có ma trận lõi lipid rắn có thể hòa tan các phân tử ưa mỡ và có thể được ổn định bằng chất hoạt động bề mặt và/hoặc chất nhũ hóa. Theo một phương án khác, hạt nano lipid có thể là hạt nano lipid-polyme tự lắp ráp (xem Zhang và cộng sự, ACS Nano, 2008, 2 (8), trang 1696-1702; ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Liposome, lipoplexes hoặc hạt nano lipid có thể được sử dụng để cải thiện hiệu quả của quá trình sản xuất protein theo hướng polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA vì các chế phẩm này có thể làm tăng khả năng chuyển hóa tế bào bởi polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA; và/hoặc tăng sự dịch mã của protein được mã hóa. Một ví dụ như vậy liên quan đến việc sử dụng quá trình đóng gói lipid để cho phép phân phối DNA polyplex plasmid một cách hiệu quả vào hệ thống (Heyes và cộng sự, Mol Ther. 2007 15:713-720; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Liposome, lipoplexes hoặc hạt nano lipid cũng có thể được sử dụng để tăng tính ổn định của polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một, và/hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra để giải phóng có kiểm soát và/hoặc phân phối mục tiêu. Như được sử dụng ở đây, “giải phóng có kiểm soát” được dùng để chỉ dược phẩm hoặc profin giải phóng hợp chất phù hợp với dạng giải phóng cụ thể để tạo ra kết quả điều trị. Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được bao nang trong chất phân phối được mô tả ở đây và/hoặc đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này để giải phóng kiểm soát và/hoặc phân phối mục tiêu. Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “đóng gói” có nghĩa là bao bọc, bao quanh hoặc bao bọc. Vì nó liên quan đến công thức của các hợp chất theo sáng chế, việc đóng gói có thể là đáng kể, toàn bộ hoặc một phần. Thuật ngữ “được đóng gói gần như” có nghĩa là ít nhất lớn hơn 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,9 hoặc lớn hơn 99,999% dược phẩm hoặc hợp chất của sáng chế có thể được bao bọc, bao bọc hoặc bao bọc bên trong đại lý giao hàng. “Đóng gói một phần” có nghĩa là ít hơn 10, 10, 20, 30, 40 50 hoặc ít hơn dược phẩm hoặc hợp chất theo sáng chế có thể được bao bọc, bao bọc hoặc bao bọc bên trong chất phân phối. Tốt hơn là, sự bao nang có thể được xác định bằng cách đo độ thoát hoặc hoạt tính của dược phẩm hoặc hợp chất theo sáng chế bằng cách sử dụng huỳnh quang và/hoặc vi sóng điện tử. Ví dụ: ít nhất 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 hoặc lớn hơn 99,99% dược chất chế phẩm hoặc hợp chất theo sáng chế được đóng gói trong chất phân phối.
Theo một phương án, chế phẩm giải phóng kiểm soát có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, copolyme ba khối. Như một ví dụ không giới hạn, chế phẩm này có thể bao gồm hai loại copolyme ba khối khác nhau (Nhà xuất bản Quốc tế. Số WO2012131104 và WO2012131106; mỗi loại trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được bao bọc thành hạt nano lipid hoặc hạt nano lipid được loại bỏ nhanh chóng và sau đó các hạt nano lipid hoặc hạt nano lipid được loại bỏ nhanh chóng có thể được bao bọc trong polyme, hydrogel và/hoặc chất bịt kín phẫu thuật được mô tả ở đây và/hoặc đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này. Như một ví dụ không giới hạn, polyme, hydrogel hoặc chất bịt kín phẫu thuật có thể là PLGA, ethylene vinyl axetat (EVAc), poloxamer, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA), chất bịt kín phẫu thuật như polyme fibrinogen (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), chất bịt kín gốc PEG và COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL).
Theo một phương án khác, hạt nano lipid có thể được bao bọc trong polyme bất kỳ đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này mà có thể tạo thành gel khi được tiêm vào đối tượng. Như một ví dụ không giới hạn khác, hạt nano lipid có thể được bao bọc trong nền polyme mà có thể phân hủy sinh học.
Theo một phương án, chế phẩm polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA để giải phóng kiểm soát và/hoặc phân phối mục tiêu cũng có thể bao gồm ít nhất một lớp phủ giải phóng kiểm soát. Các lớp phủ giải phóng có kiểm soát bao gồm, nhưng không giới hạn ở OPADRY®, chất đồng trùng hợp polyvinylpyrrolidone/vinyl axetat, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropyl methylcellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, EUDRAGIT RL®, EUDRAGIT RS® và các dẫn xuất cellulose như chất phân tán nước ethylcellulose (AQUACOAT® và SOLELEASE®).
Theo một phương án, chế phẩm giải phóng kiểm soát và/hoặc chế phẩm phân phối mục tiêu có thể chứa ít nhất một polyeste có thể phân hủy mà có thể chứa chuỗi bên polycation. Các polyeste có thể phân hủy bao gồm, nhưng không giới hạn ở, poly(serine este), poly(L-lactide-co-L-lysine), poly(4-hydroxy-L-proline este), và hỗn hợp của chúng. Theo một phương án khác, các polyeste phân hủy được có thể bao gồm liên hợp PEG để tạo thành polyme PEGylat.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một, và/hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được bao bọc trong hạt nano trị liệu. Các hạt nano trị liệu có thể được bào chế bằng các phương pháp được mô tả ở đây và đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, Số Công bố Quốc tế WO2010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, WO2012054923, Công ty Hoa Kỳ. Số US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286 và US20120288541 và Bằng sáng chế Hoa Kỳ. Các số 8.206.747, 8.293.276, 8.318.208 và 8.318.211, mỗi số này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo một phương án khác, các hạt nano polyme trị liệu có thể được xác định bằng các phương pháp được mô tả trong US Pub số US20120140790, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, hạt nano trị liệu có thể được bào chế để giải phóng kéo dài. Như được sử dụng ở đây, “giải phóng kéo dài” được dùng để chỉ dược phẩm hoặc hợp chất phù hợp với tốc độ giải phóng trong một khoảng thời gian cụ thể. Khoảng thời gian này có thể bao gồm nhưng không giới hạn ở giờ, ngày, tuần, tháng và năm. Như một ví dụ không giới hạn, hạt nano giải phóng kéo dài có thể bao gồm polyme và chất điều trị như, nhưng không giới hạn ở, polynucleotit, cấu trúc sơ cấp, và mmRNA theo sáng chế (xem International Pub No. 2010075072 và US Pub No. . US20100216804, US20110217377 và US20120201859, mỗi thông số này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, các hạt nano trị liệu có thể được bào chế để có mục tiêu cụ thể. Là một ví dụ không giới hạn, các hạt nano điều trị có thể bao gồm corticosteroid (xem Công bố Quốc tế. Số WO2011084518; ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Theo một phương án, các hạt nano trị liệu có thể được bào chế để đặc hiệu cho bệnh ung thư. Như một ví dụ không giới hạn, các hạt nano trị liệu có thể được bào chế ở dạng hạt nano được mô tả trong International Pub No. WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 và US Pub No. US20100069426, US20120004293 và US20100104655, mỗi loại đều có ở đây được kết hợp toàn bộ bằng cách tham chiếu .
Theo một phương án, các hạt nano theo sáng chế có thể bao gồm nền polyme. Như một ví dụ không giới hạn, hạt nano có thể bao gồm hai hoặc nhiều polyme như, nhưng không giới hạn ở, polyetylen, polycarbonat, polyanhydrua, polyhydroxyaxit, polypropylfumerat, polycaprolacton, polyamit, polyaxetat, polyete, polyeste, poly(orthoeste), polycyanoacrylat, rượu polyvinyl, polyuretan, polyphosphazen, polyacrylat, polymethacrylat, polycyanoacrylat, polyureas, polystyren, polyamines, polylysine, poly(ethylene imine), poly(serine ester), poly(L-lactide-co-L-lysine), poly(4- este hydroxy-L-proline) hoặc hỗn hợp của chúng.
Theo một phương án, hạt nano trị liệu bao gồm copolyme diblock. Theo một phương án, copolyme diblock có thể bao gồm PEG kết hợp với polyme như, nhưng không giới hạn ở, polyetylen, polycarbonat, polyanhydrit, polyhydroxyaxit, polypropylfumerat, polycaprolacton, polyamit, polyaxetat, polyete, polyeste, poly(orthoeste), polycyanoacrylat, rượu polyvinyl, polyuretan, polyphosphazen, polyacrylat, polymethacrylat, polycyanoacrylat, polyureas, polystyren, polyamines, polylysine, poly(ethylene imine), poly(serine ester), poly(L-lactide-co-L-lysine), poly(4- este hydroxy-L-proline) hoặc hỗn hợp của chúng.
Là một ví dụ không giới hạn, hạt nano trị liệu bao gồm chất đồng trùng hợp khối PLGA-PEG (xem Công bố Hoa Kỳ. Số US20120004293 và Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 8.236.330, mỗi trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Trong một ví dụ không giới hạn khác, hạt nano trị liệu là hạt nano tàng hình bao gồm copolyme hai khối của PEG và PLA hoặc PEG và PLGA (xem Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 8,246,968 và Công bố Quốc tế số WO2012166923, mỗi trong số đó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn trong toàn bộ của nó).
Theo một phương án, hạt nano điều trị có thể bao gồm copolyme đa khối (Xem ví dụ, Pat. Hoa Kỳ số 8,263,665 và 8,287,910; mỗi trong số đó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ).
Theo một phương án, khối copolyme được mô tả ở đây có thể được bao gồm trong phức polyion bao gồm mixen không polyme và khối copolyme. (Xem ví dụ: Nhà xuất bản Hoa Kỳ số 20120076836; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, hạt nano trị liệu có thể bao gồm ít nhất một polyme acrylic. Các polyme acrylic bao gồm nhưng không giới hạn ở, axit acrylic, axit metacrylic, copolyme axit acrylic và axit methacrylic, copolyme metyl methacrylat, ethoxyetyl methacrylat, cyanoetyl methacrylat, copolyme amino alkyl methacrylat, poly(axit acrylic), poly(axit metacrylic), polycyanoacrylat và sự kết hợp của chúng.
Theo một phương án, hạt nano trị liệu có thể bao gồm ít nhất một polyme cation được mô tả ở đây và/hoặc đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này.
Theo một phương án, các hạt nano trị liệu có thể bao gồm ít nhất một polyme chứa amin như, nhưng không giới hạn ở polylysine, polyetylen imine, dendrimer poly(amidoamine), poly(beta-amino este) (Xem ví dụ: US Pat. No. 8.287.849; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn) và sự kết hợp của chúng.
Theo một phương án, các hạt nano trị liệu có thể bao gồm ít nhất một polyeste có thể phân hủy mà có thể chứa chuỗi bên polycation. Các polyeste có thể phân hủy bao gồm, nhưng không giới hạn ở, poly(serine este), poly(L-lactide-co-L-lysine), poly(4-hydroxy-L-proline este), và hỗn hợp của chúng. Theo một phương án khác, các polyeste phân hủy được có thể bao gồm liên hợp PEG để tạo thành polyme PEGylat.
Theo một phương án khác, hạt nano trị liệu có thể bao gồm sự liên hợp của ít nhất một phối tử nhắm mục tiêu. Phối tử nhắm mục tiêu có thể là phối tử bất kỳ đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, kháng thể đơn dòng. (Kirpotin và cộng sự, Cancer Res. 2006 66:6732-6740; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, hạt nano điều trị có thể được bào chế ở dạng dung dịch nước mà có thể được sử dụng để điều trị bệnh ung thư (xem Số xuất bản quốc tế WO2011084513 và Số xuất bản Hoa Kỳ US20110294717, mỗi trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA có thể được bao bọc trong, liên kết với và/hoặc liên kết với các chất mang nano tổng hợp. Các chất mang nano tổng hợp bao gồm, nhưng không giới hạn, những chất được mô tả trong International Pub. Số WO2010005740, WO2010030763, WO201213501, WO2012149252, WO2012149255, WO2012149259, WO2012149265, WO2012149268, WO2012149282, WO20 12149301, WO2012149393, WO2012149405, WO2012149411, WO2012149454 và WO2013019669, và US Pub. Số US20110262491, US20100104645, US20100087337 và US20120244222, mỗi thông số này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Các chất mang nano tổng hợp có thể được tạo ra bằng cách sử dụng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc được mô tả ở đây. Là một ví dụ không giới hạn, các chất mang nano tổng hợp có thể được tạo ra bằng các phương pháp được mô tả trong Số Công bố Quốc tế WO2010005740, WO2010030763 và WO201213501 và Công bố Hoa Kỳ. Số US20110262491, US20100104645, US20100087337 và US2012024422, mỗi thông số này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo một phương án khác, chế phẩm chất mang nano tổng hợp có thể được đông khô bằng các phương pháp được mô tả trong International Pub. Số WO2011072218 và Bằng sáng chế Hoa Kỳ. số 8.211.473; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, các chất mang nano tổng hợp có thể chứa các nhóm phản ứng để giải phóng polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA được mô tả ở đây (xem Nhà xuất bản Quốc tế. Số WO20120952552 và Nhà xuất bản Hoa Kỳ số US20120171229, mỗi nhóm trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn ).
Theo một phương án, chất mang nano tổng hợp có thể chứa tác nhân kích thích miễn dịch để tăng cường đáp ứng miễn dịch từ việc phân phối chất mang nano tổng hợp. Là một ví dụ không giới hạn, chất mang nano tổng hợp có thể bao gồm tác nhân kích thích miễn dịch Th1 mà có thể tăng cường phản ứng dựa trên Th1 của hệ thống miễn dịch (xem Công bố quốc tế số WO2010123569 và Công bố Hoa Kỳ số US20110223201, mỗi công cụ trong số đó được đưa vào đây bởi toàn bộ tài liệu tham khảo).
Theo một phương án, các chất mang nano tổng hợp có thể được tạo ra để giải phóng mục tiêu. Theo một phương án, chất mang nano tổng hợp được bào chế để giải phóng các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp và/hoặc mmRNA ở độ pH xác định và/hoặc sau khoảng thời gian mong muốn. Như một ví dụ không giới hạn, hạt nano tổng hợp có thể được bào chế để giải phóng các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp và/hoặc mmRNA sau 24 giờ và/hoặc ở độ pH bằng 4,5 (xem Số xuất bản quốc tế WO2010138193 và WO2010138194 và Số xuất bản Hoa Kỳ. US20110020388 và US20110027217, mỗi thông số này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, các chất mang nano tổng hợp có thể được bào chế để giải phóng có kiểm soát và/hoặc duy trì các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA được mô tả ở đây. Là một ví dụ không giới hạn, các chất mang nano tổng hợp để giải phóng kéo dài có thể được tạo ra bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này, được mô tả ở đây và/hoặc như được mô tả trong Số xuất bản quốc tế WO2010138192 và Số xuất bản Hoa Kỳ 20100303850, mỗi phương pháp trong số đó được đưa vào đây bởi tham khảo đầy đủ.
Theo một phương án, chất mang nano tổng hợp có thể được bào chế để sử dụng làm vắc xin. Theo một phương án, chất mang nano tổng hợp có thể bao bọc ít nhất một polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA mã hóa ít nhất một kháng nguyên. Là một ví dụ không giới hạn, chất mang nano tổng hợp có thể bao gồm ít nhất một kháng nguyên và tá dược cho dạng bào chế vắc-xin (xem Số xuất bản quốc tế WO2011150264 và Số xuất bản Hoa Kỳ US20110293723, mỗi trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn) . Như một ví dụ không giới hạn khác, dạng bào chế vắc-xin có thể bao gồm ít nhất hai chất mang nano tổng hợp có kháng nguyên giống hoặc khác nhau và tá dược (xem Số xuất bản quốc tế WO2011150249 và Số xuất bản Hoa Kỳ US20110293701, mỗi chất này được đưa vào đây bằng cách viện dẫn trong toàn bộ của chúng). Dạng liều vắc xin này có thể được chọn bằng các phương pháp được mô tả ở đây, đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc được mô tả trong International Pub No. WO2011150258 và US Pub No. US20120027806, mỗi phương pháp trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, chất mang nano tổng hợp có thể bao gồm ít nhất một polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA mã hóa ít nhất một tá dược. Như ví dụ không giới hạn, tá dược này có thể bao gồm dimethyldioctadecylamoni-bromua, dimethyldioctadecylamoni-clorua, dimetyldioctadecylamoni-phosphat hoặc dimethyldioctadecylamoni-axetat (DDA) và phần phân cực hoặc một phần của phần phân cực nói trên của toàn bộ dịch chiết lipid của dược chấtvi khuẩn mycobacteria(Xem ví dụ: Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 8.241.610; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Theo một phương án khác, chất mang nano tổng hợp có thể bao gồm ít nhất một polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA và tá dược. Là một ví dụ không giới hạn, chất mang nano tổng hợp bao gồm và chất bổ trợ có thể được bào chế bằng các phương pháp được mô tả trong Số xuất bản quốc tế WO2011150240 và Số xuất bản Hoa Kỳ US20110293700, mỗi phương pháp này được đưa toàn bộ vào bản mô tả này bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, chất mang nano tổng hợp có thể bao bọc ít nhất một polynucleotit, cấu trúc sơ cấp và/hoặc mmRNA mã hóa peptit, đoạn hoặc vùng từ vi rút. Là một ví dụ không giới hạn, sóng mang nano tổng hợp có thể bao gồm nhưng không giới hạn ở các sóng mang nano được mô tả trong Số công bố quốc tế WO2012024621, WO201202629, WO2012024632 và Số công bố Hoa Kỳ US20120064110, US20120058153 và US20120058154, mỗi trong số đó được đưa vào đây bởi tham khảo đầy đủ.
Theo một phương án, chất mang nano tổng hợp có thể được ghép nối với polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA mà có thể kích hoạt phản ứng thể dịch và/hoặc tế bào lympho T gây độc tế bào (CTL) (Xem ví dụ: Công bố quốc tế số WO2013019669, ở đây được đưa vào bằng cách tham chiếu toàn bộ).
Theo một phương án, hạt nano có thể được tối ưu hóa để sử dụng qua đường miệng. Hạt nano này có thể bao gồm ít nhất một polyme sinh học dạng cation như, nhưng không giới hạn ở, chitosan hoặc dẫn xuất của nó. Như một ví dụ không giới hạn, hạt nano có thể được tạo ra bằng các phương pháp được mô tả trong US Pub. số 20120282343; ở đây được đưa toàn bộ vào bằng cách viện dẫn.
Polyme, hạt nano phân hủy sinh học và hạt nano lõi-vỏ
Polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmARN theo sáng chế có thể được tạo ra bằng cách sử dụng các polyme tự nhiên và/hoặc tổng hợp. Các ví dụ không giới hạn về polyme có thể được sử dụng để phân phối bao gồm nhưng không giới hạn ở các công thức DYNAMIC POLYCONJUGATE® (Arrowhead Reasearch Corp., Pasadena, CA) từ MIRUS® Bio (Madison, WI) và Roche Madison (Madison, WI) ), các công thức polymer PHASERX™ chẳng hạn như, nhưng không giới hạn, SMARTT POLYMER TECHNOLOGY™ (PHASERX®, Seattle, WA), DMRI/DOPE, poloxamer, tá dược VAXFECTIN® từ Vical (San Diego, CA), chitosan, cyclodextrin từ Calando Pharmaceuticals ( Pasadena, CA), dendrimer và polyme poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA). Các polyme RONDEL™ (Phân phối hạt nano RNAi/Oligonucleotide) (Arrowhead Research Corporation, Pasadena, CA) và các polyme đồng khối đáp ứng pH như, nhưng không giới hạn ở PHASERX® (Seattle, WA).
Ví dụ không giới hạn về công thức chitosan bao gồm lõi chitosan tích điện dương và phần bên ngoài của chất nền tích điện âm (Nhà xuất bản Hoa Kỳ số 20120258176; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Chitosan bao gồm, nhưng không giới hạn ở N-trimethyl chitosan, mono-N-carboxymethyl chitosan (MCC), N-palmitoyl chitosan (NPCS), EDTA-chitosan, chitosan trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất chitosan, hoặc tổ hợp của chúng.
Theo một phương án, polyme được sử dụng theo sáng chế đã trải qua quá trình xử lý để giảm và/hoặc ức chế sự gắn kết của các chất không mong muốn như, nhưng không giới hạn ở, vi khuẩn, trên bề mặt của polyme. Polyme có thể được xử lý bằng các phương pháp đã biết và/hoặc được mô tả trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc được mô tả trong International Pub. Số WO2012150467, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Một ví dụ không giới hạn về công thức PLGA bao gồm, nhưng không giới hạn ở, kho dự trữ có thể tiêm PLGA (ví dụ, ELIGARD® được tạo thành bằng cách hòa tan PLGA trong 66% N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) và phần còn lại là dung môi nước và leuprolide. Sau khi tiêm, PLGA và peptide leuprolide sẽ kết tủa vào khoang dưới da).
Nhiều phương pháp tiếp cận polyme này đã chứng minh tính hiệu quả trong việc đưa oligonucleotide in vivo vào tế bào chất của tế bào (được xem xét trong deFougerollesHum Gene There.2008 19:125-132; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Hai phương pháp polyme đã mang lại khả năng phân phối axit nucleic mạnh mẽ in vivo, trong trường hợp này với RNA can thiệp nhỏ (siRNA), là các polyconjugate động và các hạt nano dựa trên cyclodextrin. Phương pháp phân phối đầu tiên trong số này sử dụng các đa liên hợp động và đã được chứng minh trên cơ thể chuột là có khả năng cung cấp siRNA và làm im lặng mRNA mục tiêu nội sinh một cách hiệu quả trong tế bào gan (Rozema và cộng sự, Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887; được kết hợp ở đây bởi toàn bộ tài liệu tham khảo). Cách tiếp cận cụ thể này là một hệ thống polyme đa thành phần có các đặc điểm chính bao gồm polyme hoạt động màng mà axit nucleic, trong trường hợp này là siRNA, được liên kết cộng hóa trị thông qua liên kết disulfide và trong đó cả PEG (để che điện tích) và N-acetylgalactosamine (cho tế bào gan) nhắm mục tiêu) được liên kết thông qua các liên kết nhạy cảm với pH (Rozema và cộng sự, Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Khi liên kết với tế bào gan và xâm nhập vào nội nhũ, phức hợp polyme sẽ phân tách trong môi trường có độ pH thấp, khiến polyme bộc lộ điện tích dương, dẫn đến sự thoát ra khỏi nội bào và giải phóng siRNA ra khỏi polyme vào tế bào chất. Thông qua việc thay thế nhóm N-acetylgalactosamine bằng nhóm mannose, người ta cho thấy người ta có thể thay đổi mục tiêu từ tế bào gan biểu hiện thụ thể asialoglycoprotein sang tế bào nội mô hình sin và tế bào Kupffer. Một phương pháp polyme khác liên quan đến việc sử dụng các hạt nano polycation chứa cyclodextrin nhắm mục tiêu transferrin. Các hạt nano này đã chứng minh khả năng làm im lặng có chủ đích của sản phẩm gen EWS-FLI1 trong các tế bào khối u sarcoma Ewing biểu hiện thụ thể transferrin (Hu-Lieskovan và cộng sự, Cancer Res. 2005 65: 8984-8982; ở đây được đưa toàn bộ vào bằng cách tham chiếu) và siRNA được tạo ra trong các hạt nano này được dung nạp tốt ở các loài linh trưởng không phải người (Heidel và cộng sự, Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Cả hai chiến lược phân phối này đều kết hợp các phương pháp tiếp cận hợp lý bằng cách sử dụng cả cơ chế phân phối có mục tiêu và cơ chế thoát nội sinh.
Chế phẩm polyme có thể cho phép giải phóng kéo dài hoặc trì hoãn polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA (ví dụ, sau khi tiêm trong cơ hoặc tiêm dưới da). Cấu hình giải phóng bị thay đổi của polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA có thể dẫn đến, ví dụ, dịch mã protein được mã hóa trong một khoảng thời gian dài. Chế phẩm polyme cũng có thể được sử dụng để tăng độ ổn định của polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmARN. Các polyme phân hủy sinh học trước đây đã được sử dụng để bảo vệ các axit nucleic khác ngoài mmRNA khỏi bị thoái hóa và đã được chứng minh là mang lại sự giải phóng bền vững các khối lượng trong cơ thể (Rozema và cộng sự, Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887; Sullivan và cộng sự. , Expert Opin Drug Deliv. 2010 7:1433-1446; Convertine và cộng sự, Đại phân tử sinh học ngày 1 tháng 10 năm 2010; Chu và cộng sự, Acc Chem Res. ngày 13 tháng 1 năm 2012; -2309; Benoit và cộng sự, Đại phân tử sinh học 2011 12:2708-2714; Singha và cộng sự, Axit Nucleic Ther. 2011 2:133-147; deFougerolles Hum Gene Ther. There. 2008 16:1131-1138; Chaturvedi và cộng sự, Expert Opin Drug Deliv. 2011 8:1455-1468; Davis, Mol Pharm 2009 6:659-668; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, dược phẩm có thể là chế phẩm giải phóng kéo dài. Theo một phương án khác, chế phẩm giải phóng kéo dài có thể được phân phối dưới da. Công thức giải phóng bền vững có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, vi cầu PLGA, ethylene vinyl acetate (EVAc), poloxamer, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA), chất bịt kín phẫu thuật như dưới dạng polyme fibrinogen (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, TL), chất bịt kín gốc PEG và COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, TL).
Như một ví dụ không giới hạn, mARN biến đổi có thể được tạo ra trong vi cầu PLGA bằng cách chuẩn bị các vi cầu PLGA với tốc độ giải phóng có thể điều chỉnh được (ví dụ, ngày và tuần) và bao bọc mARN biến đổi trong vi cầu PLGA trong khi vẫn duy trì tính toàn vẹn của mARN biến đổi trong quá trình đóng gói quá trình. EVAc là các polyme không phân hủy sinh học, tương thích sinh học, được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng cấy ghép giải phóng kéo dài tiền lâm sàng (ví dụ: các sản phẩm giải phóng kéo dài Ocusert một miếng chèn nhãn khoa pilocarpine cho bệnh tăng nhãn áp hoặc progestasert một loại thuốc giải phóng kéo dài trong tử cung; hệ thống phân phối qua da Testoderm, Duragesic và Selegiline ; ống thông). Poloxamer F-407 NF là chất đồng trùng hợp triblock chất hoạt động bề mặt không ion, ưa nước của polyoxyethylene-polyoxypropylene-polyoxyethylene có độ nhớt thấp ở nhiệt độ dưới 5° C. và tạo thành gel rắn ở nhiệt độ lớn hơn 15° C. Phẫu thuật dựa trên PEG chất bịt kín bao gồm hai thành phần PEG tổng hợp được trộn trong một thiết bị phân phối có thể được chuẩn bị trong một phút, bịt kín trong 3 phút và được tái hấp thu trong vòng 30 ngày. GELSITE® và các polyme tự nhiên có khả năng tạo gel tại chỗ tại chỗ sử dụng. Chúng đã được chứng minh là có khả năng tương tác với các ứng cử viên trị liệu bằng protein và peptide thông qua quá trình khử ion để mang lại hiệu quả ổn định.
Các chế phẩm polyme cũng có thể có mục tiêu chọn lọc thông qua sự biểu hiện các phối tử khác nhau như được lấy làm ví dụ nhưng không bị giới hạn bởi, folate, transferrin, và N-acetylgalactosamine (GalNAc) (Benoit và cộng sự, Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Rozema và cộng sự ., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887; Davis, Mol Pharm 2009 6:659-668; Davis, Nature 2010 464:1067-1070;
Axit nucleic biến đổi, và mmARN theo sáng chế có thể được bào chế bằng hoặc ở trong hợp chất polyme. Polyme này có thể bao gồm ít nhất một polyme như, nhưng không giới hạn ở, polyethene, polyetylen glycol (PEG), poly(l-lysine)(PLL), PEG được ghép vào PLL, lipopolyme cation, lipopolyme cation có thể phân hủy sinh học, polyetylen (PEI) , poly(alkylene imines) liên kết ngang, dẫn xuất polyamine, poloxamer biến tính, polyme phân hủy sinh học, polyme đàn hồi phân hủy sinh học, chất đồng trùng hợp khối phân hủy sinh học, chất đồng trùng hợp ngẫu nhiên có khả năng phân hủy sinh học, chất đồng trùng hợp polyester phân hủy sinh học, chất đồng trùng hợp khối polyester phân hủy sinh học, chất đồng trùng hợp ngẫu nhiên khối polyester phân hủy sinh học, copolyme đa khối, copolyme tuyến tính có khả năng phân hủy sinh học, poly[α-(4-aminobutyl)-L-glycolic acid) (PAGA), copolyme đa khối cation liên kết ngang có thể phân hủy sinh học, polycacbonat, polyanhydrit, polyhydroxyaxit, polypropylfumerat, polycaprolacton, polyamit, polyaxetat, polyete, polyeste, poly(orthoeste), polycyanoacrylat, rượu polyvinyl, polyurethan, polyphosphazenes, polyacrylat, polymethacrylat, polycyanoacrylat, polyureas, polystyren, polyamines, polylysine, poly(ethylene imine), poly(serine ester), poly(L-lactide- co-L-lysine), poly(4-hydroxy-L-proline este), polyme acrylic, polyme chứa amin, polyme dextran, dẫn xuất polyme dextran hoặc hỗn hợp của chúng.
Như một ví dụ không giới hạn, axit nucleic biến đổi hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra bằng hợp chất polyme của PEG được ghép với PLL như được mô tả trong US Pat. số 6.177.274; ở đây được đưa toàn bộ vào bằng cách viện dẫn. Chế phẩm này có thể được sử dụng để truyền nhiễm tế bào in vitro hoặc để phân phối axit nucleic biến đổi và mmRNA in vivo. Trong một ví dụ khác, axit nucleic biến đổi và mmRNA có thể được tạo huyền phù trong dung dịch hoặc môi trường có polyme cation, trong dược phẩm khô hoặc trong dung dịch có thể làm khô như được mô tả trong US Pub. Số 20090042829 và 20090042825; mỗi nội dung đó đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Như một ví dụ không giới hạn khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra bằng copolyme khối PLGA-PEG (xem Bản công bố Hoa Kỳ số US20120004293 và Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 8,236,330, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn) hoặc copolyme khối PLGA-PEG-PLGA (Xem Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 6,004,573, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Như một ví dụ không giới hạn, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra bằng copolyme diblock của PEG và PLA hoặc PEG và PLGA (xem Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 8.246.968, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Dẫn xuất polyamine có thể được sử dụng để cung cấp axit nucleic hoặc để điều trị và/hoặc ngăn ngừa bệnh hoặc được đưa vào thiết bị cấy ghép hoặc tiêm (Nhà xuất bản Hoa Kỳ số 20100260817 được đưa toàn bộ vào đây bằng cách tham chiếu). Như một ví dụ không giới hạn, dược phẩm có thể bao gồm axit nucleic và mmRNA đã biến đổi và dẫn xuất polyamine được mô tả trong US Pub. Số 20100260817 (nội dung của nó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Như một ví dụ không giới hạn, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA theo sáng chế có thể được phân phối bằng cách sử dụng polyme polyaminde như, nhưng không giới hạn ở, polyme bao gồm polyme bổ sung 1,3 lưỡng cực được điều chế bằng cách kết hợp monome carbohydrate diazide với dilkyne liên hợp bao gồm oligoamine (Patent Hoa Kỳ số 8,236,280; ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra với ít nhất một polyme và/hoặc dẫn xuất của chúng được mô tả trong Số Công bố Quốc tế WO2011115862, WO2012082574 và WO2012068187 và Nhà xuất bản Hoa Kỳ. Số 20120283427, mỗi thông số đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo một phương án khác, axit nucleic biến đổi hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra bằng polyme có công thức Z như được mô tả trong WO2011115862, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo một phương án khác nữa, axit nucleic biến đổi hoặc mmRNA có thể được bào chế bằng polyme có công thức Z, Z′ hoặc Z″ như được mô tả trong International Pub. Số WO2012082574 hoặc WO2012068187 và US Pub. Số 2012028342, mỗi thông số đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Các polyme được tạo ra từ ARN biến đổi theo sáng chế có thể được tổng hợp bằng các phương pháp được mô tả trong International Pub. Số WO2012082574 hoặc WO2012068187, mỗi số đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế có thể được tạo ra với ít nhất một polyme acrylic. Các polyme acrylic bao gồm nhưng không giới hạn ở, axit acrylic, axit metacrylic, copolyme axit acrylic và axit methacrylic, copolyme metyl methacrylat, ethoxyetyl methacrylat, cyanoetyl methacrylat, copolyme amino alkyl methacrylat, poly(axit acrylic), poly(axit metacrylic), polycyanoacrylat và sự kết hợp của chúng.
Các chế phẩm chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể bao gồm ít nhất một polyme chứa amin như, nhưng không giới hạn ở polylysine, polyetylen imine, poly(amidoamine) dendrimer hoặc tổ hợp của chúng.
Ví dụ, axit nucleic biến đổi hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra trong hợp chất dược phẩm bao gồm poly(alkylene imine), lipopolyme cation có thể phân hủy sinh học, copolyme khối có thể phân hủy sinh học, polyme có thể phân hủy sinh học, hoặc copolyme ngẫu nhiên có thể phân hủy sinh học, polyeste có thể phân hủy sinh học. copolyme khối, polyme polyester có thể phân hủy sinh học, copolyme ngẫu nhiên polyester có thể phân hủy sinh học, copolyme tuyến tính có thể phân hủy sinh học, PAGA, copolyme đa khối cation liên kết ngang có thể phân hủy sinh học hoặc tổ hợp của chúng. Lipopolyme cation có khả năng phân hủy sinh học có thể được tạo ra bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc được mô tả trong US Pat. Số 6.696.038, Ứng dụng của Hoa Kỳ. Số 20030073619 và 20040142474, mỗi thông số này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Poly(alkylene imine) có thể được tạo ra bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc như được mô tả trong US Pub. Số 20100004315, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Polyme phân hủy sinh học, copolyme khối có thể phân hủy sinh học, copolyme ngẫu nhiên có thể phân hủy sinh học, copolyme khối polyester phân hủy sinh học, polyme polyeste phân hủy sinh học hoặc copolyme ngẫu nhiên polyeste phân hủy sinh học có thể được tạo ra bằng cách sử dụng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc như được mô tả trong Pat của Mỹ. Các số 6.517.869 và 6.267.987, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Copolyme tuyến tính có khả năng phân hủy sinh học có thể được tạo ra bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc như được mô tả trong US Pat. Số 6.652.886. Polyme PAGA có thể được tạo ra bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc như được mô tả trong US Pat. Số 6.217.912 được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Polyme PAGA có thể được đồng trùng hợp để tạo thành copolyme hoặc copolyme khối với các polyme như nhưng không giới hạn ở, poly-L-lysine, polyargine, polyornithine, histone, avidin, protamine, polylactide và poly(lactide-co-glycolide). Các copolyme đa khối cation liên kết ngang có khả năng phân hủy sinh học có thể được làm cho phương pháp của tôi được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc như được mô tả trong US Pat. Số 8.057.821 hoặc Nhà xuất bản Hoa Kỳ. Số 2012009145, mỗi nội dung trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Ví dụ, các copolyme nhiều khối có thể được tổng hợp bằng cách sử dụng các khối polyetylen tuyến tính (LPEI) có các mẫu riêng biệt so với các polyetylen phân nhánh. Hơn nữa, chế phẩm hoặc dược phẩm này có thể được tạo ra bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này, được mô tả ở đây, hoặc như được mô tả trong US Pub. Số 20100004315 hoặc Bằng sáng chế Hoa Kỳ. Các số 6.267.987 và 6.217.912, mỗi số đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmARN theo sáng chế có thể được tạo ra với ít nhất một polyeste có thể phân hủy mà có thể chứa các chuỗi bên polycation. Các polyeste có thể phân hủy bao gồm, nhưng không giới hạn ở, poly(serine este), poly(L-lactide-co-L-lysine), poly(4-hydroxy-L-proline este), và hỗn hợp của chúng. Theo một phương án khác, các polyeste phân hủy được có thể bao gồm liên hợp PEG để tạo thành polyme PEGylat.
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một, mmARN theo sáng chế có thể được tạo ra với ít nhất một polyeste có thể liên kết ngang. Các polyeste có thể liên kết ngang bao gồm các polyeste đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và được mô tả trong US Pub. Số 20120269761, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, các polyme được mô tả ở đây có thể được liên hợp với PEG kết thúc lipid. Như một ví dụ không giới hạn, PLGA có thể được liên hợp với PEG kết thúc lipid tạo thành PLGA-DSPE-PEG. Như một ví dụ không giới hạn khác, các liên hợp PEG để sử dụng theo sáng chế được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2008103276, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Các polyme có thể được liên hợp bằng cách sử dụng liên hợp phối tử như, nhưng không giới hạn ở, các liên hợp được mô tả trong Pat. Số 8.273.363, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, ARN biến đổi được mô tả ở đây có thể được liên hợp với hợp chất khác. Các ví dụ không giới hạn về liên hợp được mô tả trong US Pat. Số 7.964.578 và 7.833.992, mỗi số này đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo một phương án khác, ARN biến đổi theo sáng chế có thể được liên hợp với các liên hợp có công thức 1-122 như được mô tả trong US Pat. Số 7.964.578 và 7.833.992, mỗi số này đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA được mô tả ở đây có thể được liên hợp với kim loại như, nhưng không giới hạn ở, vàng. (Xem ví dụ, Giljohann và cộng sự. Journ. Amer. Chem. Soc. 2009 131(6): 2072-2073; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Theo một phương án khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA được mô tả ở đây có thể được liên hợp và/hoặc được bao bọc trong hạt nano vàng. (Nhà xuất bản quốc tế số WO201216269 và Nhà xuất bản Hoa Kỳ số 20120302940; mỗi tài liệu này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Như được mô tả trong US Pub. Số 20100004313, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn, chế phẩm chuyển gen có thể bao gồm trình tự nucleotit và poloxame. Ví dụ, axit nucleic đã biến đổi và mmRNA theo sáng chế có thể được sử dụng trong chế phẩm chuyển gen có poloxamer được mô tả trong US Pub. Số 20100004313.
Theo một phương án, chế phẩm polyme theo sáng chế có thể được ổn định bằng cách cho chế phẩm polyme này tiếp xúc, có thể chứa chất mang cation, với lipopolyme cation mà có thể liên kết cộng hóa trị với các nhóm cholesterol và polyethylen glycol. Công thức polyme này có thể được tiếp xúc với lipopolyme cation bằng cách sử dụng các phương pháp được mô tả trong US Pub. Số 20090042829 được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Chất mang cation có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, polyetylenimine, poly(trimethylenimine), poly(tetramethylenimine), polypropylenimine, aminoglycoside-polyamine, dideoxy-diamino-b-cyclodextrin, tinh trùng, tinh trùng, poly(2-dimethylamino)etyl methacrylat , poly(lysine), poly(histidine), poly(arginine), gelatin cation hóa, dendrimer, chitosan, 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane(DOTAP), N-[1-(2,3-dioleoyloxy) propyl]-N,N,N-trimetylamoni clorua (DOTMA), 1-[2-(oleoyloxy)etyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyetyl)imidazolinium clorua (DOTIM), 2,3-dioleyloxy-N -[2(sperminecarboxamido)etyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate (DOSPA), 3B-[N—(N′,N′-Dimethylaminoethane)-carbamoyl]Cholesterol Hydrochloride (DC-Cholesterol HCl) diheptadecylamidoglycyl tinh trùng (DOGS), N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromua (DDAB), N-(1,2-dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyetyl amoni bromua (DMRIE), N ,N-dioleyl-N,N-dimethylamoni clorua DODAC) và hỗn hợp của chúng.
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được bào chế ở dạng polyplex gồm một hoặc nhiều polyme (Nhà xuất bản Hoa Kỳ số 20120237565 và 20120270927; mỗi chất trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Theo một phương án, polyplex bao gồm hai hoặc nhiều polyme cation. Polyme catioinic có thể bao gồm poly(etylen imine) (PEI) như PEI tuyến tính.
Polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmRNA theo sáng chế cũng có thể được tạo ra ở dạng hạt nano bằng cách sử dụng tổ hợp các polyme, lipit, và/hoặc các chất có khả năng phân hủy sinh học khác, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, canxi photphat. Các thành phần có thể được kết hợp theo cấu trúc lõi-vỏ, cấu trúc lai và/hoặc từng lớp để cho phép tinh chỉnh hạt nano sao cho việc phân phối polynucleotide, cấu trúc sơ cấp và mmRNA có thể được tăng cường (Wang et al. , Nat Mater. 2006 5:791-796; Fuller và cộng sự 2008 29:1526-1532; DeKoker và cộng sự, Adv Drug Deliv Rev. 2011 63:748-761; 32:7721-7731; Su và cộng sự, Mol Pharm. 2011 ngày 6 tháng 6; 8(3):774-87 được đưa toàn bộ vào đây). Như một ví dụ không giới hạn, hạt nano có thể bao gồm nhiều polyme như, nhưng không giới hạn ở polyme ưa nước-kỵ nước (ví dụ, PEG-PLGA), polyme kỵ nước (ví dụ, PEG) và/hoặc polyme ưa nước (International Pub. Số WO20120225129 được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Các hạt nano canxi photphat có khả năng phân hủy sinh học kết hợp với lipid và/hoặc polyme đã được chứng minh là cung cấp polynucleotide, cấu trúc sơ cấp và mmRNA in vivo. Theo một phương án, hạt nano canxi phosphat được phủ lipid, mà cũng có thể chứa phối tử nhắm mục tiêu như anisamit, có thể được sử dụng để phân phối polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmARN theo sáng chế. Ví dụ, để cung cấp siRNA một cách hiệu quả trong mô hình phổi di căn của chuột, người ta đã sử dụng hạt nano canxi photphat được phủ lipid (Li và cộng sự, J Contr Rel. 2010 142: 416-421; Li và cộng sự, J Contr Rel. 2012 158: 108-114; Yang và cộng sự, Mol Ther. 2012 20:609-615; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Hệ thống phân phối này kết hợp cả hạt nano nhắm mục tiêu và thành phần để tăng cường sự thoát ra nội bào, canxi photphat, nhằm cải thiện việc phân phối siRNA.
Theo một phương án, canxi photphat với chất đồng trùng hợp khối PEG-polyanion có thể được sử dụng để phân phối polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA (Kazikawa và cộng sự, J Contr Rel. 2004 97:345-356; Kazikawa và cộng sự, J Contr Rel. 2006 111:368-370; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, polyme chuyển đổi điện tích PEG (Pitella và cộng sự, Vật liệu sinh học. 2011 32:3106-3114) có thể được sử dụng để tạo thành hạt nano nhằm phân phối các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp và mmRNA theo sáng chế. Polyme chuyển đổi điện tích PEG có thể cải thiện các copolyme khối đa nhân PEG bằng cách được phân tách thành polycation ở pH axit, do đó tăng cường thoát khỏi nội sinh.
Ngoài ra, việc sử dụng các hạt nano vỏ-lõi còn tập trung vào phương pháp hiệu suất cao để tổng hợp lõi nanogel liên kết ngang cation và các loại vỏ khác nhau (Siegwart và cộng sự, Proc Natl Acad Sci USA. 2011 108:12996-13001). Sự tạo phức, phân phối và nội hóa của các hạt nano polyme có thể được kiểm soát chính xác bằng cách thay đổi thành phần hóa học trong cả thành phần lõi và vỏ của hạt nano. Ví dụ, các hạt nano vỏ lõi có thể cung cấp siRNA một cách hiệu quả cho tế bào gan chuột sau khi chúng liên kết cộng hóa trị với cholesterol vào hạt nano.
Theo một phương án, lõi lipid rỗng bao gồm lớp PLGA ở giữa và lớp lipid trung tính bên ngoài chứa PEG có thể được sử dụng để phân phối polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmARN theo sáng chế. Là một ví dụ không giới hạn, ở những con chuột mang khối u biểu hiện luciferease, người ta đã xác định rằng hạt nano lai lipid-polymer-lipid ức chế đáng kể sự biểu hiện luciferase, so với lipoplex thông thường (Shi et al, Angew Chem Int Ed. 2011). 50:7027-7031; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, các hạt nano lipid có thể bao gồm lõi của các phân tử axit nucleic biến đổi bộc lộ ở đây và lớp vỏ polyme. Lớp vỏ polyme có thể là polyme bất kỳ được mô tả ở đây và đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này. Theo một phương án bổ sung, vỏ polyme có thể được sử dụng để bảo vệ các axit nucleic biến đổi trong lõi.
Các hạt nano vỏ lõi để sử dụng cùng với các phân tử axit nucleic đã biến đổi theo sáng chế được mô tả và có thể được tạo ra bằng các phương pháp được mô tả trong US Pat. Số 8.313.777 được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, các hạt nano vỏ lõi có thể bao gồm lõi của các phân tử axit nucleic biến đổi bộc lộ ở đây và vỏ polyme. Lớp vỏ polyme có thể là polyme bất kỳ được mô tả ở đây và đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này. Theo một phương án bổ sung, lớp vỏ polyme có thể được sử dụng để bảo vệ các phân tử axit nucleic đã biến đổi trong lõi. Là một ví dụ không giới hạn, hạt nano vỏ-lõi có thể được sử dụng để điều trị bệnh hoặc rối loạn về mắt (Xem ví dụ: Ấn phẩm Hoa Kỳ số 20120321719, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, polyme được sử dụng cùng với các công thức mô tả ở đây có thể là polyme biến đổi (như, nhưng không giới hạn ở, polyaxetat biến đổi) như được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2011120053, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Peptide và Protein
Polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmARN theo sáng chế có thể được bào chế bằng peptit và/hoặc protein để làm tăng khả năng chuyển hóa tế bào nhờ polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmARN. Theo một phương án, các peptit như, nhưng không giới hạn ở, peptit thâm nhập tế bào, protein và peptit cho phép phân phối nội bào có thể được sử dụng để phân phối dược phẩm. Ví dụ không giới hạn về peptit thâm nhập tế bào mà có thể được sử dụng cùng với dược phẩm theo sáng chế bao gồm trình tự peptit thâm nhập tế bào được gắn với các polycation tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa vào khoang nội bào, ví dụ, peptit TAT có nguồn gốc từ HIV, các chất thẩm thấu, Transportans, hoặc peptide thâm nhập tế bào có nguồn gốc từ hCT (xem, ví dụ, Caron và cộng sự, Mol. Ther. 3(3):310-8 (2001); Langel, Peptide thâm nhập tế bào: Quy trình và ứng dụng (CRC Press, Boca Raton FL, 2002); El-Andaloussi và cộng sự, Curr. Des. 11(28):3597-611 (2003); và Deshayes và cộng sự, Cell Life Sci. -49 (2005), tất cả đều được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ). Các chế phẩm này cũng có thể được bào chế để bao gồm chất thâm nhập tế bào, ví dụ, liposome, giúp tăng cường sự phân phối chế phẩm vào khoang nội bào. Polynucleotide, cấu trúc bậc một và mmRNA theo sáng chế có thể được tạo phức thành peptit và/hoặc protein như, nhưng không giới hạn ở, peptit và/hoặc protein từ Aileron Therapeutics (Cambridge, MA) và Permeon Biologics (Cambridge, MA) theo thứ tự để cho phép phân phối nội bào (Cronica và cộng sự, ACS Chem. Biol. 2010 5:747-752; McNaughton và cộng sự, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009 106:6111-6116; Sawyer, Chem Biol Drug Des. 2009 73:3-6; Verdine và Hilinski, Methods Enzymol 2012; tất cả đều được đưa vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, polypeptit thâm nhập tế bào có thể bao gồm vùng thứ nhất và vùng thứ hai. Vùng thứ nhất có thể bao gồm polypeptit được tăng cường. Vùng thứ hai có thể bao gồm phần liên kết với protein. Như được sử dụng ở đây, “đối tác gắn kết với protein” bao gồm, nhưng không giới hạn ở, kháng thể và đoạn chức năng của chúng, protein khung hoặc peptit. Polypeptit thâm nhập tế bào còn có thể bao gồm phần liên kết nội bào cho phần liên kết protein. Polypeptit xuyên qua tế bào có thể có khả năng được tiết ra từ tế bào nơi polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA có thể được đưa vào.
Các chế phẩm chứa peptit hoặc protein bao gồm có thể được sử dụng để làm tăng sự chuyển hóa tế bào bởi polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA, làm thay đổi sự phân bố sinh học của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA (ví dụ, bằng cách nhắm mục tiêu vào các mô hoặc loại tế bào cụ thể), và/ hoặc tăng sự dịch mã của protein được mã hóa. (Xem ví dụ: Nhà xuất bản quốc tế. Số WO2012110636; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Tế bào
Polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmRNA theo sáng chế có thể được chuyển nhiễm ex vivo vào tế bào, sau đó các tế bào này được cấy vào đối tượng. Như các ví dụ không giới hạn, dược phẩm có thể bao gồm tế bào hồng cầu để phân phối ARN biến đổi đến tế bào gan và tủy, virosome để phân phối ARN biến đổi ở dạng hạt giống vi rút (VLP), và các tế bào được điện di như, nhưng không giới hạn ở, từ MAXCYTE® (Gaithersburg, MD) và từ ERYTECH® (Lyon, Pháp) để cung cấp RNA biến tính. Các ví dụ về việc sử dụng hồng cầu, hạt virus và tế bào được điện hóa để cung cấp tải trọng khác ngoài mmRNA đã được ghi lại (Godfrin và cộng sự, Expert Opin Biol Ther. 2012 12:127-133; Fang và cộng sự, Expert Opin Biol Ther. 2012 12:385-389; Hu và cộng sự, Proc Natl Acad Sci USA 2011 108:10980-10985; Lund và cộng sự, Pharm Res. 27:400-420; ; 17:39-47; Cusi, Hum Vaccin. 2006 2:1-7; Gene Ther. 2006 13:400-411; tất cả đều được đưa vào đây bằng cách viện dẫn).
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA có thể được phân phối ở dạng VLP tổng hợp được tổng hợp bằng các phương pháp được mô tả trong Số xuất bản quốc tế WO2011085231 và Số xuất bản Hoa Kỳ 20110171248, mỗi phương pháp này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Các chế phẩm dựa trên tế bào chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmARN theo sáng chế có thể được sử dụng để đảm bảo sự chuyển nạp tế bào (ví dụ, trong chất mang tế bào), làm thay đổi sự phân bố sinh học của polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmARN (ví dụ, bằng cách nhắm mục tiêu vào chất mang tế bào đến các mô hoặc loại tế bào cụ thể) và/hoặc tăng sự dịch mã protein được mã hóa.
Nhiều phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và thích hợp để đưa axit nucleic vào tế bào, bao gồm các kỹ thuật qua trung gian virut và không phải virut. Ví dụ về các kỹ thuật qua trung gian không phải virus điển hình bao gồm, nhưng không giới hạn ở, điện di, chuyển qua trung gian canxi photphat, nucleofection, siêu âm, sốc nhiệt, nhiễm từ, chuyển qua trung gian liposome, vi tiêm, chuyển qua trung gian vi đạn (hạt nano), chuyển qua trung gian polyme cation ( DEAE-dextran, polyetylenimin, polyethylen glycol (PEG) và loại tương tự) hoặc phản ứng dung hợp tế bào.
Kỹ thuật siêu âm, hay siêu âm tế bào, là việc sử dụng âm thanh (ví dụ: tần số siêu âm) để điều chỉnh tính thấm của màng tế bào. Các phương pháp siêu âm đã được những người trong lĩnh vực này biết đến và được sử dụng để phân phối axit nucleic in vivo (Yoon và Park, Expert Opin Drug Deliv. 2010 7:321-330; Postema và Gilja, Curr Pharm Biotechnol. 2007 8:355-361; Newman và Bettinger, Gene Ther 2007 14:465-475; tất cả được đưa vào đây bằng cách viện dẫn). Các phương pháp siêu âm đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này và cũng được dạy ví dụ vì nó liên quan đến vi khuẩn trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20100196983 và vì nó liên quan đến các loại tế bào khác trong, ví dụ, Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20100009424, mỗi phương pháp này được đưa vào đây bằng cách viện dẫn trong toàn bộ của họ.
Kỹ thuật điện di cũng đã được biết rõ trong lĩnh vực này và được sử dụng để phân phối axit nucleic in vivo và lâm sàng (Andre và cộng sự, Curr Gene Ther. 2010 10:267-280; Chiarella và cộng sự, Curr Gene Ther. 2010 10:281 -286; Hojman, Curr Gene Ther. 2010 10:128-138; tất cả được đưa vào đây bằng cách viện dẫn). Theo một phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN có thể được phân phối bằng phương pháp điện di như được mô tả trong Ví dụ 8.
Hyaluronidase
Việc tiêm polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế vào trong cơ hoặc dưới da có thể bao gồm hyaluronidase, chất này xúc tác quá trình thủy phân hyaluronan. Bằng cách xúc tác quá trình thủy phân hyaluronan, một thành phần của hàng rào kẽ, hyaluronidase làm giảm độ nhớt của hyaluronan, do đó làm tăng tính thấm của mô (Frost, Expert Opin. Drug Deliv. (2007) 4:427-440; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách tham chiếu ). Sẽ rất hữu ích để tăng tốc độ phân tán và phân phối có hệ thống các protein được mã hóa được tạo ra bởi các tế bào được chuyển hóa. Ngoài ra, hyaluronidase có thể được sử dụng để làm tăng số lượng tế bào tiếp xúc với polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA theo sáng chế được sử dụng trong cơ hoặc dưới da.
Mô phỏng hạt nano
Polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được bao bọc bên trong và/hoặc được hấp thụ vào mô phỏng hạt nano. Mô phỏng hạt nano có thể bắt chước các sinh vật hoặc hạt có chức năng phân phối, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở mầm bệnh, vi rút, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng, prion và tế bào. Như một ví dụ không giới hạn, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được bao bọc trong hạt không phải viron mà có thể bắt chước chức năng phân phối của vi rút (xem Nhà xuất bản Quốc tế. Số WO2012006376 ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn) .
Ống nano
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được gắn hoặc liên kết theo cách khác với ít nhất một ống nano như, nhưng không giới hạn ở, ống nano hoa hồng, ống nano hoa hồng có bazơ kép với một liên kết, ống nano cacbon và/hoặc cacbon vách đơn ống nano, Các polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA có thể được liên kết với ống nano thông qua các lực như, nhưng không giới hạn ở, lực không gian, ion, cộng hóa trị và/hoặc các lực khác.
Theo một phương án, ống nano có thể giải phóng một hoặc nhiều polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA vào tế bào. Kích thước và/hoặc cấu trúc bề mặt của ít nhất một ống nano có thể được thay đổi để chi phối sự tương tác của các ống nano trong cơ thể và/hoặc để gắn hoặc liên kết với các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bộc lộ ở đây. Theo một phương án, khối xây dựng và/hoặc các nhóm chức năng được gắn vào khối xây dựng của ít nhất một ống nano có thể được thay đổi để điều chỉnh kích thước và/hoặc các đặc tính của ống nano. Như một ví dụ không giới hạn, chiều dài của ống nano có thể được thay đổi để cản trở ống nano đi qua các lỗ trên thành mạch máu bình thường nhưng vẫn đủ nhỏ để đi qua các lỗ lớn hơn trong mạch máu của mô khối u.
Theo một phương án, ít nhất một ống nano cũng có thể được phủ bằng hợp chất tăng cường phân phối bao gồm polyme, như, nhưng không giới hạn ở, polyetylen glycol. Theo một phương án khác, ít nhất một ống nano và/hoặc polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được trộn với tá dược dược dụng và/hoặc chất phân phối.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được gắn và/hoặc liên kết với ít nhất một ống nano hình hoa hồng. Các ống nano hoa hồng có thể được tạo thành bằng một quy trình đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc bằng quy trình được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2012094304, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Ít nhất một polynucleotide, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA có thể được gắn và/hoặc liên kết với ít nhất một ống nano hoa thị bằng quy trình như được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2012094304, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn, trong đó các ống nano hoặc môđun hoa hồng các ống nano hình hoa hồng được trộn trong môi trường nước với ít nhất một polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA trong các điều kiện có thể làm cho ít nhất một polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA gắn vào hoặc liên kết theo cách khác với các ống nano hoa thị.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được gắn vào và/hoặc liên kết với ít nhất một ống nano cacbon. Là một ví dụ không giới hạn, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được liên kết với tác nhân liên kết và tác nhân liên kết này có thể được liên kết với ống nano cacbon (ví dụ, xem, Pat. Hoa Kỳ số 8,246,995; ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn ). Ống nano cacbon có thể là ống nano vách đơn (Xem ví dụ: Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 8,246,995; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
liên hợp
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một, và mmARN theo sáng chế bao gồm các liên hợp, chẳng hạn như polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA liên kết cộng hóa trị với chất mang hoặc nhóm nhắm đích, hoặc bao gồm hai vùng mã hóa cùng nhau tạo ra protein dung hợp (ví dụ, mang gắn đích nhóm và protein hoặc peptide điều trị).
Các chất liên hợp theo sáng chế bao gồm chất xuất hiện tự nhiên, chẳng hạn như protein (ví dụ, albumin huyết thanh người (HSA), lipoprotein mật độ thấp (LDL), lipoprotein mật độ cao (HDL), hoặc globulin); carbohydrate (ví dụ: dextran, pullulan, chitin, chitosan, inulin, cyclodextrin hoặc axit hyaluronic); hoặc một lipid. Phối tử này cũng có thể là phân tử tái tổ hợp hoặc tổng hợp, như polyme tổng hợp, ví dụ, axit polyamino tổng hợp, oligonucleotit (ví dụ, aptamer). Ví dụ về axit polyamino bao gồm axit polyamino là polylysine (PLL), axit poly L-aspartic, axit poly L-glutamic, chất đồng trùng hợp anhydrit axit styren-maleic, chất đồng trùng hợp poly(L-lactide-co-glycolied), divinyl ete-maleic anhydrit copolyme, chất đồng trùng hợp N-(2-hydroxypropyl)metacrylamit (HMPA), polyetylen glycol (PEG), rượu polyvinyl (PVA), polyuretan, axit poly(2-etylacryllic), polyme N-isopropylacrylamid, hoặc polyphosphazine. Ví dụ về polyamine bao gồm: polyetylenimine, polylysine (PLL), tinh trùng, tinh trùng, polyamine, pseudopeptide-polyamine, polyamine peptidomimetic, dendrimer polyamine, arginine, amidine, protamine, lipid cation, porphyrin cation, muối bậc bốn của polyamine, hoặc xoắn ốc alpha peptit.
Các bằng sáng chế tiêu biểu của Hoa Kỳ hướng dẫn cách điều chế các liên hợp polynucleotide, đặc biệt là RNA, bao gồm nhưng không giới hạn ở Pat. số 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241, 5.391.723; 5.416.203, 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 và 5.688.941; 6.294.664; 6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297; 7.037.646; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, liên hợp theo sáng chế có thể hoạt động như chất mang các axit nucleic đã biến đổi và mmRNA theo sáng chế. Liên hợp có thể bao gồm polyme cation như, nhưng không giới hạn ở, polyamine, polylysine, polyalkylenimine, và polyetylenimine mà có thể được ghép với poly(ethylene glycol). Như một ví dụ không giới hạn, liên hợp polyme có thể tương tự như liên hợp polyme và phương pháp tổng hợp liên hợp polyme được mô tả trong Pat. Số 6.586.524 được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Các liên hợp cũng có thể bao gồm các nhóm nhắm mục tiêu, ví dụ, tác nhân nhắm mục tiêu tế bào hoặc mô, ví dụ, lectin, glycoprotein, lipid hoặc protein, ví dụ, kháng thể, liên kết với loại tế bào xác định chẳng hạn như tế bào thận. Nhóm mục tiêu có thể là thyrotropin, melanotropin, lectin, glycoprotein, protein hoạt động bề mặt A, cacbohydrat Mucin, lactoza đa hóa trị, galactose đa hóa trị, N-axetyl-galactosamin, mannose đa hóa trị N-acetyl-gulucosamine, fucose đa hóa trị, axit polyamino hóa trị glycosyl hóa, galactose đa hóa trị, transferrin, bisphosphonate, polyglutamate, polyaspartate, lipid, cholesterol, steroid, axit mật, folate, vitamin B12, biotin, peptit RGD, peptit RGD bắt chước hoặc aptamer.
Các nhóm nhắm mục tiêu có thể là protein, ví dụ: glycoprotein hoặc peptide, ví dụ: các phân tử có ái lực cụ thể với phối tử đồng thời hoặc các kháng thể, ví dụ: kháng thể, liên kết với một loại tế bào cụ thể như tế bào ung thư, tế bào nội mô hoặc tế bào xương. Các nhóm mục tiêu cũng có thể bao gồm hormone và thụ thể hormone. Chúng cũng có thể bao gồm các loại không phải peptit, như lipid, lectin, cacbohydrat, vitamin, đồng yếu tố, lactoza đa hóa trị, galactose đa hóa trị, N-axetyl-galactosamin, mannose đa hóa trị N-axetyl-gulucosamine, fucose đa hóa trị, hoặc aptamer. Phối tử này có thể là, ví dụ, lipopolysacarit, hoặc chất hoạt hóa p38 MAP kinase.
Nhóm nhắm mục tiêu có thể là bất kỳ phối tử nào có khả năng nhắm mục tiêu vào một thụ thể cụ thể. Các ví dụ bao gồm, không giới hạn, folate, GalNAc, galactose, mannose, mannose-6P, apatamers, phối tử thụ thể integrin, phối tử thụ thể chemokine, transferrin, biotin, phối tử thụ thể serotonin, PSMA, endthelin, GCPII, somatostatin, LDL, và phối tử HDL. Theo các phương án cụ thể, nhóm nhắm mục tiêu là aptamer. Aptamer có thể không được sửa đổi hoặc có sự kết hợp bất kỳ của các sửa đổi được mô tả ở đây.
Theo một phương án, dược phẩm theo sáng chế có thể bao gồm các biến đổi hóa học như, nhưng không giới hạn ở, các biến đổi tương tự như axit nucleic bị khóa.
Bằng sáng chế đại diện của Hoa Kỳ dạy cách điều chế axit nucleic khóa (LNA) chẳng hạn như của Santaris, bao gồm nhưng không giới hạn ở những điều sau: US Pat. số 6.268.490; 6.670.461; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.084.125; và 7.399.845, mỗi số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Các bằng sáng chế tiêu biểu của Hoa Kỳ dạy cách điều chế các hợp chất PNA bao gồm, nhưng không giới hạn ở, Pat. số 5.539.082; 5.714.331; và 5.719.262, mỗi số đó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Ví dụ, có thể tìm thấy việc giảng dạy sâu hơn về các hợp chất PNA trong Nielsen và cộng sự, Science, 1991, 254, 1497-1500.
Một số phương án được nêu bật trong sáng chế bao gồm polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA với các khung chính photphorothioat và oligonucleoside với các khung chính được biến đổi khác, và cụ thể là—CH2—NH—CH2—, —CH2—N(CH3)—O—CH2—[được gọi là trụ cột methylene (methylimino) hoặc MMI], —CH2—O—N(CH3)—CH2—, —CH2—N(CH3)—N(CH3)—CH2—và —N(CH3)—CH2—CH2—[trong đó mạch chính phosphodiester tự nhiên được biểu thị là —O—P(O)2—O—CH2—] của Pat. Hoa Kỳ được tham chiếu ở trên. Số 5,489,677, và các khung amit của Pat. Hoa Kỳ được tham chiếu ở trên. Số 5.602.240. Theo một số phương án, các polynucletotit nêu ở đây có cấu trúc xương sống morpholino của Pat. Hoa Kỳ được đề cập ở trên. Số 5.034.506.
Những sửa đổi ở vị trí 2' cũng có thể hỗ trợ việc phân phối. Tốt hơn là, các biến đổi ở vị trí 2’ không nằm trong trình tự mã hóa polypeptit, tức là, không nằm trong vùng có thể dịch mã. Các sửa đổi ở vị trí 2’ có thể nằm ở vùng 5′UTR, 3′UTR và/hoặc vùng đuôi. Các sửa đổi ở vị trí 2′ có thể bao gồm một trong những điều sau đây ở vị trí 2′: H (tức là 2′-deoxy); F; O—, S-, hoặc N-alkyl; O—, S-, hoặc N-alkenyl; O—, S- hoặc N-alkynyl; hoặc O-alkyl-O-alkyl, trong đó alkyl, alkenyl và alkynyl có thể được thế hoặc không được thế C1đến C10alkyl hoặc C2đến C10alkenyl và alkynyl. Các sửa đổi phù hợp làm ví dụ bao gồm O[(CH2)Nồ]tôiCH3, O(CH2)NVÀ3, O(CH2)NNH2, O(CH2) CH3, O(CH2)NONH2và O(CH2)NBẬT[(CH2)NCH3)]2, trong đó n và m nằm trong khoảng từ 1 đến khoảng 10. Theo các phương án khác, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bao gồm một trong các dạng sau ở vị trí 2′: C1đến C10Alkyl thấp hơn, alkyl thấp hơn được thế, alkaryl, aralkyl, O-alkaryl hoặc O-aralkyl, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, TÓC3, VÌ THẾ2CH3, ONO2, KHÔNG2, N3, NH2, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkaryl, aminoalkylamino, polyalkylamino, silyl được thế, nhóm cắt ARN, nhóm báo cáo, chất xen kẽ, nhóm để cải thiện các đặc tính dược động học, hoặc nhóm để cải thiện các đặc tính dược lực học, và các nhóm thế khác có các đặc tính tương tự. Theo một số phương án, biến đổi bao gồm 2′-metoxyethoxy (2′-O—CH2CH2VÀ3, còn được gọi là 2′-O-(2-methoxyethyl) hoặc 2′-MOE) (Martin và cộng sự, Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) tức là nhóm alkoxy-alkoxy. Một dạng biến đổi được lấy làm ví dụ khác là 2′-dimetylaminooxyethoxy, tức là, O(CH2)2BẬT(CH3)2nhóm, còn được gọi là 2′-DMAOE, như được mô tả trong các ví dụ sau đây, và 2′-dimethylaminoethoxyethoxy (còn được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này là 2′-O-dimethylaminoethoxyetyl hoặc 2′-DMAEOE), tức là, 2′-O—CH2—O—CH2—N(CH2)2, cũng được mô tả trong các ví dụ dưới đây. Các sửa đổi khác bao gồm 2′-methoxy (2′-OCH3), 2′-aminopropoxy (2′-OCH2CH2CH2NH2) và 2′-flo (2′-F). Các sửa đổi tương tự cũng có thể được thực hiện ở các vị trí khác, đặc biệt là vị trí 3’ của đường trên nucleotide đầu 3’ hoặc trong các dsRNA liên kết 2’-5’ và vị trí 5’ của nucleotide đầu 5’. Polynucleotit theo sáng chế cũng có thể có chất bắt chước đường như gốc xyclobutyl thay cho đường pentofuranosyl. Các bằng sáng chế tiêu biểu của Hoa Kỳ dạy cách điều chế các cấu trúc đường biến đổi như vậy bao gồm, nhưng không giới hạn, Bằng sáng chế Hoa Kỳ. số 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; và 5.700.920 và mỗi khoản trong số đó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo các phương án khác nữa, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA được liên hợp cộng hóa trị với polypeptit xuyên qua tế bào. Peptit thâm nhập tế bào cũng có thể bao gồm trình tự tín hiệu. Các liên hợp theo sáng chế có thể được thiết kế để có độ ổn định cao hơn; tăng chuyển hóa tế bào; và/hoặc thay đổi sự phân bố sinh học (ví dụ: nhằm vào các mô hoặc loại tế bào cụ thể).
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được liên hợp với chất để tăng cường khả năng phân phối. Là một ví dụ không giới hạn, tác nhân này có thể là monome hoặc polyme như monome nhắm mục tiêu hoặc polyme có khối nhắm mục tiêu như được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2011062965, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Trong một ví dụ không giới hạn khác, tác nhân này có thể là chất vận chuyển được liên kết cộng hóa trị với polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế (ví dụ, xem, Pat. Số 6,835,393 và 7,374,778 của Hoa Kỳ, mỗi trong số đó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn trong toàn bộ của nó). Trong một ví dụ không giới hạn khác nữa, chất này có thể là chất tăng cường vận chuyển hàng rào màng như chất được mô tả trong US Pat. Các số 7.737.108 và 8.003.129, mỗi số này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án khác, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được liên hợp với SMARTT POLYMER TECHNOLOGY® (PHASERX®, Inc. Seattle, WA).
Hạt nano tự lắp ráp Các hạt nano tự lắp ráp axit nucleic
Các hạt nano tự lắp ráp có kích thước được xác định rõ ràng và có thể được kiểm soát chính xác vì các chuỗi axit nucleic có thể dễ dàng lập trình lại. Ví dụ, kích thước hạt tối ưu cho chất mang phân phối nano nhắm mục tiêu ung thư là 20-100 nm vì đường kính lớn hơn 20 nm tránh được sự thanh thải qua thận và tăng cường phân phối đến một số khối u thông qua tăng cường hiệu quả thẩm thấu và duy trì. Sử dụng các hạt nano axit nucleic tự lắp ráp, một quần thể đồng nhất về kích thước và hình dạng có định hướng không gian và mật độ được kiểm soát chính xác của các phối tử nhắm mục tiêu ung thư để tăng cường khả năng phân phối. Là một ví dụ không giới hạn, các hạt nano oligonucleotide được điều chế bằng cách sử dụng khả năng tự lắp ráp có thể lập trình của các đoạn DNA ngắn và siRNA điều trị. Các hạt nano này giống hệt nhau về mặt phân tử với kích thước hạt cũng như vị trí và mật độ phối tử mục tiêu có thể kiểm soát được. Các đoạn DNA và siRNA tự lắp ráp thành phản ứng một bước để tạo ra các hạt nano tứ diện DNA/siRNA để phân phối in vivo theo mục tiêu. (Lee và cộng sự, Công nghệ nano tự nhiên 2012 7:389-393; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA bộc lộ ở đây có thể được bào chế ở dạng hạt nano tự lắp ráp. Như một ví dụ không giới hạn, axit nucleic có thể được sử dụng để tạo ra các hạt nano mà có thể được sử dụng trong hệ phân phối polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN theo sáng chế (Xem ví dụ, International Pub. No. WO2012125987; được đưa vào đây bằng cách tham chiếu toàn bộ).
Theo một phương án, các hạt nano tự lắp ráp axit nucleic có thể bao gồm lõi của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bộc lộ ở đây và vỏ polyme. Lớp vỏ polyme có thể là polyme bất kỳ được mô tả ở đây và đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này. Theo một phương án bổ sung, lớp vỏ polyme có thể được sử dụng để bảo vệ các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp và mmRNA trong lõi.
Các hạt nano tự lắp ráp dựa trên polymer
Polyme có thể được sử dụng để tạo thành các tấm tự lắp ráp thành các hạt nano. Các hạt nano này có thể được sử dụng để phân phối các polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmARN theo sáng chế. Theo một phương án, các hạt nano tự lắp ráp này có thể là các vi bọt biển được tạo thành từ các polyme dài của các kẹp tóc RNA tạo thành các tấm 'gấp' tinh thể trước khi tự lắp ráp thành các vi bọt biển. Những miếng bọt biển siêu nhỏ này là những miếng bọt biển có mật độ dày đặc giống như các vi hạt, có thể hoạt động như một chất mang hiệu quả và có thể vận chuyển hàng hóa đến một tế bào. Các microsponge có thể có đường kính từ 1 µm đến 300 nm. Các vi bọt biển này có thể được tạo phức với các chất khác đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này để tạo thành các vi bọt biển lớn hơn. Như một ví dụ không giới hạn, microsponge có thể được tạo phức với một tác nhân để tạo thành lớp ngoài nhằm thúc đẩy sự hấp thu của tế bào như polycation polyetylen (PEI). Phức hợp này có thể tạo thành hạt có đường kính 250 nm và có thể duy trì ổn định ở nhiệt độ cao (150° C.) (Grabow và Jaegar, Vật liệu Tự nhiên 2012, 11:269-269; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Ngoài ra, các vi bọt biển này có thể thể hiện mức độ bảo vệ đặc biệt khỏi sự phân hủy bởi ribonuclease.
Theo một phương án khác, các hạt nano tự lắp ráp dựa trên polyme như, nhưng không giới hạn ở, microsponge, có thể là các hạt nano hoàn toàn có thể lập trình được. Hình dạng, kích thước và tính năng cân bằng hóa học của hạt nano có thể được kiểm soát chính xác để tạo ra hạt nano tối ưu để vận chuyển hàng hóa, chẳng hạn như nhưng không giới hạn ở polynucleotide, cấu trúc chính và/hoặc mmRNA.
Theo một phương án, hạt nano dựa trên polyme có thể bao gồm lõi của polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA bộc lộ ở đây và vỏ polyme. Lớp vỏ polyme có thể là polyme bất kỳ được mô tả ở đây và đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này. Theo một phương án bổ sung, lớp vỏ polyme có thể được sử dụng để bảo vệ các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN trong lõi.
Theo một phương án khác nữa, hạt nano dựa trên polyme có thể bao gồm polyme axit phi nucleic bao gồm nhiều monome không đồng nhất như các monome không đồng nhất như được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2013009736, ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Hạt nano vô cơ
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra ở dạng hạt nano vô cơ (Patent Hoa Kỳ số 8,257,745, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Các hạt nano vô cơ có thể bao gồm, nhưng không giới hạn, các chất đất sét có khả năng trương nở trong nước. Như một ví dụ không giới hạn, hạt nano vô cơ có thể bao gồm đất sét smectit tổng hợp được làm từ silicat đơn giản (ví dụ, xem Pat. Số 5,585,108 và 8,257,745 của Hoa Kỳ, mỗi loại được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ).
Theo một phương án, các hạt nano vô cơ có thể bao gồm lõi của axit nucleic biến đổi bộc lộ ở đây và lớp vỏ polyme. Lớp vỏ polyme có thể là polyme bất kỳ được mô tả ở đây và đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này. Theo một phương án bổ sung, vỏ polyme có thể được sử dụng để bảo vệ các axit nucleic biến đổi trong lõi.
Hạt nano bán dẫn và kim loại
Các polynucleotide, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra ở dạng hạt nano phân tán trong nước bao gồm vật liệu kim loại hoặc bán dẫn (Nhà xuất bản Hoa Kỳ số 20120228565; ở đây được đưa toàn bộ vào bằng cách tham chiếu) hoặc được tạo thành ở dạng hạt nano từ tính ( US Pub. Số 20120265001 và 20120283503; mỗi thông số này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Các hạt nano phân tán trong nước có thể là hạt nano kỵ nước hoặc hạt nano ưa nước.
Theo một phương án, hạt nano kim loại và/hoặc bán dẫn có thể bao gồm lõi của polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA bộc lộ ở đây và vỏ polyme. Lớp vỏ polyme có thể là polyme bất kỳ được mô tả ở đây và đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này. Theo một phương án bổ sung, lớp vỏ polyme có thể được sử dụng để bảo vệ các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN trong lõi.
Gel và Hydrogel
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA bộc lộ ở đây có thể được bao nang trong hydrogel bất kỳ đã biết trong lĩnh vực này mà có thể tạo thành gel khi được tiêm vào đối tượng. Hydrogel là một mạng lưới các chuỗi polymer có tính ưa nước và đôi khi được tìm thấy dưới dạng gel keo trong đó nước là môi trường phân tán. Hydrogel là polyme tự nhiên hoặc tổng hợp có khả năng hấp thụ cao (chúng có thể chứa hơn 99% nước). Hydrogel cũng có mức độ linh hoạt rất giống với mô tự nhiên do hàm lượng nước đáng kể. Hydrogel được mô tả ở đây có thể được sử dụng để bao bọc các hạt nano lipid tương thích sinh học, có khả năng phân hủy sinh học và/hoặc xốp.
Như một ví dụ không giới hạn, hydrogel có thể là hydrogel có chức năng aptamer. Hydrogel có chức năng aptamer có thể được lập trình để giải phóng một hoặc nhiều polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN bằng cách lai axit nucleic. (Battig và cộng sự, J. Am. Chem. Society. 2012 134:12410-12413; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Như một ví dụ không giới hạn khác, hydrogel có thể có hình dạng như opal đảo ngược. Hydrogel opal có tỷ lệ trương nở cao hơn và động học trương nở cũng nhanh hơn rất nhiều. Phương pháp sản xuất hydrogel opal và mô tả hydrogel opal được mô tả trong International Pub. Số WO2012148684, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Trong một ví dụ không giới hạn khác nữa, hydrogel có thể là hydrogel kháng khuẩn. Hydrogel kháng khuẩn có thể bao gồm muối dược dụng hoặc vật liệu hữu cơ chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở cấp độ dược phẩm và/hoặc muối bạc cấp độ y tế và gel hoặc chiết xuất lô hội. (Nhà xuất bản quốc tế. Số WO2012151438, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, mARN biến đổi có thể được bao bọc trong hạt nano lipid và sau đó hạt nano lipid này có thể được bao bọc trong hyrdogel.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA bộc lộ ở đây có thể được bao nang trong gel bất kỳ đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Như một ví dụ không giới hạn, gel có thể là gel tiêm fluorouracil hoặc gel tiêm fluorouracil chứa hợp chất hóa học và/hoặc thuốc đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Một ví dụ khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA có thể được bao bọc trong gel fluorouracil chứa epinephrine (Xem ví dụ, Smith và cộng sự. Hóa trị liệu và dược lý ung thư, 1999 44(4):267-274; ở đây được đưa vào bằng cách viện dẫn trong toàn bộ của nó).
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA bộc lộ ở đây có thể được bao bọc trong gel fibrin, fibrin hydrogel hoặc keo fibrin. Theo một phương án khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA có thể được tạo ra ở dạng hạt nano lipid hoặc hạt nano lipid được loại bỏ nhanh chóng trước khi được bao bọc trong gel fibrin, hydrogel fibrin hoặc keo fibrin. Theo một phương án khác nữa, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA có thể được bào chế ở dạng lipoplex trước khi được bao nang thành gel fibrin, hydrogel hoặc keo fibrin. Gel fibrin, hydrogel và keo bao gồm hai thành phần, dung dịch fibrinogen và dung dịch trombin giàu canxi (Xem ví dụ, Spicer và Mikos, Tạp chí Phát hành có Kiểm soát 2010. 148: 49-55; Kidd và cộng sự. Tạp chí Phát hành có Kiểm soát 2012. 157:80-85; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Nồng độ của các thành phần của gel fibrin, hydrogel và/hoặc keo có thể được thay đổi để thay đổi các đặc tính, kích thước mắt lưới và/hoặc các đặc tính phân hủy của gel, hydrogel và/hoặc keo, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở thay đổi đặc tính giải phóng của gel fibrin, hydrogel và/hoặc keo. (Xem ví dụ, Spicer và Mikos, Tạp chí Phát hành có Kiểm soát 2010. 148: 49-55; Kidd và cộng sự. Tạp chí Phát hành có Kiểm soát 2012. 157:80-85; Catelas và cộng sự. Kỹ thuật mô 2008. 14:119-128; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Đặc điểm này có thể có lợi khi được sử dụng để phân phối mARN đã sửa đổi bộc lộ ở đây. (Xem ví dụ, Kidd và cộng sự. Tạp chí Phát hành có Kiểm soát 2012. 157:80-85; Catelas và cộng sự. Tissue Engineering 2008. 14:119-128; mỗi tài liệu trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Cation và Anion
Các chế phẩm chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA bộc lộ ở đây có thể bao gồm các cation hoặc anion. Theo một phương án, chế phẩm bao gồm các cation kim loại như, nhưng không giới hạn ở, Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg+ và hỗn hợp của chúng. Là một ví dụ không giới hạn, chế phẩm có thể bao gồm polyme và polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA được tạo phức với cation kim loại (ví dụ, xem, Pat. Số 6,265,389 và 6,555,525 của Hoa Kỳ, mỗi trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn ).
Các hạt nano và vi hạt đúc
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA bộc lộ ở đây có thể được bào chế ở dạng hạt nano và/hoặc vi hạt. Những hạt nano và/hoặc vi hạt này có thể được đúc thành bất kỳ hình dạng kích thước và hóa học nào. Ví dụ, các hạt nano và/hoặc vi hạt có thể được tạo ra bằng công nghệ PRINT® của LIQUIDA TECHNOLOGIES® (Morrisville, NC) (Xem ví dụ, Nhà xuất bản Quốc tế số WO2007024323; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, các hạt nano được tạo khuôn có thể bao gồm lõi của polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA bộc lộ ở đây và vỏ polyme. Lớp vỏ polyme có thể là polyme bất kỳ được mô tả ở đây và đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này. Theo một phương án bổ sung, lớp vỏ polyme có thể được sử dụng để bảo vệ các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN trong lõi.
NanoJackets và NanoLiposome
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA được bộc lộ ở đây có thể được tạo ra ở dạng NanoJackets và NanoLiposome bởi Keystone Nano (State College, PA). NanoJackets được làm từ các hợp chất được tìm thấy tự nhiên trong cơ thể bao gồm canxi, phốt phát và cũng có thể bao gồm một lượng nhỏ silicat. Áo khoác nano có thể có kích thước từ 5 đến 50 nm và có thể được sử dụng để phân phối các hợp chất ưa nước và kỵ nước như, nhưng không giới hạn ở, polynucleotide, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA.
NanoLiposome được tạo thành từ các lipid, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, lipid xuất hiện tự nhiên trong cơ thể. NanoLiposome có thể có kích thước từ 60-80 nm và có thể được sử dụng để phân phối các hợp chất ưa nước và kỵ nước như, nhưng không giới hạn ở, polynucleotide, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA. Theo một khía cạnh, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA bộc lộ ở đây được bào chế ở dạng NanoLiposome như, nhưng không giới hạn ở, Ceramit NanoLiposome.
Tá dược
Ngoài ra, dược phẩm có thể bao gồm tá dược dược dụng, mà, như được sử dụng ở đây, bao gồm bất kỳ và tất cả các dung môi, môi trường phân tán, chất pha loãng hoặc chất lỏng khác, chất trợ phân tán hoặc huyền phù, chất hoạt động bề mặt, chất đẳng trương, chất làm đặc hoặc chất nhũ hóa, chất bảo quản. , chất kết dính rắn, chất bôi trơn và các chất tương tự, phù hợp với dạng bào chế cụ thể mong muốn. của RemingtonKhoa học và Thực hành Dược,21stEdition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn) bộc lộ các tá dược khác nhau được sử dụng trong bào chế dược phẩm và các kỹ thuật đã biết để bào chế chúng. Ngoại trừ trường hợp bất kỳ môi trường tá dược thông thường nào không tương thích với một chất hoặc các dẫn xuất của nó, chẳng hạn như tạo ra bất kỳ tác dụng sinh học không mong muốn nào hoặc tương tác theo cách có hại với bất kỳ (các) thành phần nào khác của dược phẩm, việc sử dụng nó được dự tính là trong giới hạn cho phép. phạm vi của phát minh này.
Theo một số phương án, tá dược dược dụng có độ tinh khiết ít nhất là 95%, ít nhất 96%, ít nhất 97%, ít nhất 98%, ít nhất 99%, hoặc 100%. Theo một số phương án, tá dược được phê duyệt để sử dụng cho người và dùng cho thú y. Theo một số phương án, tá dược được phê duyệt bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ. Theo một số phương án, tá dược là loại dược phẩm. Theo một số phương án, tá dược đáp ứng các tiêu chuẩn của Dược điển Hoa Kỳ (USP), Dược điển Châu Âu (EP), Dược điển Anh, và/hoặc Dược điển Quốc tế.
Tá dược dược dụng được sử dụng trong sản xuất dược phẩm bao gồm, nhưng không giới hạn ở, chất pha loãng trơ, chất phân tán và/hoặc chất tạo hạt, chất hoạt động bề mặt và/hoặc chất nhũ hóa, chất phân rã, chất liên kết, chất bảo quản, chất đệm, chất bôi trơn, và/hoặc dầu. Các tá dược như vậy có thể tùy ý được bao gồm trong dược phẩm.
Các chất pha loãng ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, canxi cacbonat, natri cacbonat, canxi photphat, dicanxi photphat, canxi sulfat, canxi hydro photphat, natri photphat lactoza, sucroza, xenluloza, xenluloza vi tinh thể, cao lanh, mannitol, sorbitol, inositol, natri clorua , tinh bột khô, bột ngô, đường bột, v.v., và/hoặc hỗn hợp của chúng.
Chất tạo hạt và/hoặc chất phân tán được lấy làm ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, tinh bột khoai tây, tinh bột ngô, tinh bột khoai mì, tinh bột natri glycolat, đất sét, axit alginic, gôm guar, bột giấy từ cam quýt, thạch, bentonite, xelulo và các sản phẩm gỗ, bọt biển tự nhiên , nhựa trao đổi cation, canxi cacbonat, silicat, natri cacbonat, poly(vinyl-pyrrolidone) liên kết ngang (crospovidone), tinh bột natri carboxymethyl (natritinh bột glycolate), carboxymethyl cellulose, natri carboxymethyl cellulose liên kết ngang (croscarmellose), methylcellulose , tinh bột đã được hồ hóa trước (tinh bột 1500), tinh bột vi tinh thể, tinh bột không tan trong nước, xenluloza canxi cacboxymetyl, magie nhôm silicat (VEEGUM®), natri lauryl sunfat, hợp chất amoni bậc bốn, v.v., và/hoặc hỗn hợp của chúng.
Chất hoạt động bề mặt và/hoặc chất nhũ hóa được lấy làm ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, chất nhũ hóa tự nhiên (ví dụ, keo, thạch, axit alginic, natri alginate, tragacanth, chondrux, cholesterol, xanthan, pectin, gelatin, lòng đỏ trứng, casein, mỡ len, cholesterol, sáp và lecithin), đất sét keo (ví dụ bentonite [nhôm silicat] và VEEGUM® [magie nhôm silicat]), các dẫn xuất axit amin chuỗi dài, rượu có trọng lượng phân tử cao (ví dụ: rượu stearyl, rượu cetyl, rượu oleyl, triacetin monostearate , ethylene glycol distearate, glyceryl monostearate, và propylene glycol monostearate, rượu polyvinyl), carbom (ví dụ carboxy polymethylene, axit polyacrylic, polyme axit acrylic và carboxyvinyl polymer), carrageenan, dẫn xuất xenlulo (ví dụ carboxymethylcellulose natri, bột xenluloza, hydroxymethyl xenlulo, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, methylcellulose), este axit béo sorbitan (ví dụ polyoxyethylene sorbitan monolaurate [TWEEN®20], polyoxyethylene sorbitan [TWEENn®60], polyoxyethylene sorbitan monooleate [TWEEN®80], sorbitan monopalmitate [SPAN®40], sorbitan monostearate [SPAN®60], tristearate sorbitan [SPAN®65], glyceryl monooleate, monooleate sorbitan [SPAN®80]), este polyoxyetylen (ví dụ: polyoxyethylene monostearate [MYRJ®45], dầu thầu dầu polyoxyethylene hydro hóa, dầu thầu dầu polyethoxylated, polyoxymethylene stearat và SOLUTOL®), este của axit béo sucrose, este của axit béo polyethylen glycol (ví dụ CREMOPHOR®), ete polyoxyethylene, (ví dụ: polyoxyethylene lauryl ete [ BRIJ®30]), poly(vinyl-pyrrolidone), diethylene glycol monolaurate, trietanolamine oleat, natri oleat, kali oleat, etyl oleat, axit oleic, etyl laurat, natri lauryl sunfat, PLUORINC®F 68, POLOXAMER®188, cetrimonium bromua , cetylpyridinium clorua, benzalkonium clorua, natri docusate, v.v. và/hoặc hỗn hợp của chúng.
Chất liên kết được lấy làm ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, tinh bột (ví dụ, bột ngô và bột nhão tinh bột); gelatin; đường (ví dụ sucrose, glucose, dextrose, dextrin, mật đường, lactose, lactitol, mannitol); gôm tự nhiên và tổng hợp (ví dụ keo, natri alginate, chiết xuất rêu Ailen, kẹo cao su panwar, gôm ghatti, chất nhầy của vỏ isapol, carboxymethylcellulose, methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, cellulose vi tinh thể, cellulose acetate, poly(vinyl -pyrrolidone), magiê nhôm silicat (Veegum®), và larch arabogalactan); alginate; polyethylene oxide; polyetylen glycol; muối canxi vô cơ; axit silicic; polymethacrylat; sáp; Nước; rượu bia; vân vân.; và sự kết hợp của chúng.
Chất bảo quản ví dụ có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, chất chống oxy hóa, chất chelat, chất bảo quản kháng khuẩn, chất bảo quản chống nấm, chất bảo quản rượu, chất bảo quản có tính axit, và/hoặc chất bảo quản khác. Chất chống oxy hóa ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, alpha tocopherol, axit ascorbic, acorbyl palmitat, hydroxyanisole butylat hóa, hydroxytoluen butylat, monothioglycerol, kali metabisulfit, axit propionic, propyl galat, natri ascorbat, natri bisulfit, natri metabisulfit, và/hoặc natri sulfit . Chất chelat được lấy làm ví dụ bao gồm axit etylendiamintetraaxetic (EDTA), axit xitric monohydrat, dinatri edetat, dikali edetat, axit edetic, axit fumaric, axit malic, axit photphoric, natri edetat, axit tartaric, và/hoặc trinatri edetat. Chất bảo quản kháng khuẩn ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, benzalkonium clorua, benzethonium clorua, rượu benzyl, bronopol, cetrimide, cetylpyridinium clorua, chlorhexidine, chlorobutanol, chlorocresol, chloroxylenol, cresol, rượu etylic, glycerin, hexetidine, imidurea, phenol, phenoxyetanol, rượu phenyletyl, phenyl thủy ngân nitrat, propylen glycol, và/hoặc thimerosal. Chất bảo quản chống nấm ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, butyl paraben, metyl paraben, etyl paraben, propyl paraben, axit benzoic, axit hydroxybenzoic, kali benzoat, kali sorbat, natri benzoat, natri propionat, và/hoặc axit sorbic. Chất bảo quản rượu ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, etanol, polyetylen glycol, phenol, hợp chất phenolic, bisphenol, clobutanol, hydroxybenzoat, và/hoặc rượu phenyletyl. Chất bảo quản có tính axit ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, vitamin A, vitamin C, vitamin E, beta-caroten, axit xitric, axit axetic, axit dehydroaxetic, axit ascorbic, axit sorbic, và/hoặc axit phytic. Các chất bảo quản khác bao gồm, nhưng không giới hạn ở, tocopherol, tocopherol axetat, teroxime mesylate, cetrimide, hydroxyanisol butylat hóa (BHA), hydroxytoluened butylat hóa (BHT), ethylenediamine, natri lauryl sunfat (SLS), natri lauryl ete sunfat (SLES), natri bisulfite, natri metabisulfite, kali sulfite, kali metabisulfite, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, methylparaben, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™ và/hoặc EUXYL®.
Chất đệm ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, dung dịch đệm xitrat, dung dịch đệm axetat, dung dịch đệm phosphat, amoni clorua, canxi cacbonat, canxi clorua, canxi xitrat, canxi glubionate, canxi gluceptat, canxi gluconate, axit D-gluconic, canxi glycerophosphate, canxi lactate, axit propanoic, canxi levulinate, axit pentanoic, canxi photphat hai bazơ, axit photphoric, canxi photphat ba bazơ, canxi hydroxit photphat, kali axetat, kali clorua, kali gluconate, hỗn hợp kali, kali photphat hai bazơ, kali photphat đơn thể, kali hỗn hợp photphat, natri axetat, natri bicarbonat, natri clorua, natri citrat, natri lactat, natri photphat dibasic, natri photphat monobasic, hỗn hợp natri photphat, tromethamine, magie hydroxit, nhôm hydroxit, axit alginic, nước không chứa pyrogen, nước muối đẳng trương, Ringer's dung dịch, rượu etylic, v.v., và/hoặc hỗn hợp của chúng.
Chất bôi trơn được lấy làm ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, magie stearat, canxi stearate, axit stearic, silic, talc, mạch nha, glyceryl behanat, dầu thực vật hydro hóa, polyetylen glycol, natri benzoat, natri axetat, natri clorua, leuxin, magie lauryl sulfat , natri lauryl sulfat, v.v., và hỗn hợp của chúng.
Dầu ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, hạnh nhân, hạt mơ, quả bơ, babassu, cam bergamot, hạt blackcurrent, cây lưu ly, cade, hoa cúc, cải dầu, caraway, carnauba, thầu dầu, quế, bơ ca cao, dừa, gan cá tuyết, cà phê , ngô, hạt bông, emu,bạch đàn, hoa anh thảo buổi tối, cá, hạt lanh, geraniol, bầu, hạt nho, hạt phỉ, cây bài hương, isopropyl myristate, jojoba, hạt kukui, lavandin, hoa oải hương, chanh,bời lời cubba, hạt mắc ca, Mallow, hạt xoài, hạt meadowfoam, chồn, nhục đậu khấu, ô liu, trái cam, cam thô, lòng bàn tay, hạt cọ, hạt đào, đậu phụng, hạt anh túc, hạt bí ngô, hạt cải dầu, cám gạo, cây mê điệt, cây rum, gỗ đàn hương, sasquana, vị mặn, hắc mai biển, vừng, bơ hạt mỡ, silicone, đậu nành, hướng dương, cây trà, cây kế, tsubaki, cỏ vetiver, quả óc chó và dầu mầm lúa mì. Dầu ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, butyl stearat, triglycerid caprylic, triglycerid capric, xyclomethicone, dietyl sebacate, dimethicon 360, isopropyl myristate, dầu khoáng, octyldodecanol, rượu oleyl, dầu silicon, và/hoặc hỗn hợp của chúng.
Các tá dược như bơ ca cao và sáp đặt, chất tạo màu, chất phủ, chất làm ngọt, hương liệu và/hoặc chất tạo mùi có thể có mặt trong chế phẩm, tùy theo đánh giá của người lập công thức.
Vận chuyển
Sáng chế đề cập đến việc phân phối các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA cho mục đích điều trị, dược phẩm, chẩn đoán hoặc chẩn đoán hình ảnh bất kỳ bằng con đường thích hợp bất kỳ có tính đến những tiến bộ có thể có trong khoa học phân phối thuốc. Giao hàng có thể trần trụi hoặc theo công thức.
giao hàng khỏa thân
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế có thể được đưa vào tế bào một cách trần. Như được sử dụng ở đây, “trần” dùng để chỉ việc phân phối polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA không chứa các tác nhân thúc đẩy quá trình chuyển nhiễm. Ví dụ, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN được phân phối vào tế bào có thể không chứa các biến đổi. Các polynucleotit trần, cấu trúc bậc một hoặc mmARN có thể được phân phối đến tế bào bằng các đường sử dụng đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và được mô tả ở đây.
Công thức giao hàng
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra bằng cách sử dụng các phương pháp được mô tả ở đây. Các chế phẩm này có thể chứa polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmARN mà có thể được biến đổi và/hoặc không được biến đổi. Các chế phẩm này còn có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, chất thấm vào tế bào, chất mang dược dụng, chất phân phối, polyme dễ ăn mòn sinh học hoặc tương thích sinh học, dung môi, và kho phân phối giải phóng kéo dài. Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN được bào chế có thể được phân phối đến tế bào bằng các đường sử dụng đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và được mô tả ở đây.
Các chế phẩm này cũng có thể được bào chế để phân phối trực tiếp đến cơ quan hoặc mô theo bất kỳ cách nào trong số các cách trong lĩnh vực kỹ thuật này bao gồm, nhưng không giới hạn ở, ngâm hoặc tắm trực tiếp, qua ống thông, bằng gel, bột, thuốc mỡ, kem, gel, nước thơm , và/hoặc giọt, bằng cách sử dụng các chất nền như vải hoặc vật liệu có khả năng phân hủy sinh học được phủ hoặc ngâm tẩm với chế phẩm và các chất tương tự.
Sự quản lý
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế có thể được sử dụng theo đường bất kỳ mang lại hiệu quả điều trị. Chúng bao gồm, nhưng không giới hạn ở đường ruột, đường tiêu hóa, ngoài màng cứng, đường miệng, qua da, ngoài màng cứng (ngoài màng cứng), nội sọ (vào não), nội não thất (vào não thất), trên da (bôi lên da), trong da, (vào qua da), tiêm dưới da (dưới da), tiêm qua mũi (qua mũi), tiêm tĩnh mạch (vào tĩnh mạch), tiêm tĩnh mạch (vào động mạch), tiêm bắp (vào cơ), tiêm bắp (vào tim), truyền tĩnh mạch (vào tủy xương), trong tủy sống, trong phúc mạc, (truyền hoặc tiêm vào phúc mạc), tiêm tĩnh mạch, tiêm tĩnh mạch, (qua mắt), tiêm vào hang, (vào gốc dương vật), tiêm tĩnh mạch tiêm trong tử cung, tiêm ngoài ối, qua da (khuếch tán qua da nguyên vẹn để phân bố toàn thân), qua niêm mạc (khuếch tán qua màng nhầy), bơm hơi (khịt mũi), ngậm dưới lưỡi, dưới môi, thuốc xổ, thuốc nhỏ mắt (lên kết mạc), hoặc trong thuốc nhỏ tai. Theo các phương án cụ thể, chế phẩm có thể được sử dụng theo cách cho phép chúng đi qua hàng rào máu-não, hàng rào mạch máu, hoặc hàng rào biểu mô khác. Các đường sử dụng không giới hạn đối với polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế được mô tả dưới đây.
Quản lý tiêm và tiêm
Dạng liều lỏng để sử dụng ngoài đường tiêu hóa bao gồm, nhưng không giới hạn ở, nhũ tương dược dụng, vi nhũ tương, dung dịch, hỗn dịch, xirô, và/hoặc rượu ngọt. Ngoài các hoạt chất, dạng bào chế lỏng có thể chứa chất pha loãng trơ thường được sử dụng trong lĩnh vực kỹ thuật này như, ví dụ, nước hoặc các dung môi khác, chất hòa tan và chất nhũ hóa như rượu etylic, rượu isopropyl, etyl cacbonat, etyl axetat, rượu benzyl, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, dimethylformamide, các loại dầu (đặc biệt là dầu hạt bông, lạc, ngô, mầm, ô liu, dầu thầu dầu và dầu mè), glycerol, rượu tetrahydrofurfuryl, polyethylen glycol và este axit béo của sorbitan , và hỗn hợp của chúng. Ngoài các chất pha loãng trơ, chế phẩm dùng qua đường miệng có thể bao gồm các chất bổ trợ như chất làm ướt, chất nhũ hóa và chất tạo huyền phù, chất làm ngọt, hương liệu, và/hoặc chất tạo hương thơm. Theo các phương án nhất định để dùng qua đường tiêm truyền, chế phẩm được trộn với chất hòa tan như CREMOPHOR®, rượu, dầu, dầu biến tính, glycol, polysorbat, cyclodextrin, polyme, và/hoặc hỗn hợp của chúng.
Các chế phẩm tiêm, ví dụ, huyền phù chứa nước hoặc huyền phù có dầu để tiêm vô trùng có thể được bào chế theo kỹ thuật đã biết bằng cách sử dụng chất phân tán, chất làm ướt, và/hoặc chất tạo hỗn dịch thích hợp. Chế phẩm tiêm vô trùng có thể là dung dịch tiêm vô trùng, hỗn dịch và/hoặc nhũ tương trong chất pha loãng và/hoặc dung môi không độc được chấp nhận qua đường tiêm, ví dụ, ở dạng dung dịch trong 1,3-butanediol. Trong số các chất dẫn và dung môi được chấp nhận có thể được sử dụng là nước, dung dịch Ringer, U.S.P. và dung dịch natri clorua đẳng trương. Các loại dầu cố định, vô trùng thường được sử dụng làm dung môi hoặc môi trường huyền phù. Với mục đích này, bất kỳ loại dầu cố định nhạt nào cũng có thể được sử dụng bao gồm cả mono- hoặc diglyceride tổng hợp. Các axit béo như axit oleic có thể được sử dụng để bào chế thuốc tiêm.
Các chế phẩm tiêm có thể được tiệt trùng, ví dụ, bằng cách lọc qua bộ lọc giữ vi khuẩn, và/hoặc bằng cách kết hợp các chất khử trùng ở dạng chế phẩm rắn vô trùng mà có thể được hòa tan hoặc phân tán trong nước vô trùng hoặc môi trường tiêm vô trùng khác trước khi sử dụng.
Để kéo dài tác dụng của một hoạt chất, người ta thường mong muốn làm chậm sự hấp thu của hoạt chất đó khi tiêm dưới da hoặc tiêm bắp. Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng huyền phù lỏng của vật liệu tinh thể hoặc vô định hình có độ hòa tan trong nước kém. Tốc độ hấp thu của thuốc sau đó phụ thuộc vào tốc độ hòa tan của thuốc, do đó, có thể phụ thuộc vào kích thước tinh thể và dạng tinh thể. Ngoài ra, sự hấp thu chậm của dạng thuốc dùng qua đường tiêm được thực hiện bằng cách hòa tan hoặc tạo huyền phù thuốc trong chất dẫn dầu. Dạng kho chứa thuốc tiêm được tạo ra bằng cách hình thành ma trận vi nang của thuốc trong các polyme có khả năng phân hủy sinh học như polylactide-polyglycolide. Tùy thuộc vào tỷ lệ thuốc với polyme và bản chất của loại polyme cụ thể được sử dụng, tốc độ giải phóng thuốc có thể được kiểm soát. Ví dụ về các polyme phân hủy sinh học khác bao gồm poly(orthoesters) và poly(anhydrit). Công thức thuốc tiêm dự trữ được điều chế bằng cách đưa thuốc vào các liposome hoặc vi nhũ tương tương thích với các mô cơ thể.
Quản lý trực tràng và âm đạo
Các chế phẩm dùng để sử dụng qua đường trực tràng hoặc âm đạo thường là thuốc đạn có thể được điều chế bằng cách trộn các chế phẩm với tá dược không gây kích ứng thích hợp như bơ ca cao, polyetylen glycol hoặc sáp đặt ở dạng rắn ở nhiệt độ môi trường nhưng ở dạng lỏng ở nhiệt độ cơ thể và do đó tan chảy trong trực tràng. hoặc khoang âm đạo và giải phóng hoạt chất.
Uống
Dạng liều lỏng dùng qua đường miệng bao gồm, nhưng không giới hạn ở, nhũ tương dược dụng, vi nhũ tương, dung dịch, hỗn dịch, xirô, và/hoặc rượu ngọt. Ngoài các hoạt chất, dạng bào chế lỏng có thể chứa chất pha loãng trơ thường được sử dụng trong lĩnh vực kỹ thuật này như, ví dụ, nước hoặc các dung môi khác, chất hòa tan và chất nhũ hóa như rượu etylic, rượu isopropyl, etyl cacbonat, etyl axetat, rượu benzyl, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, dimethylformamide, các loại dầu (đặc biệt là dầu hạt bông, lạc, ngô, mầm, ô liu, dầu thầu dầu và dầu mè), glycerol, rượu tetrahydrofurfuryl, polyethylen glycol và este axit béo của sorbitan , và hỗn hợp của chúng. Ngoài các chất pha loãng trơ, chế phẩm dùng qua đường miệng có thể bao gồm các chất bổ trợ như chất làm ướt, chất nhũ hóa và chất tạo huyền phù, chất làm ngọt, hương liệu, và/hoặc chất tạo hương thơm. Theo các phương án nhất định để dùng qua đường tiêm truyền, chế phẩm được trộn với chất hòa tan như CREMOPHOR®, rượu, dầu, dầu biến tính, glycol, polysorbat, cyclodextrin, polyme, và/hoặc hỗn hợp của chúng.
Các dạng bào chế rắn dùng qua đường uống bao gồm viên nang, viên nén, viên tròn, bột và hạt. Ở các dạng liều rắn này, thành phần hoạt chất được trộn với ít nhất một tá dược trơ, được chấp nhận về mặt dược dụng như natri citrat hoặc dicanxi photphat và/hoặc chất độn hoặc chất độn (ví dụ: tinh bột, lactoza, sucrose, glucoza, mannitol và axit silicic), chất kết dính (ví dụ: carboxymethylcellulose, alginate, gelatin, polyvinylpyrrolidinone, sucrose và keo), chất làm ẩm (ví dụ: glycerol), chất phân hủy (ví dụ: thạch, canxi cacbonat, tinh bột khoai tây hoặc bột sắn, axit alginic, một số silicat và natri cacbonat), chất làm chậm dung dịch chất (ví dụ: parafin), chất tăng tốc hấp thụ (ví dụ: hợp chất amoni bậc bốn), chất làm ướt (ví dụ: rượu cetyl và glycerol monostearate), chất hấp thụ (ví dụ: đất sét cao lanh và bentonite), và chất bôi trơn (ví dụ: bột talc, canxi stearate, magie stearat, polyethylen glycol rắn , natri lauryl sulfat), và hỗn hợp của chúng. Trong trường hợp viên nang, viên nén và viên tròn, dạng bào chế có thể chứa chất đệm.
Dùng tại chỗ hoặc qua da
Như được mô tả ở đây, chế phẩm chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được bào chế để sử dụng tại chỗ. Da có thể là vị trí lý tưởng để phân phối vì nó dễ tiếp cận. Sự biểu hiện gen có thể bị hạn chế không chỉ ở da, có khả năng tránh được độc tính không đặc hiệu mà còn ở các lớp và loại tế bào cụ thể bên trong da.
Vị trí biểu hiện ở da của chế phẩm được phân phối sẽ phụ thuộc vào đường phân phối axit nucleic. Ba đường thường được coi là cung cấp polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA cho da: (i) bôi tại chỗ (ví dụ: để điều trị tại chỗ/khu vực và/hoặc dùng trong mỹ phẩm); (ii) tiêm trong da (ví dụ: để điều trị tại chỗ/khu vực và/hoặc ứng dụng thẩm mỹ); và (iii) phân phối toàn thân (ví dụ: để điều trị các bệnh da liễu ảnh hưởng đến cả vùng da và vùng ngoài da). Polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN có thể được đưa vào da bằng một số phương pháp khác nhau đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Hầu hết các phương pháp phân phối tại chỗ đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc phân phối DNA, chẳng hạn như nhưng không giới hạn ở việc ứng dụng tại chỗ phức hợp liposome-DNA không cation, phức hợp liposome-DNA cation, qua trung gian hạt (súng gen), gen qua trung gian đâm thủng truyền nhiễm và các phương pháp phân phối virus. Sau khi cung cấp axit nucleic, các sản phẩm gen đã được phát hiện ở một số loại tế bào da khác nhau, bao gồm nhưng không giới hạn ở tế bào sừng cơ bản, tế bào tuyến bã nhờn, nguyên bào sợi ở da và đại thực bào ở da.
Theo một phương án, sáng chế đề xuất nhiều loại băng (ví dụ, băng vết thương) hoặc băng (ví dụ, băng dính) để thực hiện các phương pháp theo sáng chế một cách thuận tiện và/hoặc hiệu quả. Thông thường, băng hoặc băng có thể chứa đủ lượng dược phẩm và/hoặc polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được mô tả ở đây để cho phép người dùng thực hiện nhiều phương pháp điều trị cho (các) đối tượng.
Theo một phương án, sáng chế đề xuất các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc chế phẩm mmRNA được phân phối trong nhiều lần tiêm.
Theo một phương án, trước khi sử dụng tại chỗ và/hoặc qua da, ít nhất một vùng mô, chẳng hạn như da, có thể phải chịu tác động của thiết bị và/hoặc dung dịch có thể làm tăng tính thấm. Theo một phương án, mô có thể được sử dụng thiết bị mài mòn để tăng tính thấm của da (xem Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 20080275468, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Theo một phương án khác, mô có thể được sử dụng thiết bị tăng cường siêu âm. Thiết bị tăng cường siêu âm có thể bao gồm nhưng không giới hạn ở các thiết bị được mô tả trong Ấn phẩm Hoa Kỳ số 20040236268 và Pat. số 6.491.657 và 6.234.990; mỗi nội dung đó đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Các phương pháp tăng cường tính thấm của mô được mô tả trong Ấn phẩm Hoa Kỳ số 20040171980 và 20040236268 và US Pat. số 6.190.315; mỗi nội dung đó đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, thiết bị có thể được sử dụng để tăng tính thấm của mô trước khi phân phối các chế phẩm chứa mARN biến đổi được mô tả ở đây. Khả năng thấm của da có thể được đo bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc được mô tả trong US Pat. Số 6.190.315, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Như một ví dụ không giới hạn, chế phẩm mARN cải biến có thể được phân phối bằng các phương pháp phân phối thuốc được mô tả trong US Pat. Số 6.190.315, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Trong một ví dụ không giới hạn khác, mô có thể được xử lý bằng hỗn hợp eutectic của kem gây tê cục bộ (EMLA) trước, trong và/hoặc sau khi mô có thể được tiếp xúc với thiết bị có thể làm tăng tính thấm. Katz và cộng sự. (Anesth Analg (2004); 98:371-76; được đưa toàn bộ vào tài liệu này bằng cách tham chiếu) đã chỉ ra rằng việc sử dụng kem EMLA kết hợp với năng lượng thấp, tác dụng giảm đau bề mặt ở da được thấy nhanh chóng chỉ sau 5 phút sau khi điều trị trước đó. bằng sóng siêu âm năng lượng thấp.
Theo một phương án, chất tăng cường có thể được áp dụng cho mô trước, trong và/hoặc sau khi mô đã được xử lý để tăng tính thấm. Chất tăng cường bao gồm nhưng không giới hạn ở chất tăng cường vận chuyển, chất tăng cường vật lý và chất tăng cường xâm thực. Các ví dụ không giới hạn về chất tăng cường được mô tả trong US Pat. Số 6.190.315, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, thiết bị có thể được sử dụng để tăng tính thấm của mô trước khi phân phối các chế phẩm chứa mARN biến đổi được mô tả ở đây, thiết bị này có thể chứa thêm chất gây ra phản ứng miễn dịch. Trong một ví dụ không giới hạn khác, chế phẩm chứa chất để kích hoạt phản ứng miễn dịch có thể được tạo ra bằng các phương pháp được mô tả trong Ấn bản Hoa Kỳ số 20040171980 và 20040236268; mỗi nội dung đó đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Dạng liều để sử dụng tại chỗ và/hoặc qua da của chế phẩm có thể bao gồm thuốc mỡ, bột nhão, kem, nước thơm, gel, bột, dung dịch, thuốc xịt, thuốc hít và/hoặc miếng dán. Thông thường, thành phần hoạt chất được trộn trong điều kiện vô trùng với tá dược dược dụng và/hoặc chất bảo quản và/hoặc chất đệm cần thiết bất kỳ nếu cần.
Ngoài ra, sáng chế dự tính sử dụng miếng dán thẩm thấu qua da, miếng dán này thường có thêm ưu điểm là mang lại khả năng phân phối hợp chất vào cơ thể có kiểm soát. Các dạng liều này có thể được điều chế, ví dụ, bằng cách hòa tan và/hoặc phân phối hợp chất này trong môi trường thích hợp. Theo cách khác hoặc bổ sung, tốc độ có thể được kiểm soát bằng cách cung cấp màng kiểm soát tốc độ và/hoặc bằng cách phân tán hợp chất trong nền polyme và/hoặc gel.
Các chế phẩm thích hợp để bôi tại chỗ bao gồm, nhưng không giới hạn, các chế phẩm lỏng và/hoặc bán lỏng như dầu xoa bóp, lotion, dầu trong nước và/hoặc nước trong nhũ tương dầu như kem, thuốc mỡ và/hoặc bột nhão, và/hoặc dung dịch. và/hoặc đình chỉ.
Ví dụ, các chế phẩm dùng tại chỗ có thể chứa từ khoảng 0,1% đến khoảng 10% (w/w) hoạt chất, mặc dù nồng độ của hoạt chất có thể cao bằng giới hạn hòa tan của hoạt chất trong dung môi. Các chế phẩm dùng tại chỗ có thể còn chứa một hoặc nhiều thành phần bổ sung được mô tả ở đây.
Quản lý kho
Như được mô tả ở đây, theo một số phương án, chế phẩm này được bào chế ở dạng dự trữ để giải phóng kéo dài. Nói chung, một cơ quan hoặc mô cụ thể (“mô đích”) sẽ được nhắm mục tiêu để sử dụng.
Theo một số khía cạnh của sáng chế, các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA được giữ lại về mặt không gian bên trong hoặc ở gần mô đích. Sáng chế đề xuất phương pháp cung cấp chế phẩm cho mô đích của đối tượng động vật có vú bằng cách cho mô đích (chứa một hoặc nhiều tế bào đích) tiếp xúc với chế phẩm này trong các điều kiện sao cho chế phẩm, đặc biệt là (các) thành phần axit nucleic của về cơ bản được giữ lại trong mô đích, nghĩa là ít nhất 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 hoặc lớn hơn 99,99% thành phần được giữ lại trong mô đích. Tốt hơn là, khả năng lưu giữ được xác định bằng cách đo lượng axit nucleic có trong chế phẩm đi vào một hoặc nhiều tế bào đích. Ví dụ: ít nhất 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 hoặc lớn hơn 99,99% hạt nhân các axit được sử dụng cho đối tượng này hiện diện trong tế bào ở một khoảng thời gian sau khi sử dụng. Ví dụ, tiêm bắp cho đối tượng động vật có vú được thực hiện bằng cách sử dụng chế phẩm nước chứa axit ribonucleic và thuốc thử chuyển hóa, và việc duy trì chế phẩm này được xác định bằng cách đo lượng axit ribonucleic có trong tế bào cơ.
Các khía cạnh của sáng chế đề cập đến phương pháp cung cấp chế phẩm cho mô đích của đối tượng động vật có vú, bằng cách cho mô đích (chứa một hoặc nhiều tế bào đích) tiếp xúc với chế phẩm này trong các điều kiện sao cho chế phẩm này gần như được giữ lại trong mô đích. . Chế phẩm này chứa lượng hữu hiệu của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA sao cho polypeptit quan tâm được tạo ra ở ít nhất một tế bào đích. Chế phẩm thường chứa chất thấm tế bào, mặc dù axit nucleic “trần” (như axit nucleic không có chất thấm tế bào hoặc chất khác) cũng được dự tính, và chất mang dược dụng.
Trong một số trường hợp, lượng protein được sản xuất bởi các tế bào trong mô tăng lên một cách mong muốn. Tốt hơn là, sự gia tăng sản xuất protein này được giới hạn về mặt không gian ở các tế bào trong mô đích. Vì vậy, sáng chế đề xuất các phương pháp tăng cường sản xuất protein cần quan tâm trong mô của động vật có vú. Sáng chế đề xuất chứa các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA được đặc trưng ở chỗ một lượng đơn vị chế phẩm đã được xác định là có thể tạo ra polypeptit cần quan tâm trong một tỷ lệ phần trăm đáng kể các tế bào được chứa trong một thể tích xác định trước của mô đích.
Theo một số phương án, chế phẩm bao gồm nhiều polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA khác nhau, trong đó một hoặc nhiều trong số các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA mã hóa polypeptit cần quan tâm. Tùy ý, chế phẩm này cũng chứa chất thấm vào tế bào để hỗ trợ việc phân phối chế phẩm vào nội bào. Việc xác định được thực hiện dựa trên liều lượng của chế phẩm cần thiết để tạo ra polypeptit quan tâm trong một tỷ lệ phần trăm đáng kể các tế bào có trong thể tích xác định trước của mô đích (nói chung, không tạo ra sự sản xuất đáng kể polypeptit quan tâm trong mô liền kề với khối lượng xác định trước). thể tích hoặc ở xa mô đích). Sau quyết định này, liều xác định sẽ được đưa trực tiếp vào mô của đối tượng động vật có vú.
Theo một phương án, sáng chế đề xuất các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được phân phối dưới dạng nhiều lần tiêm hoặc bằng cách tiêm chia liều.
Theo một phương án, sáng chế có thể được giữ lại gần mô đích bằng cách sử dụng bình chứa thuốc nhỏ dùng một lần, bơm vá hoặc bơm thẩm thấu. Ví dụ không giới hạn về máy bơm vá bao gồm những máy được sản xuất và/hoặc bán bởi BD® (Franklin Lakes, NJ), Insulet Corporation (Bedford, MA), SteadyMed Therapeutics (San Francisco, CA), Medtronic (Minneapolis, MN) (ví dụ, MiniMed), UniLife (York, PA), Valeritas (Bridgewater, NJ) và SpringLeaf Therapeutics (Boston, MA). Một ví dụ không giới hạn về máy bơm thẩm thấu bao gồm những máy do DURECT® (Cupertino, CA) sản xuất (ví dụ: DUROS® và ALZET®).
Quản lý phổi
Dược phẩm có thể được bào chế, đóng gói và/hoặc bán ở dạng chế phẩm thích hợp để sử dụng qua phổi qua khoang miệng. Chế phẩm này có thể chứa các hạt khô chứa hoạt chất và có đường kính nằm trong khoảng từ khoảng 0,5 nm đến khoảng 7 nm hoặc từ khoảng 1 nm đến khoảng 6 nm. Các chế phẩm này thích hợp ở dạng bột khô để sử dụng bằng cách sử dụng thiết bị bao gồm bình chứa bột khô mà dòng chất đẩy có thể hướng tới để phân tán bột và/hoặc sử dụng thùng phân phối dung môi/bột tự hành như thiết bị bao gồm thành phần hoạt chất được hòa tan và/hoặc lơ lửng trong chất đẩy có nhiệt độ sôi thấp đựng trong hộp kín. Các loại bột này bao gồm các hạt trong đó ít nhất 98% số hạt tính theo trọng lượng có đường kính lớn hơn 0,5 nm và ít nhất 95% số lượng hạt có đường kính nhỏ hơn 7 nm. Ngoài ra, ít nhất 95% số hạt theo trọng lượng có đường kính lớn hơn 1 nm và ít nhất 90% số lượng hạt có đường kính nhỏ hơn 6 nm. Chế phẩm bột khô có thể bao gồm chất pha loãng bột mịn rắn như đường và được cung cấp thuận tiện ở dạng liều đơn vị.
Chất đẩy có độ sôi thấp thường bao gồm chất đẩy dạng lỏng có nhiệt độ sôi dưới 65° F. ở áp suất khí quyển. Nói chung, chất đẩy có thể chiếm từ 50% đến 99,9% (w/w) của chế phẩm và thành phần hoạt chất có thể chiếm từ 0,1% đến 20% (w/w) của chế phẩm. Chất đẩy còn có thể bao gồm các thành phần bổ sung như chất hoạt động bề mặt dạng lỏng không ion và/hoặc chất rắn anion và/hoặc chất pha loãng rắn (có thể có kích thước hạt giống như các hạt bao gồm thành phần hoạt chất).
Như một ví dụ không giới hạn, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA được mô tả ở đây có thể được bào chế để phân phối qua phổi bằng các phương pháp được mô tả trong US Pat. số 8.257.685; ở đây được đưa toàn bộ vào bằng cách viện dẫn.
Dược phẩm được bào chế để phân phối qua phổi có thể cung cấp thành phần hoạt tính ở dạng giọt dung dịch và/hoặc hỗn dịch. Các chế phẩm này có thể được điều chế, đóng gói và/hoặc bán dưới dạng dung dịch nước và/hoặc dung dịch cồn pha loãng và/hoặc hỗn dịch, vô trùng tùy ý, chứa hoạt chất, và có thể được sử dụng một cách thuận tiện bằng cách sử dụng bất kỳ thiết bị phun khí dung và/hoặc nguyên tử hóa nào. Các công thức này có thể còn bao gồm một hoặc nhiều thành phần bổ sung bao gồm, nhưng không giới hạn ở, chất tạo hương vị như natri saccharin, dầu dễ bay hơi, chất đệm, chất hoạt động bề mặt, và/hoặc chất bảo quản như metylhydroxybenzoat. Các giọt được cung cấp theo đường sử dụng này có thể có đường kính trung bình trong khoảng từ khoảng 0,1 nm đến khoảng 200 nm.
Quản lý nội sọ, mũi và miệng
Các chế phẩm được mô tả ở đây là hữu ích cho việc phân phối qua phổi cũng hữu ích cho việc phân phối dược phẩm qua đường mũi. Một công thức khác thích hợp để dùng qua đường mũi là dạng bột thô chứa thành phần hoạt chất và có kích thước hạt trung bình từ khoảng 0,2 μm đến 500 μm. Công thức như vậy được sử dụng theo cách hít thuốc hít, tức là hít nhanh qua đường mũi từ hộp chứa bột được đặt gần mũi.
Ví dụ, các chế phẩm thích hợp để dùng qua đường mũi có thể chứa từ khoảng 0,1% (w/w) đến 100% (w/w) hoạt chất, và có thể chứa một hoặc nhiều thành phần bổ sung được mô tả ở đây. . Dược phẩm có thể được bào chế, đóng gói và/hoặc bán ở dạng chế phẩm thích hợp để dùng qua đường má. Các công thức này có thể, ví dụ, ở dạng viên nén và/hoặc viên ngậm được bào chế bằng các phương pháp thông thường, và có thể, ví dụ, 0,1% đến 20% (w/w) hoạt chất, phần cân bằng bao gồm chất hòa tan qua đường uống và/hoặc chế phẩm có thể phân hủy và, tùy ý, một hoặc nhiều thành phần bổ sung được mô tả ở đây. Theo cách khác, chế phẩm thích hợp để sử dụng qua đường miệng có thể chứa bột và/hoặc dung dịch khí dung và/hoặc nguyên tử hóa và/hoặc huyền phù chứa thành phần hoạt chất. Các chế phẩm dạng bột, được sol khí hóa và/hoặc được sol khí hóa như vậy, khi được phân tán, có thể có kích thước hạt và/hoặc giọt trung bình nằm trong khoảng từ khoảng 0,1 nm đến khoảng 200 nm, và có thể chứa thêm một hoặc nhiều thành phần bổ sung bất kỳ được mô tả ở đây.
Quản lý nhãn khoa
Dược phẩm có thể được bào chế, đóng gói và/hoặc bán ở dạng chế phẩm thích hợp để dùng cho nhãn khoa. Ví dụ, các chế phẩm này có thể ở dạng thuốc nhỏ mắt bao gồm, ví dụ, dung dịch 0,1/1,0% (w/w) và/hoặc huyền phù của thành phần hoạt chất trong tá dược dạng lỏng hoặc dạng dầu. Những giọt như vậy còn có thể bao gồm chất đệm, muối, và/hoặc một hoặc nhiều thành phần bổ sung bất kỳ được mô tả ở đây. Các chế phẩm dùng để nhỏ mắt khác mà hữu ích bao gồm các chế phẩm chứa thành phần hoạt chất ở dạng vi tinh thể và/hoặc ở dạng chế phẩm liposom. Thuốc nhỏ tai và/hoặc thuốc nhỏ mắt được coi là nằm trong phạm vi của sáng chế này. Thiết bị màng mỏng nhiều lớp có thể được điều chế để chứa dược phẩm để phân phối đến mắt và/hoặc mô xung quanh.
Quản lý tải trọng: Tác nhân có thể phát hiện và Tác nhân trị liệu
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được mô tả ở đây có thể được sử dụng trong một số trường hợp khác nhau trong đó mong muốn phân phối chất (“khối lượng”) đến mục tiêu sinh học, ví dụ, phân phối các chất có thể phát hiện được để phát hiện mục tiêu, hoặc cung cấp một tác nhân trị liệu. Các phương pháp phát hiện có thể bao gồm, nhưng không giới hạn, cả phương pháp tạo ảnh in vitro và in vivo, ví dụ: hóa mô miễn dịch, chụp ảnh phát quang sinh học (BLI), Chụp cộng hưởng từ (MRI), chụp cắt lớp phát xạ positron (PET), kính hiển vi điện tử, X- chụp cắt lớp vi tính bằng tia, chụp ảnh Raman, chụp cắt lớp kết hợp quang học, chụp ảnh hấp thụ, chụp ảnh nhiệt, chụp ảnh phản xạ huỳnh quang, kính hiển vi huỳnh quang, chụp ảnh cắt lớp phân tử huỳnh quang, chụp cộng hưởng từ hạt nhân, chụp ảnh tia X, chụp ảnh siêu âm, chụp ảnh quang âm, xét nghiệm trong phòng thí nghiệm, hoặc trong bất kỳ tình huống nào cần phải gắn thẻ/nhuộm/chụp ảnh.
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN có thể được thiết kế để bao gồm cả trình tự liên kết và phần tải theo hướng hữu ích bất kỳ. Ví dụ, một trình liên kết có hai đầu được sử dụng để gắn một đầu vào tải trọng và đầu kia vào nucleobase, chẳng hạn như ở vị trí C-7 hoặc C-8 của deaza-adenosine hoặc deaza-guanosine hoặc với N Vị trí -3 hoặc C-5 của cytosine hoặc uracil. Polynucleotit theo sáng chế có thể bao gồm nhiều hơn một trọng tải (ví dụ, chất đánh dấu và chất ức chế phiên mã), cũng như trình tự liên kết có thể phân tách. Theo một phương án, nucleotit biến đổi là 7-deaza-adenosine triphosphat biến đổi, trong đó một đầu của trình tự liên kết có thể phân tách được gắn vào vị trí C7 của 7-deaza-adenin, đầu còn lại của trình tự liên kết được gắn vào chất ức chế (ví dụ, , đến vị trí C5 của nucleobase trên cytidine) và nhãn (ví dụ: Cy5) được gắn vào tâm của trình liên kết (xem ví dụ: hợp chất 1 của A*pCp C5 Parg Capless trong
Sơ đồ 12 dưới đây mô tả nucleotit biến đổi làm ví dụ trong đó nucleobase, adenin, được gắn vào trình tự liên kết ở cacbon C-7 của 7-deaza adenin. Ngoài ra, sơ đồ 12 mô tả nucleotit biến đổi có trình liên kết và tải trọng, ví dụ, tác nhân có thể phát hiện được, được kết hợp vào đầu 3’ của mARN. Sự phân tách disulfide và bổ sung 1,2 nhóm thiol vào este propargyl sẽ giải phóng tác nhân có thể phát hiện được. Cấu trúc còn lại (ví dụ được mô tả là pApC5Parg trong Sơ đồ 12) là chất ức chế. Cơ sở lý luận cho cấu trúc của các nucleotide bị biến đổi là do chất ức chế liên kết can thiệp vào khả năng của polymerase kết hợp với bazơ thứ hai. Vì vậy, điều quan trọng là dây nối phải đủ dài để tác động đến chức năng này và chất ức chế phải có hướng hóa học lập thể để ức chế hoặc cấm các nucleotide thứ hai và theo sau vào chuỗi polynucleotide đang phát triển.
Ví dụ, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được mô tả ở đây có thể được sử dụng để lập trình lại các tế bào gốc đa năng cảm ứng (tế bào iPS), mà có thể theo dõi trực tiếp các tế bào được chuyển nhiễm so với tổng số tế bào trong cụm. Trong một ví dụ khác, thuốc có thể được gắn vào polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA thông qua trình tự liên kết và có thể được đánh dấu huỳnh quang có thể được sử dụng để theo dõi thuốc in vivo, ví dụ: nội bào. Các ví dụ khác bao gồm, nhưng không giới hạn ở, việc sử dụng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA trong việc phân phối thuốc thuận nghịch vào tế bào.
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được mô tả ở đây có thể được sử dụng để nhắm đích nội bào của trọng tải, ví dụ, tác nhân điều trị hoặc có thể phát hiện được, tới cơ quan cụ thể. Các mục tiêu nội bào được lấy làm ví dụ có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, quá trình định vị hạt nhân để xử lý mARN tiên tiến, hoặc trình tự định vị hạt nhân (NLS) được liên kết với mARN chứa chất ức chế.
Ngoài ra, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được mô tả ở đây có thể được sử dụng để phân phối chất điều trị đến tế bào hoặc mô, ví dụ, ở động vật sống. Ví dụ, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được mô tả ở đây có thể được sử dụng để phân phối tác nhân hóa trị liệu có độ phân cực cao để tiêu diệt tế bào ung thư. Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được gắn vào tác nhân điều trị thông qua trình liên kết có thể tạo điều kiện cho sự thẩm thấu của các bộ phận cho phép tác nhân điều trị di chuyển vào tế bào để đạt được mục tiêu nội bào.
Trong một ví dụ, trình tự liên kết được gắn ở vị trí 2′ của vòng ribose và/hoặc ở vị trí 3′ và/hoặc 5′ của polynucleotit, cấu trúc bậc một mmRNA (Xem ví dụ, International Pub. Số WO2012030683, ở đây được đưa vào toàn bộ bằng cách tham chiếu). Trình liên kết có thể là bất kỳ trình liên kết nào được tiết lộ ở đây, được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc được tiết lộ trong International Pub. Số WO2012030683, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một ví dụ khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được gắn vào các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA, peptit ức chế virus (VIP) thông qua trình tự liên kết có thể phân cắt. Trình liên kết có thể phân tách có thể giải phóng VIP và thuốc nhuộm vào trong tế bào. Trong một ví dụ khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được gắn thông qua trình tự liên kết với ADP-ribosylat, chất này chịu trách nhiệm cho hoạt động của một số độc tố vi khuẩn, chẳng hạn như độc tố dịch tả, độc tố bạch hầu và độc tố ho gà. Những protein độc tố này là ADP-ribosyltransferase có tác dụng biến đổi protein mục tiêu trong tế bào người. Ví dụ, protein G ADP-ribosylates của độc tố tả làm biến đổi tế bào người bằng cách tiết ra một lượng lớn chất lỏng từ niêm mạc ruột non, dẫn đến tiêu chảy đe dọa tính mạng.
Theo một số phương án, trọng tải có thể là tác nhân trị liệu như chất độc tế bào, ion phóng xạ, hóa trị liệu, hoặc tác nhân trị liệu khác. Chất độc tế bào hoặc chất gây độc tế bào bao gồm bất kỳ chất nào có thể gây hại cho tế bào. Các ví dụ bao gồm nhưng không giới hạn ở taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, teniposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracinedione, mitoxantrone, mithramycin, Actinomycin D, 1-dehydrotestosterone , glucocorticoid, Procaine, tetracaine, lidocain, propranolol, puromycin, maytansinoids, ví dụ: maytansinol (xem toàn bộ bằng sáng chế Hoa Kỳ số 5,208,020 được đưa vào đây), rachelmycin (CC-1065, xem bằng sáng chế Hoa Kỳ số 5,475,092, 5,585,499, và 5,846,545, tất cả đều được đưa vào đây bằng cách viện dẫn), và các từ tương tự hoặc tương đồng của chúng. Các ion phóng xạ bao gồm, nhưng không giới hạn ở iốt (ví dụ, iốt 125 hoặc iốt 131), strontium 89, phốt pho, palladium, Caesium, iridium, phosphate, coban, yttrium 90, samarium 153 và praseodymium. Các chất điều trị khác bao gồm, nhưng không giới hạn ở, chất chống chuyển hóa (ví dụ, methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, 5-fluorouracil decarbazine), chất kiềm hóa (ví dụ, mechlorethamine, thiotepa chlorambucil, rachelmycin (CC-1065), melphalan, carmustine (BSNU), lomustine (CCNU), cyclophosphamide, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, mitomycin C, và cis-dichlorodiamine platin (II) (DDP) cisplatin), anthracycline (ví dụ, daunorubicin (trước đây là daunomycin) và doxorubicin), kháng sinh (ví dụ: dactinomycin (trước đây là Actinomycin), bleomycin, mithramycin và anthramycin (AMC)) và các chất chống phân bào (ví dụ: vincristine, vinblastine, taxol và maytansinoids).
Theo một số phương án, tải trọng có thể là tác nhân có thể phát hiện được, chẳng hạn như các phân tử hữu cơ nhỏ, hợp chất vô cơ, hạt nano, enzym hoặc cơ chất enzym, vật liệu huỳnh quang, vật liệu phát quang (ví dụ, luminol), vật liệu phát quang sinh học (ví dụ, luciferase, luciferin, và aequorin), vật liệu phát quang hóa học, vật liệu phóng xạ (ví dụ,18F,67Ga,81mKr,82Rb,111TRONG,123TÔI,133Xe,201TL,125TÔI,35S,14C,3H, hoặc99mTc (ví dụ, dưới dạng pertechnetate (technetate(VII), TcO4−)) và các chất tương phản (ví dụ: vàng (ví dụ: hạt nano vàng), gadolinium (ví dụ: chelat Gd), oxit sắt (ví dụ: oxit sắt siêu thuận từ (SPIO), hạt nano oxit sắt đơn tinh thể (MION) và oxit sắt siêu thuận từ siêu nhỏ (USPIO)), chelate mangan (ví dụ: Mn-DPDP), bari sulfat, chất cản quang i-ốt (iohexol), vi bọt hoặc perfluorocarbon). Các nhãn có thể phát hiện được bằng quang học này bao gồm, ví dụ, không giới hạn, axit 4-acetamido-4′-isothiocyanatostilbene-2,2′disulfonic; acridine và các dẫn xuất (ví dụ acridine và acridine isothiocyanate); Axit 5-(2′-aminoetyl)aminonaphthalene-1-sulfonic (EDANS); 4-amino-N-[3-vinylsulfonyl)phenyl]naphthalimide-3,5 disulfonat; N-(4-anilino-1-naphthyl)maleimua; anthranilamid; CƠ THỂ; Màu vàng rực rỡ; coumarin và các dẫn xuất (ví dụ, coumarin, 7-amino-4-methylcoumarin (AMC, Coumarin 120) và 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin (Coumarin 151)); thuốc nhuộm xyanua; xyanua; 4′,6-diaminidino-2-phenylindole (DAPI); 5′ 5″-dibromopyrogallol-sulfonaphthalein (Bromopyrogallol đỏ); 7-dietylamino-3-(4′-isothiocyanatophenyl)-4-metylcoumarin; diethylenetriamine pentaacetate; Axit 4,4′-diisothiocyanatodihydro-stilbene-2,2′-disulfonic; Axit 4,4′-diisothiocyanatostilbene-2,2′-disulfonic; 5-[dimethylamino]-naphthalene-1-sulfonyl clorua (DNS, dansylchloride); 4-dimethylaminophenylazophenyl-4′-isothiocyanate (DABITC); eosin và các dẫn xuất (ví dụ, eosin và eosin isothiocyanate); erythrosin và các dẫn xuất (ví dụ, erythrosin B và erythrosin isothiocyanate); ethidium; fluorescein và các dẫn xuất (ví dụ, 5-carboxyfluorescein (FAM), 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl)aminofluorescein (DTAF), 2′,7′-dimethoxy-4′5′-dichloro-6-carboxyfluorescein, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, X-rhodamine-5-(và -6)-isothiocyanate (QFITC hoặc XRITC) và fluorescamine); 2-[2-[3-[[1,3-dihydro-1,1-dimetyl-3-(3-sulfopropyl)-2H-benz[e]indol-2-ylidene]etyliden]-2-[4- (etoxycarbonyl)-1-piperazinyl]-1-cyclopenten-1-yl]ethenyl]-1,1-dimetyl-3-(3-sulforpropyl)-1H-benz[e]indolium hydroxit, muối bên trong, hợp chất với n, n-diethylethanamine(1:1) (IR144); 5-clo-2-[2-[3-[(5-clo-3-etyl-2(3H)-benzothiazol-ylidene)etyliden]-2-(diphenylamino)-1-cyclopenten-1-yl]ethenyl] -3-etyl benzothiazolium perclorat (IR140); Malachite xanh isothiocyanate; 4-methylumbelliferone orthocresolphthalein; nitrotyrosine; pararosaniline; Phenol đỏ; B-phycoerythrin; o-phthaldialdehyd; pyrene và các dẫn xuất (ví dụ: pyrene, pyrene butyrate và succinimidyl 1-pyrene); chấm lượng tử butyrate; Màu đỏ phản ứng 4 (CIBACRON™ Brilliant Red 3B-A); rhodamine và các dẫn xuất (ví dụ, 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), 6-carboxyrhodamine (R6G), lissamine rhodamine B sulfonyl clorua rhodarnine (Rhod), rhodamine B, rhodamine 123, rhodamine X isothiocyanate, sulforhodamine B, sulforhodamine 101, dẫn xuất sulfonyl clorua của sulforhodamine 101 (Texas Red), N,N,N′,N′tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA) tetramethyl rhodamine và tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC)); riboflavin; axit rosolic; dẫn xuất chelate terbium; Xyanine-3 (Cy3); Xyanine-5 (Cy5); xyanine-5,5 (Cy5.5), Cyanine-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Alexa 647; La Jolta xanh; phthalo xyanua; và naphthalo xyanua.
Theo một số phương án, tác nhân có thể phát hiện được có thể là tiền chất không thể phát hiện được và có thể phát hiện được khi kích hoạt (ví dụ, cấu trúc tetrazine-fluorophore phát huỳnh quang (ví dụ, tetrazine-BODIPY FL, tetrazine-Oregon Green 488, hoặc tetrazine-BODIPY TMR-X ) hoặc chất phát huỳnh quang có thể kích hoạt bằng enzyme (ví dụ: PROSENSE® (VisEn Medical))). Các thử nghiệm in vitro trong đó chế phẩm được đánh dấu enzym có thể được sử dụng bao gồm, nhưng không giới hạn ở, thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA), thử nghiệm kích thích miễn dịch, miễn dịch huỳnh quang, thử nghiệm miễn dịch enzyme (EIA), thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA), và phân tích Western blot.
kết hợp
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN có thể được sử dụng kết hợp với một hoặc nhiều tác nhân điều trị, phòng bệnh, chẩn đoán hoặc tạo hình ảnh khác. Bằng việc “kết hợp với”, điều này không có nghĩa là các chất này phải được sử dụng cùng lúc và/hoặc được bào chế để phân phối cùng nhau, mặc dù các phương pháp phân phối này nằm trong phạm vi của sáng chế. Các chế phẩm có thể được sử dụng đồng thời với, trước hoặc sau, một hoặc nhiều liệu pháp điều trị hoặc thủ thuật y tế mong muốn khác. Nói chung, mỗi tác nhân sẽ được sử dụng theo liều lượng và/hoặc theo lịch trình thời gian được xác định cho tác nhân đó. Theo một số phương án, sáng chế đề cập đến việc phân phối dược phẩm, chế phẩm phòng bệnh, chẩn đoán hoặc tạo hình kết hợp với các chất có thể cải thiện sinh khả dụng của chúng, làm giảm và/hoặc thay đổi quá trình chuyển hóa của chúng, ức chế sự bài tiết của chúng, và/hoặc làm thay đổi sự phân bố của chúng trong cơ thể. thân hình. Như một ví dụ không giới hạn, axit nucleic hoặc mmARN có thể được sử dụng kết hợp với dược phẩm để điều trị bệnh ung thư hoặc để kiểm soát các tế bào tăng sinh quá mức. Ở Hoa Kỳ Pat. Số 7,964,571, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn, liệu pháp kết hợp để điều trị khối u rắn nguyên phát hoặc đã di căn được mô tả bằng cách sử dụng dược phẩm bao gồm ADN plasmid mã hóa interleukin-12 bằng lipopolyme và cũng sử dụng ít nhất một chất chống ung thư hoặc hóa trị liệu. Hơn nữa, axit nucleic và mmRNA theo sáng chế mã hóa các phân tử chống tăng sinh có thể ở trong chế phẩm dược phẩm có lipopolyme (ví dụ, xem, Nhà xuất bản Hoa Kỳ số 20110218231, ở đây được đưa toàn bộ bằng cách viện dẫn, yêu cầu bảo hộ chế phẩm dược phẩm bao gồm plasmit ADN mã hóa phân tử chống tăng sinh và lipopolyme) mà có thể được sử dụng cùng với ít nhất một tác nhân hóa trị liệu hoặc tác nhân chống ung thư.
Sẽ được đánh giá cao hơn nữa rằng các hoạt chất dùng để điều trị, phòng bệnh, chẩn đoán hoặc tạo hình ảnh được sử dụng kết hợp có thể được sử dụng cùng nhau trong một chế phẩm duy nhất hoặc được sử dụng riêng biệt trong các chế phẩm khác nhau. Nói chung, người ta hy vọng rằng các tác nhân được sử dụng kết hợp sẽ được sử dụng ở mức độ không vượt quá mức mà chúng được sử dụng riêng lẻ. Theo một số phương án, mức sử dụng kết hợp sẽ thấp hơn mức sử dụng riêng lẻ. Theo một phương án, các dạng kết hợp, mỗi hoặc cùng nhau có thể được sử dụng theo các phác đồ chia liều được mô tả ở đây.
Liều lượng
Sáng chế đề xuất các phương pháp bao gồm sử dụng các mARN biến đổi và các protein hoặc phức hợp được mã hóa của chúng theo sáng chế cho đối tượng cần điều trị. Axit nucleic, protein hoặc phức hợp, hoặc dược phẩm, chế phẩm tạo hình, chẩn đoán hoặc phòng bệnh của chúng, có thể được sử dụng cho đối tượng bằng cách sử dụng lượng bất kỳ và đường sử dụng bất kỳ có hiệu quả để phòng ngừa, điều trị, chẩn đoán hoặc tạo hình ảnh một bệnh, rối loạn và/ hoặc tình trạng (ví dụ: một căn bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng liên quan đến suy giảm trí nhớ ngắn hạn). Lượng chính xác cần thiết sẽ khác nhau tùy theo từng đối tượng, tùy thuộc vào loài, độ tuổi và tình trạng chung của đối tượng, mức độ nghiêm trọng của bệnh, thành phần cụ thể, phương thức sử dụng, phương thức hoạt động, v.v. Các chế phẩm theo sáng chế thường được bào chế ở dạng đơn vị liều lượng để dễ sử dụng và tính đồng nhất của liều lượng. Tuy nhiên, cần hiểu rằng tổng lượng sử dụng hàng ngày các chế phẩm theo sáng chế có thể được quyết định bởi bác sĩ điều trị trong phạm vi đánh giá y tế hợp lý. Mức liều chụp ảnh phù hợp, hiệu quả về mặt điều trị, hiệu quả dự phòng hoặc phù hợp cho bất kỳ bệnh nhân cụ thể nào sẽ phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm rối loạn đang được điều trị và mức độ nghiêm trọng của rối loạn; hoạt động của hợp chất cụ thể được sử dụng; thành phần cụ thể được sử dụng; tuổi, cân nặng, sức khỏe chung, giới tính và chế độ ăn uống của bệnh nhân; thời gian dùng, đường dùng và tốc độ bài tiết của hợp chất cụ thể được sử dụng; thời gian điều trị; thuốc được sử dụng kết hợp hoặc phối hợp với hợp chất cụ thể được sử dụng; và giống như những yếu tố nổi tiếng trong lĩnh vực y học.
Theo các phương án nhất định, chế phẩm theo sáng chế có thể được sử dụng ở mức liều lượng đủ để cung cấp từ khoảng 0,0001 mg/kg đến khoảng 100 mg/kg, từ khoảng 0,001 mg/kg đến khoảng 0,05 mg/kg, từ khoảng 0,005 mg. /kg đến khoảng 0,05 mg/kg, từ khoảng 0,001 mg/kg đến khoảng 0,005 mg/kg, từ khoảng 0,05 mg/kg đến khoảng 0,5 mg/kg, từ khoảng 0,01 mg/kg đến khoảng 50 mg/kg, từ khoảng 0,1 mg/kg đến khoảng 40 mg/kg, từ khoảng 0,5 mg/kg đến khoảng 30 mg/kg, từ khoảng 0,01 mg/kg đến khoảng 10 mg/kg, từ khoảng 0,1 mg/kg đến khoảng 10 mg/kg, hoặc từ khoảng 1 mg/kg đến khoảng 25 mg/kg trọng lượng cơ thể của đối tượng mỗi ngày, một hoặc nhiều lần trong ngày, để đạt được hiệu quả điều trị, chẩn đoán, phòng ngừa hoặc tạo hình ảnh mong muốn. Liều lượng mong muốn có thể được cung cấp ba lần một ngày, hai lần một ngày, một lần một ngày, cách ngày, mỗi ngày thứ ba, mỗi tuần, hai tuần một lần, ba tuần một lần hoặc bốn tuần một lần. Theo các phương án nhất định, liều lượng mong muốn có thể được phân phối bằng cách sử dụng nhiều lần sử dụng (ví dụ, hai, ba, bốn, năm, sáu, bảy, tám, chín, mười, mười một, mười hai, mười ba, mười bốn, hoặc nhiều lần sử dụng). Khi sử dụng nhiều lần sử dụng, có thể sử dụng các phác đồ dùng thuốc chia nhỏ như các phác đồ được mô tả ở đây.
Theo sáng chế, người ta đã phát hiện ra rằng việc sử dụng mmRNA theo phác đồ chia liều sẽ tạo ra mức protein cao hơn ở các đối tượng là động vật có vú. Như được sử dụng ở đây, “liều chia” là việc chia liều đơn vị hoặc tổng liều hàng ngày thành hai liều trở lên, ví dụ, hai lần sử dụng trở lên của đơn vị liều đơn. Như được sử dụng ở đây, “liều đơn vị” là liều của thuốc điều trị bất kỳ được sử dụng theo một liều/tại một thời điểm/đường đơn/điểm tiếp xúc duy nhất, tức là, trường hợp sử dụng một lần. Như được sử dụng ở đây, “tổng liều hàng ngày” là lượng được đưa ra hoặc kê đơn trong khoảng thời gian 24 giờ. Nó có thể được dùng dưới dạng một đơn vị liều duy nhất. Theo một phương án, mmRNA theo sáng chế được sử dụng cho đối tượng theo các liều chia nhỏ. MmRNA có thể được tạo ra chỉ ở dạng đệm hoặc ở dạng công thức được mô tả ở đây.
Dạng bào chế
Dược phẩm được mô tả ở đây có thể được bào chế thành dạng liều được mô tả ở đây, như dạng bôi tại chỗ, trong mũi, trong khí quản, hoặc tiêm được (ví dụ, trong tĩnh mạch, trong mắt, trong dịch kính, trong cơ, trong tim, trong phúc mạc, dưới da).
Dạng bào chế dạng lỏng
Dạng liều lỏng để sử dụng ngoài đường tiêu hóa bao gồm, nhưng không giới hạn ở, nhũ tương dược dụng, vi nhũ tương, dung dịch, hỗn dịch, xirô, và/hoặc rượu ngọt. Ngoài các hoạt chất, dạng bào chế lỏng có thể chứa chất pha loãng trơ thường được sử dụng trong lĩnh vực kỹ thuật này, bao gồm nhưng không giới hạn ở nước hoặc các dung môi khác, chất hòa tan và chất nhũ hóa như rượu etylic, rượu isopropyl, etyl cacbonat, etyl axetat, rượu benzyl , benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, dimethylformamide, các loại dầu (đặc biệt là dầu hạt bông, lạc, ngô, mầm, ô liu, dầu thầu dầu và dầu mè), glycerol, rượu tetrahydrofurfuryl, polyethylen glycol và este axit béo của Sorbitan và hỗn hợp của chúng. Theo các phương án nhất định để dùng qua đường tiêm truyền, chế phẩm có thể được trộn với chất hòa tan như CREMOPHOR®, rượu, dầu, dầu biến tính, glycol, polysorbat, cyclodextrin, polyme, và/hoặc hỗn hợp của chúng.
Thuốc tiêm
Các chế phẩm tiêm, ví dụ, huyền phù chứa nước hoặc huyền phù có dầu để tiêm vô trùng có thể được bào chế theo kỹ thuật đã biết và có thể bao gồm chất phân tán, chất làm ướt, và/hoặc chất tạo hỗn dịch thích hợp. Chế phẩm tiêm vô trùng có thể là dung dịch tiêm vô trùng, hỗn dịch và/hoặc nhũ tương trong chất pha loãng và/hoặc dung môi không độc được chấp nhận qua đường tiêm, ví dụ, dung dịch trong 1,3-butanediol. Trong số các chất dẫn và dung môi được chấp nhận có thể được sử dụng bao gồm, nhưng không giới hạn ở nước, dung dịch Ringer, U.S.P., và dung dịch natri clorua đẳng trương. Các loại dầu cố định, vô trùng thường được sử dụng làm dung môi hoặc môi trường huyền phù. Với mục đích này, bất kỳ loại dầu cố định nhạt nào cũng có thể được sử dụng bao gồm cả mono- hoặc diglyceride tổng hợp. Các axit béo như axit oleic có thể được sử dụng để bào chế thuốc tiêm.
Các chế phẩm tiêm có thể được tiệt trùng, ví dụ, bằng cách lọc qua bộ lọc giữ vi khuẩn, và/hoặc bằng cách kết hợp các chất khử trùng ở dạng chế phẩm rắn vô trùng mà có thể được hòa tan hoặc phân tán trong nước vô trùng hoặc môi trường tiêm vô trùng khác trước khi sử dụng. Để kéo dài tác dụng của một hoạt chất, có thể nên làm chậm sự hấp thu của hoạt chất đó khi tiêm dưới da hoặc tiêm bắp. Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng huyền phù lỏng của vật liệu tinh thể hoặc vô định hình có độ hòa tan trong nước kém. Tốc độ hấp thu của polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA sau đó phụ thuộc vào tốc độ hòa tan của nó, do đó, có thể phụ thuộc vào kích thước tinh thể và dạng tinh thể. Theo cách khác, có thể đạt được sự hấp thu chậm của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA dùng qua đường tiêm truyền bằng cách hòa tan hoặc tạo huyền phù polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA trong chất dẫn dầu. Dạng dự trữ tiêm được tạo ra bằng cách tạo thành ma trận vi nang của polynucleotide, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA trong các polyme có khả năng phân hủy sinh học như polylactide-polyglycolit. Tùy thuộc vào tỷ lệ của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA với polyme và bản chất của polyme cụ thể được sử dụng, tốc độ polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc sự giải phóng mmRNA có thể được kiểm soát. Ví dụ về các polyme phân hủy sinh học khác bao gồm, nhưng không giới hạn ở poly(orthoesters) và poly(anhydrit). Các chế phẩm tiêm dự trữ có thể được bào chế bằng cách gắn polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA vào liposom hoặc vi nhũ tương tương thích với các mô cơ thể.
Phổi
Các chế phẩm được mô tả ở đây là hữu ích cho việc phân phối qua phổi cũng có thể được sử dụng để phân phối dược phẩm qua đường mũi. Một chế phẩm khác thích hợp để sử dụng qua đường mũi có thể là dạng bột thô chứa thành phần hoạt chất và có kích thước hạt trung bình từ khoảng 0,2 μm đến 500 μm. Công thức như vậy có thể được sử dụng theo cách hít thuốc hít, tức là hít nhanh qua đường mũi từ hộp chứa bột đặt gần mũi.
Ví dụ, các chế phẩm thích hợp để dùng qua đường mũi có thể chứa từ khoảng 0,1% (w/w) đến 100% (w/w) hoạt chất, và có thể chứa một hoặc nhiều thành phần bổ sung được mô tả ở đây. . Dược phẩm có thể được bào chế, đóng gói và/hoặc bán ở dạng chế phẩm thích hợp để dùng qua đường má. Ví dụ, các công thức này có thể ở dạng viên nén và/hoặc viên ngậm được bào chế bằng các phương pháp thông thường và có thể chứa khoảng 0,1% đến 20% (w/w) hoạt chất, trong đó lượng cân bằng có thể bao gồm dung dịch uống. chế phẩm hòa tan và/hoặc có thể phân hủy và, tùy ý, một hoặc nhiều thành phần bổ sung được mô tả ở đây. Theo cách khác, chế phẩm thích hợp để sử dụng qua đường miệng có thể chứa bột và/hoặc dung dịch khí dung và/hoặc nguyên tử hóa và/hoặc huyền phù chứa thành phần hoạt chất. Các chế phẩm dạng bột, được sol khí hóa và/hoặc được sol khí hóa như vậy, khi được phân tán, có thể có kích thước hạt và/hoặc giọt trung bình nằm trong khoảng từ khoảng 0,1 nm đến khoảng 200 nm, và có thể chứa thêm một hoặc nhiều thành phần bổ sung bất kỳ được mô tả ở đây.
Ví dụ, có thể tìm thấy những cân nhắc chung trong công thức và/hoặc sản xuất dược phẩm trong Remington: Khoa học và Thực hành Dược phẩm 21sted., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Lớp phủ hoặc vỏ
Các dạng liều rắn của viên nén, viên kéo, viên nang, viên tròn và hạt có thể được bào chế bằng các lớp phủ và vỏ như lớp phủ tan trong ruột và các lớp bao khác đã được biết rõ trong lĩnh vực bào chế dược phẩm. Chúng có thể tùy ý chứa chất cản quang và có thể là chế phẩm mà chúng chỉ giải phóng (các) thành phần hoạt chất, hoặc tốt hơn là, trong một phần nhất định của đường ruột, tùy ý, theo cách chậm. Ví dụ về các chế phẩm dạng nhúng có thể được sử dụng bao gồm các chất polyme và sáp. Chế phẩm rắn thuộc loại tương tự có thể được sử dụng làm chất độn trong viên nang gelatin mềm và cứng bằng cách sử dụng các tá dược như lactoza hoặc đường sữa cũng như polyetylen glycol có trọng lượng phân tử cao và tương tự.
Đặc tính của dược phẩm
Dược phẩm được mô tả ở đây có thể được đặc trưng bởi một hoặc nhiều khả năng sinh khả dụng, khoảng điều trị và/hoặc thể tích phân bố.
Sinh khả dụng
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA, khi được bào chế thành chế phẩm có chất phân phối như được mô tả ở đây, có thể thể hiện sự tăng sinh khả dụng so với chế phẩm không có chất phân phối như được mô tả ở đây. Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “sinh khả dụng” dùng để chỉ độ sẵn có toàn thân của lượng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA nhất định được sử dụng cho động vật có vú. Sinh khả dụng có thể được đánh giá bằng cách đo diện tích dưới đường cong (AUC) hoặc nồng độ tối đa trong huyết thanh hoặc huyết tương (Ctối đa) ở dạng không đổi của hợp chất sau khi cho động vật có vú sử dụng hợp chất này. AUC là phép xác định diện tích dưới đường cong, biểu thị nồng độ trong huyết thanh hoặc huyết tương của một hợp chất dọc theo trục tung (trục Y) theo thời gian dọc theo trục hoành (trục X). Nói chung, AUC của hợp chất cụ thể có thể được tính bằng cách sử dụng các phương pháp đã biết đối với những người có hiểu biết trung bình trong lĩnh vực này và như được mô tả trong G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, New York, Inc. , 1996, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Ctối đagiá trị là nồng độ tối đa của hợp chất đạt được trong huyết thanh hoặc huyết tương của động vật có vú sau khi sử dụng hợp chất này cho động vật có vú. Ctối đagiá trị của một hợp chất cụ thể có thể được đo bằng cách sử dụng các phương pháp đã biết đối với những người có hiểu biết trung bình trong lĩnh vực kỹ thuật này. Cụm từ “tăng sinh khả dụng” hoặc “cải thiện dược động học,” như được sử dụng ở đây có nghĩa là độ sẵn có toàn thân của polynucleotit thứ nhất, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA, được tính bằng AUC, Ctối đa, hoặc Cphútở động vật có vú khi được sử dụng đồng thời với chất phân phối như được mô tả ở đây sẽ lớn hơn so với khi không sử dụng đồng thời. Theo một số phương án, sinh khả dụng của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể tăng ít nhất khoảng 2%, ít nhất khoảng 5%, ít nhất khoảng 10%, ít nhất khoảng 15%, ít nhất khoảng 20%, ít nhất khoảng 25%, ít nhất khoảng 30%, ít nhất khoảng 35%, ít nhất khoảng 40%, ít nhất khoảng 45%, ít nhất khoảng 50%, ít nhất khoảng 55%, ít nhất khoảng 60%, ít nhất khoảng 65% , ít nhất khoảng 70%, ít nhất khoảng 75%, ít nhất khoảng 80%, ít nhất khoảng 85%, ít nhất khoảng 90%, ít nhất khoảng 95%, hoặc khoảng 100%.
Cửa sổ trị liệu
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA, khi được bào chế thành chế phẩm có chất phân phối như được mô tả ở đây, có thể thể hiện sự gia tăng khoảng thời gian điều trị của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc chế phẩm mmRNA được sử dụng so với khoảng thời gian điều trị của polynucleotit được sử dụng, cấu trúc bậc một hoặc chế phẩm mmARN thiếu tác nhân phân phối như được mô tả ở đây. Như được sử dụng ở đây, “cửa sổ điều trị” dùng để chỉ khoảng nồng độ trong huyết tương, hoặc khoảng nồng độ của hoạt chất điều trị tại vị trí tác dụng, với khả năng cao tạo ra hiệu quả điều trị. Theo một số phương án, khoảng điều trị của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA khi được sử dụng đồng thời với chất phân phối như được mô tả ở đây có thể tăng ít nhất khoảng 2%, ít nhất khoảng 5%, ít nhất khoảng 10%, ít nhất khoảng 15%, ít nhất khoảng 20%, ít nhất khoảng 25%, ít nhất khoảng 30%, ít nhất khoảng 35%, ít nhất khoảng 40%, ít nhất khoảng 45%, ít nhất khoảng 50%, ít nhất khoảng 55% , ít nhất khoảng 60%, ít nhất khoảng 65%, ít nhất khoảng 70%, ít nhất khoảng 75%, ít nhất khoảng 80%, ít nhất khoảng 85%, ít nhất khoảng 90%, ít nhất khoảng 95%, hoặc khoảng 100%.
Khối lượng phân phối
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA, khi được bào chế thành chế phẩm có chất phân phối như được mô tả ở đây, có thể thể hiện thể tích phân bố được cải thiện (Vquận), ví dụ, được giảm bớt hoặc nhắm mục tiêu, liên quan đến chế phẩm thiếu chất phân phối như được mô tả ở đây. Thể tích phân bố (Vdist) liên quan đến lượng thuốc trong cơ thể với nồng độ thuốc trong máu hoặc huyết tương. Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “thể tích phân bố” dùng để chỉ thể tích dịch cần thiết để chứa tổng lượng thuốc trong cơ thể ở cùng nồng độ như trong máu hoặc huyết tương: Vdist bằng lượng thuốc trong thể/nồng độ thuốc trong máu hoặc huyết tương. Ví dụ, với liều 10 mg và nồng độ trong huyết tương là 10 mg/L, thể tích phân bố sẽ là 1 lít. Thể tích phân bố phản ánh mức độ hiện diện của thuốc ở mô ngoại mạch. Thể tích phân bố lớn phản ánh xu hướng của hợp chất liên kết với các thành phần mô so với liên kết với protein huyết tương. Trong môi trường lâm sàng, Vdist có thể được sử dụng để xác định liều nạp nhằm đạt được nồng độ ở trạng thái ổn định. Theo một số phương án, thể tích phân bố của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA khi sử dụng đồng thời với chất phân phối như mô tả ở đây có thể giảm ít nhất khoảng 2%, ít nhất khoảng 5%, ít nhất khoảng 10%, ít nhất khoảng 15%, ít nhất khoảng 20%, ít nhất khoảng 25%, ít nhất khoảng 30%, ít nhất khoảng 35%, ít nhất khoảng 40%, ít nhất khoảng 45%, ít nhất khoảng 50%, ít nhất khoảng 55% , ít nhất khoảng 60%, ít nhất khoảng 65%, ít nhất khoảng 70%.
Tác dụng sinh học
Theo một phương án, tác dụng sinh học của mARN biến đổi được truyền vào động vật có thể được phân loại bằng cách phân tích sự biểu hiện protein ở động vật. Sự biểu hiện protein có thể được xác định bằng cách phân tích mẫu sinh học được thu thập từ động vật có vú được sử dụng mARN biến đổi theo sáng chế. Theo một phương án, protein biểu hiện được mã hóa bởi mARN biến đổi được sử dụng cho động vật có vú với lượng ít nhất là 50 pg/ml có thể được ưu tiên. Ví dụ, sự biểu hiện protein nằm trong khoảng 50-200 pg/ml đối với protein được mã hóa bởi mARN biến đổi được cung cấp cho động vật có vú có thể được coi là lượng protein có hiệu quả điều trị ở động vật có vú.
Phát hiện axit nucleic biến tính bằng phép đo khối phổ
Khối phổ (MS) là một kỹ thuật phân tích có thể cung cấp thông tin về cấu trúc và khối lượng phân tử/nồng độ trên các phân tử sau khi chúng chuyển đổi thành ion. Các phân tử đầu tiên được ion hóa để thu được điện tích dương hoặc âm, sau đó chúng di chuyển qua máy phân tích khối lượng để đến các khu vực khác nhau của máy dò theo tỷ lệ khối lượng/điện tích (m/z) của chúng.
Phép đo khối phổ được thực hiện bằng máy quang phổ khối bao gồm nguồn ion để ion hóa mẫu đã phân đoạn và tạo ra các phân tử tích điện để phân tích thêm. Ví dụ, quá trình ion hóa mẫu có thể được thực hiện bằng phương pháp ion hóa phun điện tử (ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI), quang ion hóa, ion hóa điện tử, bắn phá nguyên tử nhanh (FAB)/ion hóa thứ cấp chất lỏng (LSIMS), giải hấp/ion hóa bằng laser ma trận ( MALDI), ion hóa trường, giải hấp trường, ion hóa phun nhiệt/phun plasma và ion hóa chùm hạt. Người nghệ nhân lành nghề sẽ hiểu rằng việc lựa chọn phương pháp ion hóa có thể được xác định dựa trên chất phân tích cần đo, loại mẫu, loại máy dò, lựa chọn chế độ dương tính hay âm tính, v.v.
Sau khi mẫu bị ion hóa, các ion tích điện dương hoặc âm do đó tạo ra có thể được phân tích để xác định tỷ lệ khối lượng trên điện tích (tức là m/z). Các máy phân tích thích hợp để xác định tỷ lệ khối lượng trên điện tích bao gồm máy phân tích tứ cực, máy phân tích bẫy ion và máy phân tích thời gian bay. Các ion có thể được phát hiện bằng một số chế độ phát hiện. Ví dụ: các ion đã chọn có thể được phát hiện (tức là sử dụng chế độ giám sát ion chọn lọc (SIM)) hoặc cách khác, các ion có thể được phát hiện bằng chế độ quét, ví dụ: giám sát nhiều phản ứng (MRM) hoặc giám sát phản ứng đã chọn (SRM).
Giám sát sắc ký lỏng-đa phản ứng (LC-MS/MRM) kết hợp với pha loãng đồng vị ổn định được dán nhãn của các tiêu chuẩn peptide đã được chứng minh là một phương pháp hiệu quả để xác minh protein (ví dụ, Keshishian và cộng sự, Mol Cell Proteomics 2009 8: 2339-2349 ; Kuhn và cộng sự, Clin Chem 2009 55:1108-1117; Lopez và cộng sự, Clin Chem 2010 56:281-290; mỗi nội dung trong số đó đều được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ). Không giống như phép đo khối phổ không nhắm mục tiêu thường được sử dụng trong các nghiên cứu khám phá dấu ấn sinh học, phương pháp MS nhắm mục tiêu là các chế độ dựa trên chuỗi peptide của MS tập trung toàn bộ khả năng phân tích của thiết bị vào hàng chục đến hàng trăm peptide được chọn trong một hỗn hợp phức tạp. Bằng cách hạn chế phát hiện và phân mảnh chỉ những peptide có nguồn gốc từ protein quan tâm, độ nhạy và khả năng tái tạo được cải thiện đáng kể so với các phương pháp MS ở chế độ khám phá. Phương pháp định lượng protein theo dõi đa phản ứng (MRM) dựa trên khối phổ này có thể tác động đáng kể đến việc phát hiện và định lượng các dấu ấn sinh học thông qua hồ sơ biểu hiện protein đa dạng, nhắm mục tiêu, nhanh chóng của các mẫu lâm sàng.
Theo một phương án, mẫu sinh học có thể chứa ít nhất một protein được mã hóa bởi ít nhất một mARN biến đổi theo sáng chế có thể được phân tích bằng phương pháp MRM-MS. Việc định lượng mẫu sinh học có thể bao gồm thêm nhưng không giới hạn ở các peptit hoặc protein được đánh dấu đồng vị làm chất chuẩn nội.
Theo sáng chế, mẫu sinh học, sau khi được lấy từ đối tượng, có thể được tiêu hóa bằng enzyme. Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “phân hủy” có nghĩa là phân tách thành các peptit ngắn hơn. Như được sử dụng ở đây, cụm từ “xử lý mẫu để phân hủy protein” có nghĩa là thao tác với mẫu theo cách để phân hủy protein trong mẫu. Những enzym này bao gồm nhưng không giới hạn ở trypsin, endoproteinase Glu-C và chymotrypsin. Theo một phương án, mẫu sinh học có thể chứa ít nhất một protein được mã hóa bởi ít nhất một mARN biến đổi theo sáng chế có thể được tiêu hóa bằng cách sử dụng enzym.
Theo một phương án, mẫu sinh học có thể chứa protein được mã hóa bởi mARN biến đổi theo sáng chế có thể được phân tích protein bằng phương pháp ion hóa phun điện. Phép đo khối phổ ion hóa phun điện tử (ESI) (ESIMS) sử dụng năng lượng điện để hỗ trợ chuyển các ion từ dung dịch sang pha khí trước khi chúng được phân tích bằng phép đo phổ khối. Các mẫu có thể được phân tích bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này (ví dụ, Ho và cộng sự, Clin Biochem Rev. 2003 24(1):3-12; ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Các loại ion có trong dung dịch có thể được chuyển sang pha khí bằng cách phân tán các giọt điện tích phun mịn, làm bay hơi dung môi và đẩy các ion ra khỏi các giọt tích điện để tạo ra sương mù gồm các giọt tích điện cao. Sương mù của các giọt tích điện cao có thể được phân tích bằng cách sử dụng ít nhất 1, ít nhất 2, ít nhất 3 hoặc ít nhất 4 máy phân tích khối lượng, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, máy phân tích khối lượng bốn cực. Hơn nữa, phương pháp đo phổ khối có thể bao gồm bước tinh chế. Là một ví dụ không giới hạn, tứ cực thứ nhất có thể được thiết lập để chọn một tỷ lệ m/z duy nhất để nó có thể lọc ra các ion phân tử khác có tỷ lệ m/z khác, điều này có thể loại bỏ các quy trình tinh chế mẫu phức tạp và tốn thời gian trước MS Phân tích.
Theo một phương án, mẫu sinh học có thể chứa protein được mã hóa bởi mARN biến đổi theo sáng chế có thể được phân tích để tìm protein trong hệ thống ESIMS song song (ví dụ, MS/MS). Là các ví dụ không giới hạn, các giọt có thể được phân tích bằng cách sử dụng lần quét sản phẩm (hoặc lần quét con), lần quét tiền thân (quét gốc) sự mất trung tính hoặc theo dõi nhiều phản ứng.
Theo một phương án, mẫu sinh học có thể chứa protein được mã hóa bởi mARN biến đổi theo sáng chế có thể được phân tích bằng phương pháp quang phổ khối ion hóa/khử hấp thụ/ion hóa bằng tia laser được hỗ trợ bằng ma trận (MALDI) (MALDIMS). MALDI cung cấp khả năng bay hơi và ion hóa không phá hủy của cả phân tử lớn và nhỏ, chẳng hạn như protein. Trong phân tích MALDI, chất phân tích trước tiên được kết tinh với một lượng lớn mol dư của hợp chất nền, chất này cũng có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, axit hữu cơ yếu hấp thụ tia cực tím. Ví dụ không giới hạn về chất nền được sử dụng trong MALDI là axit α-cyano-4-hydroxycinnamic, axit 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic và axit 2,5-dihydroxybenzoic. Bức xạ laser của hỗn hợp chất phân tích-ma trận có thể làm bay hơi nền và chất phân tích. Quá trình giải hấp do laser gây ra mang lại hiệu suất ion cao của chất phân tích nguyên vẹn và cho phép đo các hợp chất với độ chính xác cao. Các mẫu có thể được phân tích bằng cách sử dụng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này (ví dụ, Lewis, Wei và Siuzdak, Bách khoa toàn thư về hóa học phân tích 2000:5880-5894; ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Như các ví dụ không giới hạn, máy phân tích khối lượng được sử dụng trong phân tích MALDI có thể bao gồm máy phân tích thời gian bay tuyến tính (TOF), máy phản xạ TOF hoặc máy phân tích khối lượng biến đổi Fourier.
Theo một phương án, hỗn hợp chất phân tích-ma trận có thể được tạo thành bằng phương pháp giọt khô. Một mẫu sinh học được trộn với nền để tạo ra dung dịch nền bão hòa trong đó tỷ lệ nền trên mẫu xấp xỉ 5000:1. Sau đó, một lượng nhỏ (khoảng 0,5-2,0 uL) dung dịch nền bão hòa được để khô để tạo thành hỗn hợp chất phân tích-ma trận.
Theo một phương án, hỗn hợp chất phân tích-ma trận có thể được tạo ra bằng phương pháp lớp mỏng. Một màng đồng nhất nền mẫu đầu tiên được hình thành, sau đó mẫu được đưa vào và có thể được nền nền hấp thụ để tạo thành hỗn hợp chất phân tích-ma trận.
Theo một phương án, hỗn hợp chất phân tích-ma trận có thể được tạo thành bằng phương pháp lớp dày. Một màng đồng nhất ma trận được hình thành với chất phụ gia ma trận nitro-cellulose. Sau khi thu được lớp nền nitro-cellulose đồng nhất, mẫu sẽ được đưa vào và hấp thụ vào nền để tạo thành hỗn hợp chất phân tích-ma trận.
Theo một phương án, hỗn hợp chất phân tích-ma trận có thể được tạo ra bằng phương pháp kẹp. Một lớp mỏng tinh thể nền được chuẩn bị như trong phương pháp lớp mỏng, sau đó thêm các giọt dung dịch axit trifloaxetic, mẫu và nền. Sau đó, mẫu được hấp thụ vào nền để tạo thành hỗn hợp chất phân tích-ma trận.
V. Công dụng của Polynucleotit, cấu trúc sơ cấp và mmRNA của sáng chế
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA theo sáng chế được thiết kế, theo các phương án ưu tiên, nhằm giúp tránh hoặc tránh các phản ứng sinh học có hại như phản ứng miễn dịch và/hoặc con đường thoái hóa, vượt qua ngưỡng biểu hiện và/hoặc cải thiện protein. năng lực sản xuất, tốc độ biểu hiện hoặc hiệu quả dịch mã được cải thiện, thời gian bán hủy và/hoặc nồng độ protein và/hoặc thuốc hoặc protein được cải thiện, định vị protein được tối ưu hóa, để cải thiện một hoặc nhiều tính ổn định và/hoặc độ thanh thải trong mô, sự hấp thu và/hoặc động học của thụ thể, khả năng tiếp cận tế bào bởi các chế phẩm, sự tham gia của cơ chế dịch mã, hiệu quả bài tiết (nếu có), khả năng lưu thông và/hoặc điều hòa trạng thái, chức năng và/hoặc hoạt động của tế bào.
trị liệu Đại lý trị liệu
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế, chẳng hạn như axit nucleic biến đổi và ARN biến đổi, và các protein được dịch mã từ chúng được mô tả ở đây có thể được sử dụng làm tác nhân điều trị hoặc phòng bệnh. Chúng được cung cấp để sử dụng trong y học. Ví dụ, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được mô tả ở đây có thể được sử dụng cho đối tượng, trong đó polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA này được dịch mã in vivo để tạo ra polypeptit điều trị hoặc phòng bệnh ở đối tượng. Sáng chế đề xuất chế phẩm, phương pháp, bộ dụng cụ và thuốc thử để chẩn đoán, điều trị hoặc phòng ngừa bệnh hoặc tình trạng ở người và động vật có vú khác. Tác nhân điều trị tích cực theo sáng chế bao gồm polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA, tế bào chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA hoặc polypeptit được dịch mã từ polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA.
Theo các phương án nhất định, sáng chế đề xuất phương pháp điều trị kết hợp chứa một hoặc nhiều polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA chứa các vùng dịch mã mã hóa cho protein hoặc các protein làm tăng khả năng miễn dịch của đối tượng động vật có vú cùng với protein gây ra độc tính tế bào phụ thuộc vào kháng thể. Ví dụ, sáng chế đề xuất phương pháp điều trị chứa một hoặc nhiều axit nucleic mã hóa trastuzumab và yếu tố kích thích cụm bạch cầu hạt (G-CSF). Đặc biệt, phương pháp điều trị kết hợp như vậy rất hữu ích ở những bệnh nhân ung thư vú Her2+ phát triển khả năng kháng trastuzumab. (Xem, ví dụ, Albrecht, Liệu pháp miễn dịch. 2(6):795-8 (2010)).
Sáng chế đề xuất phương pháp tạo ra sự dịch mã polypeptit tái tổ hợp trong quần thể tế bào bằng cách sử dụng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được mô tả ở đây. Sự dịch mã như vậy có thể là in vivo, ex vivo, trong nuôi cấy hoặc in vitro. Quần thể tế bào được cho tiếp xúc với lượng hữu hiệu của chế phẩm chứa axit nucleic có ít nhất một biến đổi nucleoside, và vùng có thể dịch mã mã hóa polypeptit tái tổ hợp. Quần thể được tiếp xúc trong các điều kiện sao cho axit nucleic được định vị vào một hoặc nhiều tế bào của quần thể tế bào và polypeptide tái tổ hợp được dịch mã từ axit nucleic vào tế bào.
“Lượng hữu hiệu” của chế phẩm này được đề xuất dựa trên, ít nhất một phần, dựa trên mô đích, loại tế bào đích, phương tiện sử dụng, các đặc tính vật lý của axit nucleic (ví dụ, kích thước và mức độ của nucleoside biến đổi), và các đặc điểm khác yếu tố quyết định. Nói chung, lượng hữu hiệu của chế phẩm mang lại khả năng sản xuất protein hiệu quả trong tế bào, tốt hơn là hiệu quả hơn chế phẩm chứa axit nucleic không biến đổi tương ứng. Hiệu quả tăng lên có thể được chứng minh bằng cách tăng sự chuyển hóa tế bào (tức là tỷ lệ tế bào được chuyển hóa bằng axit nucleic), tăng dịch mã protein từ axit nucleic, giảm sự phân hủy axit nucleic (như đã được chứng minh, ví dụ, bằng cách tăng thời gian dịch mã protein từ một gen đã được biến đổi). axit nucleic), hoặc giảm đáp ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào chủ.
Các khía cạnh của sáng chế đề cập đến phương pháp tạo ra sự dịch mã in vivo của polypeptit tái tổ hợp ở đối tượng động vật có vú cần điều đó. Trong đó, lượng hữu hiệu của chế phẩm chứa axit nucleic có ít nhất một biến đổi cấu trúc hoặc hóa học và vùng có thể dịch mã mã hóa polypeptit tái tổ hợp được sử dụng cho đối tượng bằng cách sử dụng các phương pháp phân phối được mô tả ở đây. Axit nucleic được cung cấp với lượng và trong các điều kiện khác sao cho axit nucleic được định vị vào tế bào của đối tượng và polypeptit tái tổ hợp được dịch mã từ axit nucleic vào tế bào. Tế bào trong đó axit nucleic được định vị hoặc mô chứa tế bào có thể được nhắm mục tiêu bằng một hoặc nhiều đợt sử dụng axit nucleic.
Theo các phương án nhất định, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được sử dụng sẽ điều khiển quá trình sản xuất một hoặc nhiều polypeptit tái tổ hợp mang lại hoạt tính chức năng mà về cơ bản không có trong tế bào, mô hoặc sinh vật trong đó polypeptit tái tổ hợp được dịch mã. Ví dụ, hoạt động chức năng bị thiếu có thể là do enzyme, cấu trúc hoặc gen điều hòa về bản chất. Theo các phương án liên quan, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được sử dụng sẽ điều khiển quá trình sản xuất một hoặc nhiều polypeptit tái tổ hợp làm tăng (ví dụ, hiệp đồng) hoạt động chức năng hiện diện nhưng về cơ bản bị thiếu hụt trong tế bào mà polypeptit tái tổ hợp được dịch mã.
Theo các phương án khác, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được sử dụng sẽ chỉ đạo sản xuất một hoặc nhiều polypeptit tái tổ hợp thay thế polypeptit (hoặc nhiều polypeptit) mà về cơ bản không có trong tế bào mà polypeptit tái tổ hợp được dịch mã. Sự vắng mặt như vậy có thể là do đột biến gen của gen mã hóa hoặc con đường điều hòa của nó. Theo một số phương án, polypeptit tái tổ hợp làm tăng mức protein nội sinh trong tế bào đến mức mong muốn; sự gia tăng như vậy có thể đưa mức protein nội sinh từ mức dưới bình thường lên mức bình thường hoặc từ mức bình thường đến mức siêu bình thường.
Ngoài ra, polypeptit tái tổ hợp có chức năng đối kháng hoạt động của protein nội sinh có trong, trên bề mặt hoặc được tiết ra từ tế bào. Thông thường, hoạt động của protein nội sinh có hại cho đối tượng; ví dụ, do đột biến protein nội sinh dẫn đến thay đổi hoạt động hoặc nội địa hóa. Ngoài ra, polypeptit tái tổ hợp đối kháng, trực tiếp hoặc gián tiếp, hoạt động của gốc sinh học có trong, trên bề mặt hoặc được tiết ra từ tế bào. Ví dụ về các gốc sinh học đối kháng bao gồm lipid (ví dụ: cholesterol), lipoprotein (ví dụ: lipoprotein mật độ thấp), axit nucleic, carbohydrate, độc tố protein như độc tố shiga và uốn ván, hoặc độc tố phân tử nhỏ như botulinum, dịch tả và độc tố bạch hầu. Ngoài ra, phân tử sinh học đối kháng có thể là protein nội sinh có hoạt tính không mong muốn, chẳng hạn như hoạt tính gây độc tế bào hoặc kìm tế bào.
Các protein tái tổ hợp được mô tả ở đây có thể được thao tác di truyền để định vị bên trong tế bào, có khả năng nằm trong một ngăn cụ thể như nhân, hoặc được thao tác di truyền để bài tiết từ tế bào hoặc chuyển vị trí sang màng sinh chất của tế bào.
Theo một số phương án, các mARN biến đổi và các polypeptit được mã hóa của chúng theo sáng chế có thể được sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng bất kỳ, bao gồm nhưng không giới hạn ở một hoặc nhiều tình trạng sau: rối loạn tự miễn dịch (ví dụ: bệnh tiểu đường, bệnh lupus, bệnh đa xơ cứng, bệnh vẩy nến, viêm khớp dạng thấp); rối loạn viêm (ví dụ viêm khớp, bệnh viêm vùng chậu); các bệnh truyền nhiễm (ví dụ: nhiễm virus (ví dụ: HIV, HCV, RSV), nhiễm trùng do vi khuẩn, nhiễm nấm, nhiễm trùng huyết); rối loạn thần kinh (ví dụ bệnh Alzheimer, bệnh Huntington, chứng tự kỷ, chứng loạn dưỡng cơ duch*enne); rối loạn tim mạch (ví dụ như xơ vữa động mạch, tăng cholesterol máu, huyết khối, rối loạn đông máu, rối loạn tạo mạch như thoái hóa điểm vàng); rối loạn tăng sinh (ví dụ như ung thư, u lành tính); rối loạn hô hấp (ví dụ bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính); rối loạn tiêu hóa (ví dụ bệnh viêm ruột, loét); rối loạn cơ xương (ví dụ đau cơ xơ hóa, viêm khớp); rối loạn nội tiết, chuyển hóa và dinh dưỡng (ví dụ như tiểu đường, loãng xương); rối loạn tiết niệu (ví dụ bệnh thận); rối loạn tâm lý (ví dụ trầm cảm, tâm thần phân liệt); rối loạn về da (ví dụ như vết thương, bệnh chàm); rối loạn máu và bạch huyết (ví dụ như thiếu máu, bệnh máu khó đông); vân vân.
Các bệnh được đặc trưng bởi hoạt động rối loạn chức năng hoặc bất thường của protein bao gồm xơ nang, thiếu máu hồng cầu hình liềm, bong biểu bì bóng nước, xơ cứng teo cơ một bên và thiếu hụt glucose-6-phosphate dehydrogenase. Sáng chế đề xuất phương pháp điều trị các tình trạng hoặc bệnh như vậy ở đối tượng bằng cách đưa vào phương pháp điều trị dựa trên tế bào hoặc axit nucleic có chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được đề xuất ở đây, trong đó polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA mã hóa cho protein đối kháng hoặc mặt khác khắc phục được hoạt động bất thường của protein có trong tế bào của đối tượng. Ví dụ cụ thể về protein rối loạn chức năng là các biến thể đột biến nghĩa của gen điều hòa dẫn truyền màng xơ nang (CFTR), gen này tạo ra biến thể protein rối loạn chức năng của protein CFTR, gây ra bệnh xơ nang.
Các bệnh có đặc điểm là thiếu (hoặc giảm đáng kể đến mức hoạt động của protein thích hợp (chức năng bình thường hoặc sinh lý của protein không xảy ra) bao gồm xơ nang, Niemann-Pick loại C, R thalassemia thể nặng, loạn dưỡng cơ duch*enne, Hội chứng Hurler, Hội chứng Hunter và Hemophilia A Các protein này có thể không có mặt hoặc về cơ bản là không có chức năng. Sáng chế đề xuất phương pháp điều trị các tình trạng hoặc bệnh như vậy ở đối tượng bằng cách đưa axit nucleic hoặc liệu pháp điều trị dựa trên tế bào chứa polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA được đề xuất ở đây, trong đó polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA mã hóa cho protein thay thế hoạt tính của protein bị thiếu trong các tế bào đích của đối tượng là các biến thể đột biến vô nghĩa của gen điều hòa dẫn truyền màng xơ nang (CFTR), mà gen này. tạo ra một biến thể protein không có chức năng của protein CFTR, gây ra bệnh xơ nang.
Do đó, sáng chế đề xuất các phương pháp điều trị bệnh xơ nang ở đối tượng động vật có vú bằng cách cho tế bào của đối tượng này tiếp xúc với polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có vùng dịch mã mã hóa polypeptit CFTR chức năng, trong các điều kiện sao cho lượng hữu hiệu của polypeptit CTFR có mặt trong tế bào. Các tế bào đích được ưu tiên là các tế bào biểu mô, nội mô và trung mô, chẳng hạn như phổi, và các phương pháp sử dụng được xác định dựa trên mô đích; tức là, để phân phối vào phổi, các phân tử RNA được tạo ra để sử dụng bằng đường hô hấp.
Theo một phương án khác, sáng chế đề xuất phương pháp điều trị bệnh mỡ máu cao ở đối tượng, bằng cách đưa phân tử mARN biến đổi mã hóa Sortilin vào quần thể tế bào của đối tượng, một loại protein gần đây được đặc trưng bởi các nghiên cứu về gen, nhờ đó cải thiện tình trạng tăng lipid máu ở đối tượng. Gen SORT1 mã hóa protein xuyên màng mạng Golgi (TGN) được gọi là Sortilin. Các nghiên cứu di truyền đã chỉ ra rằng một trong năm cá thể có một đa hình nucleotide đơn, rs12740374, ở locus 1p13 của gen SORT1 khiến họ có hàm lượng lipoprotein mật độ thấp (LDL) và lipoprotein mật độ rất thấp (VLDL) ở mức thấp. . Mỗi bản sao của alen thứ yếu, hiện diện ở khoảng 30% dân số, làm thay đổi cholesterol LDL khoảng 8 mg/dL, trong khi hai bản sao của alen thứ yếu, hiện diện ở khoảng 5% dân số, làm giảm cholesterol LDL 16 mg/dL. Những người mang alen thứ yếu cũng đã được chứng minh là giảm 40% nguy cơ nhồi máu cơ tim. Các nghiên cứu chức năng in vivo ở chuột mô tả rằng sự biểu hiện quá mức của SORT1 trong mô gan chuột đã dẫn đến mức LDL-cholesterol thấp hơn đáng kể, thấp hơn tới 80% và việc SORT1 im lặng đã làm tăng cholesterol LDL khoảng 200% (Musunuru K và cộng sự. Từ biến thể không mã hóa đến kiểu hình thông qua SORT1 tại locus cholesterol 1p13 Nature 2010;
Theo một phương án khác, sáng chế đề xuất phương pháp điều trị các rối loạn tạo máu, bệnh tim mạch, ung thư, tiểu đường, xơ nang, các bệnh về thần kinh, các lỗi chuyển hóa bẩm sinh, các rối loạn về da và hệ thống, và chứng mù lòa. Danh tính của các mục tiêu phân tử để điều trị các bệnh cụ thể này đã được mô tả (Templeton ed., Liệu pháp gen và tế bào: Cơ chế và chiến lược trị liệu, 3thứPhiên bản, Bota Raton, FL:CRC Press; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Sáng chế đề cập đến các phương pháp ngăn ngừa nhiễm trùng và/hoặc nhiễm trùng huyết ở đối tượng có nguy cơ phát triển nhiễm trùng và/hoặc nhiễm trùng huyết, phương pháp này bao gồm việc sử dụng cho đối tượng cần được phòng ngừa như vậy chế phẩm chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc tiền chất mmRNA mã hóa polypeptit kháng khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn), hoặc dạng được xử lý một phần hoặc toàn bộ của nó với lượng đủ để ngăn ngừa nhiễm trùng và/hoặc nhiễm trùng huyết. Theo các phương án nhất định, đối tượng có nguy cơ bị nhiễm trùng và/hoặc nhiễm trùng huyết có thể là bệnh nhân ung thư. Theo các phương án nhất định, bệnh nhân ung thư có thể đã trải qua phác đồ điều hòa. Theo một số phương án, phác đồ điều hòa có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, hóa trị, xạ trị, hoặc cả hai. Là một ví dụ không giới hạn, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể mã hóa Protein C, zymogen hoặc tiền protein của nó, dạng hoạt hóa của Protein C (APC) hoặc các biến thể của Protein C đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Các polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA có thể được biến đổi về mặt hóa học và đưa vào tế bào. Các ví dụ không giới hạn về polypeptit có thể được mã hóa trong các mARN đã biến đổi về mặt hóa học theo sáng chế bao gồm những ví dụ được dạy trong US Pat. số 7.226.999; 7.498.305; 6.630.138, mỗi phần trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Các bằng sáng chế này dạy về các phân tử, biến thể và dẫn xuất giống Protein C, bất kỳ chất nào trong số đó có thể được mã hóa trong các phân tử được biến đổi về mặt hóa học theo sáng chế.
Ngoài ra, sáng chế còn đề cập đến các phương pháp điều trị bệnh nhiễm trùng và/hoặc nhiễm trùng huyết ở đối tượng, phương pháp này bao gồm việc cấp cho đối tượng cần được điều trị như vậy chế phẩm chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc tiền chất mmRNA mã hóa polypeptit kháng vi khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn), ví dụ, polypeptit kháng khuẩn được mô tả ở đây, hoặc dạng được xử lý một phần hoặc toàn bộ của nó với lượng đủ để điều trị nhiễm trùng và/hoặc nhiễm trùng huyết. Theo một số phương án nhất định, đối tượng cần điều trị là bệnh nhân ung thư. Theo các phương án nhất định, bệnh nhân ung thư đã trải qua phác đồ điều hòa. Theo một số phương án, phác đồ điều hòa có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, hóa trị, xạ trị, hoặc cả hai.
Theo một số phương án nhất định, đối tượng có thể biểu hiện tình trạng nhiễm vi khuẩn cấp tính hoặc mãn tính (ví dụ, nhiễm trùng do vi khuẩn). Theo các phương án nhất định, đối tượng có thể đã nhận được hoặc có thể đang nhận được liệu pháp điều trị. Theo các phương án nhất định, liệu pháp này có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, xạ trị, hóa trị, steroid, bức xạ tia cực tím, hoặc sự kết hợp của chúng. Theo một số phương án nhất định, bệnh nhân có thể mắc chứng rối loạn vi mạch. Theo một số phương án, rối loạn vi mạch có thể là bệnh tiểu đường. Trong một số phương án nhất định, bệnh nhân có thể có vết thương. Theo một số phương án, vết thương có thể là vết loét. Theo một phương án cụ thể, vết thương có thể là vết loét bàn chân do đái tháo đường. Theo một số phương án nhất định, đối tượng có thể có một hoặc nhiều vết thương do bỏng. Theo các phương án nhất định, việc sử dụng có thể là cục bộ hoặc toàn thân. Theo một số phương án nhất định, việc sử dụng có thể là tiêm dưới da. Theo các phương án nhất định, việc sử dụng có thể được tiêm vào tĩnh mạch. Theo các phương án nhất định, việc sử dụng có thể bằng đường uống. Theo các phương án nhất định, việc sử dụng có thể có tác dụng tại chỗ. Theo một số phương án nhất định, việc sử dụng có thể bằng đường hô hấp. Theo một số phương án nhất định, việc sử dụng có thể là trực tràng. Theo một số phương án nhất định, việc sử dụng có thể là qua đường âm đạo.
Các khía cạnh khác của sáng chế đề cập đến việc cấy ghép các tế bào chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA cho đối tượng là động vật có vú. Việc sử dụng tế bào cho các đối tượng động vật có vú đã được biết đến bởi những người có hiểu biết trung bình trong lĩnh vực này và bao gồm, nhưng không giới hạn ở việc cấy cục bộ (ví dụ, tiêm tại chỗ hoặc dưới da), truyền nội tạng hoặc tiêm toàn thân (ví dụ, tiêm tĩnh mạch hoặc hít) và sự hình thành các tế bào trong chất mang dược dụng. Các chế phẩm này chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA có thể được bào chế để sử dụng qua đường tiêm bắp, qua đường động mạch, trong màng bụng, trong tĩnh mạch, trong mũi, dưới da, qua nội soi, qua da hoặc trong vỏ. Theo một số phương án, chế phẩm này có thể được bào chế để giải phóng kéo dài.
Đối tượng được sử dụng tác nhân trị liệu đang mắc phải hoặc có thể có nguy cơ mắc bệnh, rối loạn hoặc tình trạng có hại. Sáng chế đề xuất các phương pháp xác định, chẩn đoán và phân loại đối tượng dựa trên các cơ sở này, có thể bao gồm chẩn đoán lâm sàng, mức dấu ấn sinh học, nghiên cứu liên quan trên toàn bộ gen (GWAS), và các phương pháp khác đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này.
Quản lý vết thương
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được sử dụng để điều trị vết thương, ví dụ: của những vết thương có biểu hiện chậm lành. Sáng chế đề xuất phương pháp bao gồm sử dụng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA để điều trị việc điều trị vết thương. Các phương pháp ở đây còn có thể bao gồm các bước được thực hiện trước, đồng thời hoặc sau khi sử dụng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN. Ví dụ, giường vết thương có thể cần phải được làm sạch và chuẩn bị để tạo điều kiện cho vết thương mau lành và hy vọng vết thương sẽ đóng lại. Một số chiến lược có thể được sử dụng để thúc đẩy quá trình lành vết thương và đạt được sự đóng vết thương, bao gồm nhưng không giới hạn ở: (i) cắt bỏ, lặp lại tùy ý, cắt bỏ bằng dao sắc (phẫu thuật loại bỏ mô chết hoặc bị nhiễm trùng khỏi vết thương), tùy chọn bao gồm các chất hóa học để loại bỏ mảnh vụn , chẳng hạn như enzyme, để loại bỏ mô hoại tử; (ii) băng vết thương để cung cấp cho vết thương một môi trường ẩm ướt, ấm áp và thúc đẩy quá trình phục hồi và chữa lành mô.
Ví dụ về các vật liệu được sử dụng trong công thức băng vết thương bao gồm, nhưng không giới hạn ở: hydrogel (ví dụ: AQUASORB®; DUODERM®), hydrocolloids (ví dụ: AQUACEL®; COMFEEL®), bọt (ví dụ: LYOFOAM®; SPYROSORB®) và alginate (ví dụ, ALGISITE®; CURASORB®); (iii) các yếu tố tăng trưởng bổ sung để kích thích sự phân chia và tăng sinh tế bào và thúc đẩy quá trình lành vết thương, ví dụ như vết thương. becaplermin (REGRANEX GEL®), một yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu tái tổ hợp ở người được FDA chấp thuận để điều trị loét bàn chân do bệnh lý thần kinh; (iv) che phủ vết thương bằng mô mềm, có thể cần phải ghép da để che phủ những vết thương sạch, không lành. Ví dụ về ghép da có thể được sử dụng để che phủ mô mềm bao gồm, nhưng không giới hạn ở: ghép da tự thân, ghép da chết, chất thay thế da công nghệ sinh học (ví dụ: APLIGRAF®; DERMAGRAFT®).
Theo các phương án nhất định, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế còn có thể bao gồm hydrogel (ví dụ, AQUASORB®; DUODERM®), hydrocoloid (ví dụ, AQUACEL®; COMFEEL®), bọt (ví dụ, LYOFOAM®; SPYROSORB®) và/hoặc alginate (ví dụ: ALGISITE®; CURASORB®). Theo các phương án nhất định, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được sử dụng cùng với mảnh ghép da bao gồm, nhưng không giới hạn ở, mảnh ghép da tự thân, mảnh ghép da chết hoặc chất thay thế da được xử lý sinh học (ví dụ, APLIGRAF®; DERMAGRAFT®). Theo một số phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được sử dụng cùng với các chế phẩm pha lọc và/hoặc ghép da hoặc chúng có thể được sử dụng riêng rẽ nhưng không giới hạn ở các phương pháp như, ngâm hoặc phun.
Theo một số phương án, chế phẩm dùng để kiểm soát vết thương có thể bao gồm polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mã hóa mmRNA cho polypeptit kháng vi khuẩn (ví dụ, polypeptit kháng khuẩn) và/hoặc polypeptit kháng vi-rút. Tiền chất hoặc dạng được xử lý một phần hoặc toàn bộ của polypeptit kháng vi khuẩn có thể được mã hóa. Chế phẩm này có thể được bào chế để sử dụng bằng cách sử dụng băng (ví dụ, băng dính). Polypeptit kháng vi khuẩn và/hoặc polypeptit kháng vi-rút có thể được trộn lẫn với chế phẩm băng bó hoặc có thể được sử dụng riêng biệt, ví dụ, bằng cách ngâm hoặc phun.
Sản xuất kháng thể
Theo một phương án của sáng chế, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể mã hóa kháng thể và đoạn của kháng thể này. Chúng có thể được tạo ra bằng phương pháp bất kỳ trong số các phương pháp được mô tả ở đây. Các kháng thể này có thể thuộc bất kỳ phân lớp hoặc isotype khác nhau của globulin miễn dịch, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, IgA, IgG, hoặc IgM, hoặc bất kỳ phân lớp nào khác. Các phân tử và đoạn kháng thể ví dụ có thể được bào chế theo sáng chế bao gồm, nhưng không giới hạn ở, các phân tử globulin miễn dịch, các phân tử globulin miễn dịch về cơ bản còn nguyên vẹn và các phần của phân tử globulin miễn dịch có thể chứa paratope. Phần kháng thể chứa paratope bao gồm, nhưng không giới hạn ở Fab, Fab′, F(ab′)2, F(v) và những phần đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này.
Polynucleotit theo sáng chế có thể mã hóa các polypeptit kháng thể biến thể mà có thể có tính đồng nhất nhất định với trình tự polypeptit tham chiếu, hoặc có đặc tính liên kết tương tự hoặc khác với trình tự polypeptit tham chiếu.
Các kháng thể thu được bằng các phương pháp theo sáng chế có thể là kháng thể khảm bao gồm (các) trình tự vùng biến đổi có nguồn gốc từ kháng thể không phải của người, có nguồn gốc từ động vật được gây miễn dịch, và (các) trình tự vùng cố định có nguồn gốc từ kháng thể của con người. Ngoài ra, chúng cũng có thể là kháng thể được làm tương thích với người bao gồm các vùng xác định bổ sung (CDR) của kháng thể không phải của người có nguồn gốc từ động vật được gây miễn dịch và các vùng khung (FR) và các vùng cố định có nguồn gốc từ kháng thể của người. Theo một phương án khác, các phương pháp được đề xuất ở đây có thể hữu ích để tăng hiệu suất sản phẩm protein kháng thể trong quy trình nuôi cấy tế bào.
Kiểm soát nhiễm trùng
Theo một phương án, sáng chế đề xuất các phương pháp điều trị hoặc ngăn ngừa sự nhiễm trùng vi khuẩn (ví dụ, nhiễm trùng do vi khuẩn) và/hoặc bệnh, rối loạn hoặc tình trạng liên quan đến nhiễm trùng do vi khuẩn hoặc vi rút, hoặc triệu chứng của nó, ở đối tượng, bằng cách sử dụng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA mã hóa polypeptit kháng vi khuẩn. Việc sử dụng này có thể được kết hợp với chất chống vi khuẩn (ví dụ, chất chống vi khuẩn), ví dụ, polypeptit kháng vi khuẩn hoặc hợp chất kháng vi khuẩn phân tử nhỏ được mô tả ở đây. Chất chống vi khuẩn bao gồm, nhưng không giới hạn ở, chất chống vi khuẩn, chất chống vi-rút, chất chống nấm, chất chống động vật nguyên sinh, chất chống ký sinh trùng, và chất chống prion.
Các chất này có thể được sử dụng đồng thời, ví dụ ở dạng liều đơn vị kết hợp (ví dụ, cung cấp sự phân phối đồng thời cả hai chất). Các tác nhân này cũng có thể được sử dụng ở khoảng thời gian xác định, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở khoảng thời gian tính bằng phút, giờ, ngày hoặc tuần. Nói chung, các tác nhân này có thể có sẵn về mặt sinh học đồng thời, ví dụ, có thể phát hiện được, ở đối tượng. Theo một số phương án, về cơ bản các chất này có thể được sử dụng đồng thời, ví dụ, hai liều đơn vị được sử dụng cùng lúc, hoặc liều đơn vị kết hợp của hai chất này. Theo các phương án khác, các chất này có thể được phân phối theo các đơn vị liều lượng riêng biệt. Các chất này có thể được sử dụng theo thứ tự bất kỳ, hoặc dưới dạng một hoặc nhiều chế phẩm bao gồm hai hoặc nhiều chất. Theo một phương án được ưu tiên, ít nhất một lần sử dụng một trong các chất, ví dụ, chất thứ nhất, có thể được thực hiện trong vòng vài phút, một, hai, ba hoặc bốn giờ, hoặc thậm chí trong vòng một hoặc hai ngày kể từ chất kia, ví dụ. , đại lý thứ hai. Theo một số phương án, sự kết hợp có thể đạt được kết quả cộng hưởng, ví dụ, lớn hơn kết quả cộng, ví dụ, lớn hơn ít nhất 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, hoặc 500% so với kết quả cộng.
Các tình trạng liên quan đến nhiễm trùng do vi khuẩn
Các bệnh, rối loạn hoặc tình trạng có thể liên quan đến nhiễm trùng do vi khuẩn bao gồm nhưng không giới hạn ở một hoặc nhiều tình trạng sau: áp xe, bệnh Actinomycosis, viêm tuyến tiền liệt cấp tính,Aeromonas hydrophila, độc tính của cỏ lúa mạch đen hàng năm, bệnh than, bệnh trực khuẩn, nhiễm khuẩn huyết, viêm dạ dày ruột do vi khuẩn, viêm màng não do vi khuẩn, viêm phổi do vi khuẩn, viêm âm đạo do vi khuẩn, các bệnh về da liên quan đến vi khuẩn, bệnh bartonellosis, BCG-oma, bệnh nấm botryomycosis, bệnh ngộ độc, sốt ban xuất huyết Brazil, áp xe Brodie, bệnh brucellosis, Buruli loét, bệnh campylobacteriosis, sâu răng, bệnh Carrion, bệnh mèo cào, viêm mô tế bào,chlamydianhiễm trùng, dịch tả, viêm tuyến tiền liệt mãn tính do vi khuẩn, viêm tủy xương đa ổ tái phát mãn tính, viêm ruột hoại tử clostridial, tổn thương kết hợp nha chu-nội nha, viêm phổi màng phổi truyền nhiễm ở bò, bệnh bạch hầu, viêm miệng bạch hầu, bệnh ehrlichiosis, bệnh quầng, viêm lợn, quầng, hội chứng Fitz-Hugh-Curtis, bọ chét sốt đốm, thối chân (viêm da bàn chân truyền nhiễm), viêm tủy xương xơ cứng Garre, bệnh lậu, u hạt bẹn, bệnh thiếu bạch cầu hạt ở người, bệnh ehrlichiosis đơn bào ở người, ho trăm ngày, bệnh chốc lở, bệnh giang mai bẩm sinh muộn, bệnh Legionellosis, hội chứng Lemierre, bệnh phong (Bệnh Hansen), bệnh leptospirosis, listeriosis, bệnh Lyme, viêm hạch, bệnh melioidosis, bệnh não mô cầu, nhiễm trùng huyết do não mô cầu, kháng methicillinStaphylococcus aureus(MRSA), nhiễm trùngMycobacteria avium-nội bào(CÓ THỂ),mycoplasmaviêm phổi, viêm cân hoại tử, nocardiosis, noma (cancrum oris hoặc viêm miệng hoại tử), viêm rốn, viêm mô tế bào hốc mắt, viêm tủy xương, nhiễm trùng nặng sau cắt lách (OPSI), bệnh brucellosis ở buồng trứng, bệnh tụ huyết trùng, viêm mô tế bào quanh ổ mắt, ho gà (ho gà), bệnh dịch hạch, viêm phổi do phế cầu khuẩn , Bệnh Pott, viêm trực tràng,pseudomonasnhiễm trùng, bệnh vẩy nến, mủ máu, viêm mủ cơ, sốt Q, sốt tái phát (typhinia), sốt thấp khớp, sốt đốm Rocky Mountain (RMSF), bệnh rickettsiosis,bệnh nhiễm khuẩn salmonella, sốt ban đỏ, nhiễm trùng huyết,răng cưanhiễm trùng, bệnh lỵ trực khuẩn, bệnh phát ban liên quan đến ve ở miền nam, hội chứng bỏng da do tụ cầu, viêm họng do liên cầu, u hạt ở bể bơi, bệnh brucellosis ở lợn, bệnh giang mai, viêm động mạch chủ giang mai, uốn ván, hội chứng sốc độc tố (TSS), bệnh mắt hột, sốt rãnh, loét nhiệt đới, bệnh lao, bệnh tularemia, sốt thương hàn, bệnh sốt phát ban, bệnh lao niệu sinh dục, nhiễm trùng đường tiết niệu, kháng vancomycinStaphylococcus aureusnhiễm trùng, hội chứng Waterhouse-Friderichsen,bệnh giả lao(Yersinia) bệnh và bệnh yersiniosis. Các bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng khác liên quan đến nhiễm khuẩn có thể bao gồm, ví dụ như bệnh Alzheimer, chán ăn tâm thần, hen suyễn, xơ vữa động mạch, rối loạn tăng động giảm chú ý, tự kỷ, bệnh tự miễn, rối loạn lưỡng cực, ung thư (ví dụ: ung thư đại trực tràng, túi mật). ung thư, ung thư phổi, ung thư tuyến tụy và ung thư dạ dày), hội chứng mệt mỏi mãn tính, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính, bệnh Crohn, bệnh tim mạch vành, mất trí nhớ, trầm cảm, hội chứng Guillain-Barre, hội chứng chuyển hóa, bệnh đa xơ cứng, nhồi máu cơ tim, béo phì, ám ảnh - Rối loạn cưỡng chế, rối loạn hoảng sợ, bệnh vẩy nến, viêm khớp dạng thấp, sarcoidosis, tâm thần phân liệt, đột quỵ, viêm tắc mạch huyết khối (bệnh Buerger) và hội chứng Tourette.
Vi khuẩn gây bệnh
Vi khuẩn được mô tả ở đây có thể là vi khuẩn Gram dương hoặc vi khuẩn Gram âm. Vi khuẩn gây bệnh bao gồm nhưng không giới hạn ởTrực khuẩn than, coagulase âm tínhStaphylococcus, Corynebacteria diphtheria, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, độc tố đường ruộtEscherichia coli(ETEC), gây bệnh đường ruộtE. coli, E. coliO157:H7,Vi khuẩn đường ruộtsp.,Francisella tularensis, Haemophilusenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis, Mycobacteria leprae, Mycobacteria lao, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Preteus mirabilis, Proteussp.,Vi bệnh dịch tả, VàYersinia pestis. Các mầm bệnh do vi khuẩn cũng có thể bao gồm vi khuẩn gây nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc, ví dụ như vi khuẩn kháng clindamycin.Clostridium difficile, kháng fluoroquinolonClostridium difficile, kháng methicillinStaphylococcus aureus(MRSA), Enterococcusfaecalis đa kháng thuốc, Enterococcusfaecium đa kháng thuốc, Enterococcusfaecium đa kháng thuốcPseudomonas aeruginosa, đa kháng thuốcAcinetobacter baumanniivà kháng vancomycinStaphylococcus aureus(CẠM BẪY).
Kết hợp kháng sinh
Theo một phương án, mARN biến đổi theo sáng chế có thể được sử dụng kết hợp với một hoặc nhiều loại kháng sinh. Chúng bao gồm, nhưng không giới hạn ở Aknilox, Ambisome, Amoxycillin, Ampicillin, Augmentin, Avelox, Azithromycin, Bactroban, Betadine, Betnovate, Blephamide, Cefaclor, Cefadroxil, Cefdinir, Cefepime, Cefix, Cefixime, Cefoxitin, Cefpodoxime, Cefprozil, Cefuroxime, Cefzil, Cephalexin, Cephazolin, Ceptaz, Chloramphenicol, Chlorhexidine, Chloromycetin, Chlorsig, Ciprofloxacin, Clarithromycin, Clindagel, Clindamycin, Clindatech, Cloxacillin, Colistin, Co-trimoxazole, Demeclocycline, Diclocil, Dicloxacillin, Doxycycline, Duricef, Erythromycin, Flamazine, Floxin, Framycetin, Fucidin, Furadantin, Fusidic, Gatifloxacin, Gemifloxacin, Gemifloxacin, Ilosone, Iodine, Levaquin, Levofloxacin, Lomefloxacin, Maxaquin, Mefoxin, Meronem, Minocycline, Moxifloxacin, Myambutol, Mycostatin, Neosporin, Netromycin, Nitrofurantoin, Norfloxacin, Norilet, Ofloxacin, Omnicef, Ospamox, Oxytetracycline, Paraxin, Penicillin, Pneumovax, Polyfax, Povidone, Rifadin, Rifampin, Rifaximin, Rifinah, Rimactane, Rocephin, Roxithromycin, Seromycin, Soframycin, Sparfloxacin, Staphlex, Targocid, Tetracycline, Tetradox, Tetralysal, tobramycin, Tobramycin, Trecator, Tygacil, Vancocin, Velosef, Vibramycin, Xachusan, Zagam, Zitrotek, Zoderm, Zymar và Zyvox.
Chất kháng khuẩn
Chất kháng khuẩn ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, aminoglycoside (ví dụ, amikacin (AMIKIN®), gentamicin (GARAMYCIN®), kanamycin (KANTREX®), neomycin (MYCIFRADIN®), netilmicin (NETROMYCIN®), tobramycin (NEBCIN ®), Paromomycin (HUMATIN®)), ansamycins (ví dụ: geldanamycin, herbimycin), carbacephem (ví dụ: loracarbef (LORABID®), Carbapenems (ví dụ: ertapenem (INVANZ®), doripenem (DORIBAX®), imipenem/cilastatin (PRIMAXIN ®), meropenem (MERREM®), cephalosporin (thế hệ thứ nhất) (ví dụ: cefadroxil (DURICEF®), cefazolin (ANCEF®), cefalotin hoặc cefalothin (KEFLIN®), cefalexin (KEFLEX®), cephalosporin (thế hệ thứ hai) (ví dụ: , cefaclor (CECLOR®), cefamandole (MANDOL®), cefoxitin (MEFOXIN®), cefprozil (CEFZIL®), cefuroxime (CEFTIN®, ZINNAT®)), cephalosporin (thế hệ thứ ba) (ví dụ: cefixime (SUPRAX®), cefdinir (OMNICEF®, CEFDIEL®), cefditoren (SPECTRACEF®), cefoperazone (CEFOBID®), cefotaxime (CLAFORAN®), cefpodoxime (VANTIN®), ceftazidime (FORTAZ®), ceftibuten (CEDAX®), ceftizoxime (CEFIZOX®), ceftriaxone (ROCEPHIN®)), cephalosporin (thế hệ thứ tư) (ví dụ: cefepime (MAXIPIME®)), cephalosporin (thế hệ thứ năm) (ví dụ: ceftobiprole (ZEFTERA®)), glycopeptide (ví dụ: teicoplanin (TARGOCID®), vancomycin (VANCOCIN) ®), telavancin (VIBATIV®)), lincosamid (ví dụ: clindamycin (CLEOCIN®), lincomycin (LINCOCIN®)), lipopeptide (ví dụ: daptomycin (CUBICIN®)), macrolide (ví dụ: azithromycin (ZITHROMAX®, SUMAMED®, ZITROCIN®), clarithromycin (BIAXIN®), dirithromycin (DYNABAC®), erythromycin (ERYTHOCIN®, ERYTHROPED®), roxithromycin, troleandomycin (TAO®), telithromycin (KETEK®), Spectinomycin (TROBICIN®)), monobactam (ví dụ, aztreonam (AZACTAM®)), nitrofurans (ví dụ: furazolidone (FUROXONE®), nitrofurantoin (MACRODANTIN®, MACROBID®)), penicillin (ví dụ: amoxicillin (NOVAMOX®, AMOXIL®), ampicillin (PRINCIPEN®), azlocillin, carbenicillin ( GEOCILLIN®), cloxacillin (TEGOPEN®), dicloxacillin (DYNAPEN®), flucloxacillin (FLOXAPEN®), mezlocillin (MEZLIN®), methicillin (STAPHCILLIN®), nafcillin (UNIPEN®), oxacillin (PROSTAPHLIN®), penicillin G (PENTIDS ®), penicillin V (PEN-VEE-K®), piperacillin (PIPRACIL®), temocillin (NEGABAN®), ticarcillin (TICAR®)), kết hợp penicillin (ví dụ: amoxicillin/clavulanate (AUGMENTIN®), ampicillin/sulbactam ( UNASYN®), piperacillin/tazobactam (ZOSYN®), ticarcillin/clavulanate (TIMENTIN®)), polypeptide (ví dụ: bacitracin, colistin (COLY-MYCIN-S®), polymyxin B, quinolone (ví dụ: ciprofloxacin (CIPRO®, CIPROXIN) ®, CIPROBAY®), enoxacin (PENETREX®), gatifloxacin (TEQUIN®), levofloxacin (LEVAQUIN®), lomefloxacin (MAXAQUIN®), moxifloxacin (AVELOX®), axit nalidixic (NEGGRAM®), norfloxacin (NOROXIN®), ofloxacin (FLOXIN®, OCUFLOX®), trovafloxacin (TROVAN®), grepafloxacin (RAXAR®), sparfloxacin (ZAGAM®), temafloxacin (OMNIFLOX®)), sulfonamid (ví dụ: mafenide (SULFAMYLON®), sulfonamidochrysoidine (PRONTOSIL®), sulfacetamide (SULAMYD®, BLEPH-10®), sulfadiazine (MICRO-SULFON®), bạc sulfadiazine (SILVADENE®), sulfamethizole (THIOSULFIL FORTE®), sulfamethoxazole (GANTANOL®), sulfanilimide, sulfasalazine (AZULFIDINE®), sulfisoxazole (GANTRISIN® ), trimethoprim (PROLOPRIM®), TRIMPEX®), trimethoprim-sulfamethoxazole (co-trimoxazole) (TMP-SMX) (BACTRIM®, SEPTRA®)), tetracycline (ví dụ: demeclocycline (DECLOMYCIN®), doxycycline (VIBRAMYCIN®), minocycline (MINOCIN®), oxytetracycline (TERRAMYCIN®), tetracycline (SUMYCIN®, ACHROMYCIN® V, STECLIN®)), thuốc chống vi khuẩn mycobacteria (ví dụ: clofazimine (LAMPRENE®), dapsone (AVLOSULFON®), capreomycin (CAPASTAT®), cycloserine (SEROMYCIN®), ethambutol (MYAMBUTOL®), ethionamide (TRECATOR®), isoniazid (I.N.H.®), pyrazinamide (ALDINAMIDE®), rifampin (RIFADIN®, RIMACTANE®), rifabutin (MYCOBUTIN®), rifapentine (PRIFTIN®) , streptomycin) và các loại khác (ví dụ: arsphenamine (SALVARSAN®), chloramphenicol (CHLOROMYCETIN®), fosfomycin (MONUROL®), axit fusidic (FUCIDIN®), linezolid (ZYVOX®), metronidazole (FLAGYL®), mupirocin (BACTROBAN® ), platensimycin, quinupristin/dalfopristin (SYNERCID®), rifaximin (XIFAXAN®), thiamphenicol, tigecycline (TIGACYL®), tinidazole (TINDAMAX®, FASIGYN®)).
Các tình trạng liên quan đến nhiễm virus
Theo một phương án khác, sáng chế đề xuất các phương pháp điều trị hoặc ngăn ngừa sự nhiễm vi-rút và/hoặc bệnh, rối loạn hoặc tình trạng liên quan đến nhiễm vi-rút hoặc triệu chứng của bệnh đó ở đối tượng bằng cách sử dụng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN mã hóa polypeptit kháng virut, ví dụ, polypeptit kháng virut được mô tả ở đây kết hợp với chất chống virut, ví dụ, polypeptit kháng virut hoặc chất chống virut phân tử nhỏ được mô tả ở đây.
Các bệnh, rối loạn hoặc tình trạng liên quan đến nhiễm virus bao gồm nhưng không giới hạn ở sốt viêm họng cấp tính, sốt họng kết mạc, viêm kết giác mạc dịch bệnh, viêm dạ dày ruột ở trẻ sơ sinh, nhiễm trùng Coxsackie, bệnh bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng, u lympho Burkitt, viêm gan cấp tính, viêm gan mãn tính, xơ gan, tế bào gan ung thư biểu mô, nhiễm HSV-1 nguyên phát (ví dụ: viêm nướu miệng ở trẻ em, viêm amidan và viêm họng ở người lớn, viêm kết mạc giác mạc), nhiễm HSV-1 tiềm ẩn (ví dụ: herpes môi và vết loét lạnh), nhiễm HSV-2 nguyên phát, nhiễm HSV-2 tiềm ẩn, viêm màng não vô khuẩn, bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng, bệnh bao gồm tế bào to, ung thư Kaposi, bệnh Castleman đa trung tâm, u lympho tràn dịch nguyên phát, AIDS, cúm, hội chứng Reye, bệnh sởi, viêm não tủy sau nhiễm trùng, Quai bị, tổn thương biểu mô tăng sản (ví dụ: mụn cóc thông thường, mụn cóc phẳng, mụn cóc ở lòng bàn chân và hậu môn sinh dục, u nhú thanh quản, loạn sản biểu bì mụn cóc), ung thư cổ tử cung, ung thư biểu mô tế bào vảy, viêm thanh quản, viêm phổi, viêm tiểu phế quản, cảm lạnh thông thường, bại liệt, bệnh dại, viêm tiểu phế quản, viêm phổi, hội chứng giống cúm, viêm tiểu phế quản nặng kèm viêm phổi, sởi Đức, rubella bẩm sinh, thủy đậu, và herpes zoster.
Mầm bệnh virus
Các mầm bệnh do virus bao gồm, nhưng không giới hạn, adenovirus, coxsackievirus, virus sốt xuất huyết, virus viêm não, virus Epstein-Barr, virus viêm gan A, virus viêm gan B, virus viêm gan C, virus herpes simplex loại 1, virus herpes simplex loại 2, cytomegalovirus , virus herpes ở người loại 8, virus gây suy giảm miễn dịch ở người, virus cúm, virus sởi, virus quai bị, virus u nhú ở người, virus parainfluenza, virus bại liệt, virus dại, virus hợp bào hô hấp, virus rubella, virus varicella-zoster, virus West Nile và virus sốt vàng da . Các mầm bệnh virus cũng có thể bao gồm các virus gây nhiễm virus kháng thuốc.
Đại lý chống vi-rút
Các chất chống vi-rút ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, abacavir (ZIAGEN®), abacavir/lamivudine/zidovudine (Trizivir®), aciclovir hoặc acyclovir (CYCLOVIR®, HERPEX®, ACIVIR®, ACIVIRAX®, ZOVIRAX®, ZOVIR® ), adefovir (Preveon®, Hepsera®), amantadine (SYMMETREL®), amprenavir (AGENERASE®), ampligen, arbidol, atazanavir (REYATAZ®), boceptrevir, cidofovir, darunavir (PREZISTA®), delavirdine (RESCRIPTOR®), didanosine (VIDEX®), docosanol (ABREVA®), edoxudine, efavirenz (SUSTIVA®, STOCRIN®), emtricitabine (EMTRIVA®), emtricitabine/tenofovir/efavirenz (ATRIPLA®), enfuvirtide (FUZEON®), entecavir (BARACLUDE®, ENTAVIR ®), famciclovir (FAMVIR®), fomivirsen (VITRAVENE®), fosamprenavir (LEXIVA®, TELZIR®), foscarnet (FOSCAVIR®), fosfonet, ganciclovir (CYTOVENE®, CYMEVENE®, VITRASERT®), GS 9137 (ELVITEGRAVIR®) , imiquimod (ALDARA®, ZYCLARA®, BESELNA®), indinavir (CRIXIVAN®), inosine, inosine pranobex (IMUNOVIR®), interferon loại I, interferon loại II, interferon loại III, kutapressin (NEXAVIR®), lamivudine (ZEFFIX® , HEPTOVIR®, EPIVIR®), lamivudine/zidovudine (COMBIVIR®), lopinavir, loviride, maraviroc (SELZENTRY®, CELSENTRI®), methisazone, MK-2048, moroxydine, nelfinavir (VIRACEPT®), nevirapine (VIRAMUNE®), oseltamivir (TAMIFLU®), peginterferon alfa-2a (PEGASYS®), penciclovir (DENAVIR®), peramivir, pleconaril, podophyllotoxin (CONDYLOX®), raltegraver (ISENIRESS®), ribavirin (COPEGUs®, REBETOL®, RIBASPHERE®, VILONA® VÀ VIRAZOLE®), rimantadine (FLUMADINE®), ritonavir (NORVIR®), Pyramidine, saquinavir (INVIRASE®, FORTOVASE®), stavudine, dầu cây trà (tràmdầu), tenofovir (VTREAD®), tenofovir/emtricitabine (TRUVADA®), tipranavir (APTIVUS®), trifluridine (VIROPTIC®), tromantadine (VIRU-MERZ®), valaciclovir (VALTREX®), valganciclovir (VALCYTE®), vicriviroc , vidarabine, viramidine, zalcitabine, zanamivir (RELENZA®) và zidovudine (azidothymidine (AZT), RETROVIR®, RETROVIS®).
Các tình trạng liên quan đến nhiễm nấm
Các bệnh, rối loạn hoặc tình trạng liên quan đến nhiễm nấm bao gồm nhưng không giới hạn ở aspergilloses, blastomycosis, candida, coccidioidomycosis, cryptococcosis, histoplasmosis, mycetomas, paracoccidioidomycosis và tinea pedis. Hơn nữa, những người bị suy giảm miễn dịch đặc biệt dễ mắc bệnh do các loại nấm nhưAspergillus, Candida, Cryptoccocus, Histoplasma, VàViêm phổi. Các loại nấm khác có thể tấn công mắt, móng tay, tóc và đặc biệt là da, được gọi là nấm da liễu và nấm keratinophilic, đồng thời gây ra nhiều tình trạng khác nhau, trong đó bệnh nấm ngoài da như nấm bàn chân của vận động viên là phổ biến. Bào tử nấm cũng là nguyên nhân chính gây dị ứng và nhiều loại nấm thuộc các nhóm phân loại khác nhau có thể gây ra phản ứng dị ứng ở một số người.
Nấm gây bệnh
Nấm gây bệnh bao gồm, nhưng không giới hạn ở Ascomycota (ví dụ,Fusarium oxysporum, Pneumocystis jirovecii, Aspergillusspp.,Coccidioides immitis/posadasii, Candida albicans), Basidiomycota (ví dụ,Filobasidiella neoformans, Trichosporon), Microsporidia (ví dụ,Đường hầm não, Enterocytozoon bieneusi), và Mucoromycotina (ví dụ,Mucor Circinelloides, Rhizopus oryzae, Lichtheimia corymbifera).
Chất chống nấm
Chất chống nấm ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, thuốc chống nấm polyene (ví dụ, natamycin, rimocidin, filipin, nystatin, amphotericin B, candicin, hamycin), thuốc chống nấm imidazole (ví dụ, miconazol (MICATIN®, DAKTARIN®), ketoconazol ( NIZORAL®, FUNGORAL®, SEBIZOLE®), clotrimazole (LOTRIMIN®, LOTRIMIN® AF, CANESTEN®), econazol, omoconazol, bifonazole, butoconazol, fenticonazol, isoconazol, oxiconazol, sertaconazol (ERTACZO®), sulconazol, tioconazol), thuốc chống nấm triazole (ví dụ: albaconazole fluconazole, itraconazole, isavuconazole, ravuconazole, posaconazole, voriconazole, terconazole), thuốc chống nấm thiazole (ví dụ: abafungin), allylamines (ví dụ: terbinafine (LAMISIL®), naftifine (NAFTIN®), butenafine (LOTRIMIN® Ultra)) , echinocandin (ví dụ: anidulafungin, caspofungin, micafungin) và các loại khác (ví dụ: polygodial, axit benzoic, ciclopirox, tolnaftate (TINACTIN®, DESENEX®, AFTATE®), axit undecylenic, flucytosine hoặc 5-fluorocytosine, griseofulvin, haloprogin, natri bicarbonat, allicin).
Các tình trạng liên quan đến nhiễm trùng đơn bào
Các bệnh, rối loạn hoặc tình trạng liên quan đến nhiễm trùng đơn bào bao gồm nhưng không giới hạn ở bệnh amip, bệnh giardia, bệnh trichom*onas, Bệnh ngủ ở Châu Phi, Bệnh ngủ ở Mỹ, bệnh leishmania (Kala-Azar), bệnh balantida, bệnh toxoplasmosis, sốt rét,viêm giác mạc acanthamoebavà bệnh Babiosis.
Tác nhân gây bệnh đơn bào
Các mầm bệnh đơn bào bao gồm, nhưng không giới hạn,Entamoeba histolytica, Giardia lambila, Trichom*onas vagis, Trypanosoma brucei, T. cruzi, Leishmania donovani, Balantidium coli, Toxoplasma gondii, Plasmodiumspp., vàBabesia microti.
Chất chống động vật nguyên sinh
Các chất chống động vật nguyên sinh ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở eflornithine, furazolidone (FUROXONE®, DEPENDAL-M®), melarsoprol, metronidazole (FLAGYL®), ornidazole, paromomycin sulfat (HUMATIN®), pentamidine, pyrimethamine (DARAPRIM®) và tinidazole (TINDAMAX®, FASIGYN®).
Các tình trạng liên quan đến nhiễm ký sinh trùng
Các bệnh, rối loạn hoặc tình trạng liên quan đến nhiễm ký sinh trùng bao gồm nhưng không giới hạn ở:viêm giác mạc acanthamoeba, amip, ascariocation, babesiosis, balantidzheim, baylisascarzheim, bệnh chagas, clonorchzheim,bệnh ốc tai, cryptosporidiosis, diphyllobothrzheim, dracunculzheim, echinococcosis, voi, bệnh giun sán, bệnh sán lá gan, bệnh sán lá gan lớn, bệnh giun chỉ, bệnh giardia, bệnh gnathostomzheim, bệnh hymenolepheim, isosporzheim, sốt katayama, bệnh leishmania, bệnh lyme, sốt rét, bệnh metagonimzheim, bệnh nấm my, bệnh giun chỉ, bệnh móng chân, ghẻ, bệnh sán máng, ngủ bệnh tật, bệnh giun lươn, bệnh sán dây, bệnh giun đũa chó, bệnh toxoplasmosis, bệnh trichinosis và bệnh giun tóc.
Mầm bệnh ký sinh
Các mầm bệnh ký sinh bao gồm, nhưng không giới hạn,Acanthamoeba, Anisakis, Ascaris lumbricoides, ruồi trâu,Balantidium coli, rệp, Cestoda, bọ đỏ,Cochliomyia hominivorax, Entamoeba histolytica, Fasciolapatica, Giardia lamblia, giun móc,Leishmania, Linguatula serrata, sán lá gan,Chắc chắn rồi, Paragonimus, giun kim,Plasmodium falciparum, Schistosoma, Strongyloides stercoralis, ve, sán dây,Toxoplasma gondii, Trypanosoma, giun đũa,Wuchereria bancrofti.
Chất chống ký sinh trùng
Các chất chống ký sinh trùng làm ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, thuốc chống giun kim (ví dụ, mebendazole, pyrantel pamoate, thiabendazole, diethylcarbamazine, ivermectin), thuốc chống giun sán (ví dụ, niclosamid, praziquantel, albendazole), thuốc chống giun đũa (ví dụ, praziquantel), thuốc kháng amip (ví dụ, , rifampin, amphotericin B) và thuốc chống động vật nguyên sinh (ví dụ: melarsoprol, eflornithine, metronidazole, tinidazole).
Các điều kiện liên quan đến nhiễm trùng Prion
Các bệnh, rối loạn hoặc tình trạng liên quan đến nhiễm trùng prion bao gồm nhưng không giới hạn ở bệnh Creutzfeldt-Jakob (CJD), bệnh Creutzfeldt-Jakob do điều trị (iCJD), bệnh Creutzfeldt-Jakob biến thể (vCJD), bệnh Creutzfeldt-Jakob gia đình (fCJD). ), bệnh Creutzfeldt-Jakob lẻ tẻ (sCJD), hội chứng Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), chứng mất ngủ gia đình gây tử vong (FFI), Kuru, Scrapie, bệnh não xốp dạng bò (BSE), bệnh bò điên, bệnh não chồn lây truyền (TME), bệnh suy nhược mãn tính (CWD), bệnh não xốp ở mèo (FSE), bệnh não móng guốc ngoại lai (EUE) và bệnh não xốp.
Chất chống Prion
Chất kháng prion được lấy làm ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở, flupirtin, pentosan polysuphat, quinacrin, và hợp chất tetra vòng.
Điều chế phản ứng miễn dịch Tránh đáp ứng miễn dịch
Như được mô tả ở đây, đặc điểm hữu ích của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế là khả năng làm giảm, trốn tránh hoặc tránh phản ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào. Theo một khía cạnh, sáng chế đề cập đến polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA mã hóa polypeptit quan tâm mà khi được phân phối đến tế bào sẽ làm giảm phản ứng miễn dịch từ vật chủ so với phản ứng được kích hoạt bởi hợp chất đối chiếu, ví dụ, polynucleotit không biến đổi tương ứng với polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế, hoặc polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN khác theo sáng chế. Như được sử dụng ở đây, “hợp chất đối chiếu” là phân tử hoặc chất bất kỳ mà khi sử dụng cho động vật có vú sẽ tạo ra phản ứng miễn dịch bẩm sinh có mức độ, mức độ hoặc lượng kích thích miễn dịch đã biết. Hợp chất đối chiếu không nhất thiết phải là phân tử axit nucleic và nó không cần phải là polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN bất kỳ theo sáng chế. Do đó, số đo polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc sự tránh né, trốn tránh hoặc không kích hoạt phản ứng miễn dịch của mmRNA có thể được biểu thị bằng thuật ngữ liên quan đến hợp chất hoặc chất bất kỳ được biết là gây ra phản ứng như vậy.
Thuật ngữ “đáp ứng miễn dịch bẩm sinh” bao gồm phản ứng của tế bào với các axit nucleic sợi đơn ngoại sinh, thường có nguồn gốc từ virus hoặc vi khuẩn, bao gồm việc tạo ra sự biểu hiện và giải phóng cytokine, đặc biệt là các interferon, và làm chết tế bào. Như được sử dụng ở đây, phản ứng miễn dịch bẩm sinh hoặc phản ứng interferon hoạt động ở cấp độ tế bào đơn lẻ gây ra sự biểu hiện cytokine, giải phóng cytokine, ức chế toàn bộ quá trình tổng hợp protein, phá hủy toàn bộ ARN của tế bào, điều hòa lại các phân tử tương thích mô chính, và/hoặc gây ra cái chết theo chương trình, cảm ứng phiên mã gen của các gen liên quan đến apoptosis, chống tăng trưởng và kích hoạt tế bào miễn dịch bẩm sinh và thích nghi. Một số gen được tạo ra bởi IFN loại I bao gồm PKR, ADAR (adenosine deaminase tác động lên RNA), OAS (2′,5′-oligoadenylate synthetase), protein RNase L và Mx. PKR và ADAR tương ứng dẫn đến ức chế quá trình bắt đầu dịch mã và chỉnh sửa RNA. OAS là một synthetase phụ thuộc vào DSRNA, kích hoạt endoribonuclease RNase L để phân hủy ssRNA.
Theo một số phương án, đáp ứng miễn dịch bẩm sinh bao gồm sự biểu hiện của interferon Loại I hoặc Loại II, và sự biểu hiện của interferon Loại I hoặc Loại II không tăng quá hai lần so với tham chiếu từ tế bào chưa được tiếp xúc với polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế.
Theo một số phương án, đáp ứng miễn dịch bẩm sinh bao gồm sự biểu hiện của một hoặc nhiều gen đặc trưng IFN và trong đó sự biểu hiện của một trong số nhiều gen đặc trưng IFN không tăng quá ba lần so với tham chiếu từ tế bào chưa được tiếp xúc với polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế.
Mặc dù trong một số trường hợp, việc loại bỏ phản ứng miễn dịch bẩm sinh trong tế bào có thể là có lợi, nhưng sáng chế đề xuất các polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA mà khi sử dụng sẽ dẫn đến giảm đáng kể (ít hơn đáng kể) phản ứng miễn dịch, bao gồm cả tín hiệu interferon, mà hoàn toàn không gây ra phản ứng miễn dịch bẩm sinh. loại bỏ phản ứng như vậy.
Theo một số phương án, đáp ứng miễn dịch thấp hơn 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,9%, hoặc lớn hơn 99,9 % so với phản ứng miễn dịch gây ra bởi hợp chất tham chiếu. Bản thân phản ứng miễn dịch có thể được đo lường bằng cách xác định mức độ biểu hiện hoặc hoạt động của interferon Loại 1 hoặc biểu hiện của các gen được điều hòa bởi interferon chẳng hạn như các thụ thể giống thu phí (ví dụ: TLR7 và TLR8). Việc giảm đáp ứng miễn dịch bẩm sinh cũng có thể được đo bằng cách đo mức độ giảm tế bào chết sau một hoặc nhiều lần tiêm vào quần thể tế bào; ví dụ: tỷ lệ chết tế bào thấp hơn 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% hoặc trên 95% so với tần suất chết tế bào quan sát được với hợp chất tham chiếu. Hơn nữa, sự chết tế bào có thể ảnh hưởng đến ít hơn 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% hoặc ít hơn 0,01% số tế bào được tiếp xúc với polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA. .
Theo một phương án khác, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế có khả năng gây miễn dịch kém hơn đáng kể so với polynucleotit phân tử ARN được tổng hợp in vitro không biến đổi, hoặc cấu trúc bậc một có cùng trình tự hoặc hợp chất đối chiếu. Như được sử dụng ở đây, “ít gây miễn dịch hơn đáng kể” được dùng để chỉ sự giảm khả năng sinh miễn dịch có thể phát hiện được. Theo một phương án khác, thuật ngữ này dùng để chỉ khả năng sinh miễn dịch giảm gấp nhiều lần. Theo một phương án khác, thuật ngữ này dùng để chỉ sự giảm sao cho có thể sử dụng lượng hữu hiệu của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA mà không gây ra phản ứng miễn dịch có thể phát hiện được. Theo một phương án khác, thuật ngữ này dùng để chỉ sự giảm sao cho polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được sử dụng nhiều lần mà không gây ra phản ứng miễn dịch đủ để làm giảm sự biểu hiện của protein tái tổ hợp một cách có thể phát hiện được. Theo một phương án khác, mức giảm này là để polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể được sử dụng nhiều lần mà không gây ra phản ứng miễn dịch đủ để loại bỏ sự biểu hiện có thể phát hiện được của protein tái tổ hợp.
Theo một phương án khác, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có khả năng gây miễn dịch kém hơn gấp 2 lần so với đối tượng hoặc hợp chất tham chiếu không biến đổi của nó. Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch bị giảm đi 3 lần. Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch bị giảm đi 5 lần. Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch bị giảm đi 7 lần. Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch bị giảm đi 10 lần. Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch bị giảm đi 15 lần. Theo một phương án khác, tính sinh miễn dịch bị giảm đi bởi hệ số gấp. Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch giảm đi 50 lần. Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch bị giảm đi 100 lần. Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch bị giảm đi 200 lần. Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch bị giảm đi 500 lần. Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch bị giảm đi 1000 lần. Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch bị giảm đi 2000 lần. Theo một phương án khác, tính sinh miễn dịch bị giảm đi bởi sự khác biệt gấp lần nữa.
Các phương pháp xác định tính sinh miễn dịch đã được biết rõ trong lĩnh vực kỹ thuật này và bao gồm, ví dụ, đo sự bài tiết các cytokine (ví dụ IL-12, IFNalpha, TNF-alpha, RANTES, MIP-lalpha hoặc beta, IL-6, IFN-beta hoặc IL-8), đo biểu hiện của các dấu hiệu kích hoạt DC (ví dụ CD83, HLA- DR, CD80 và CD86), hoặc đo khả năng hoạt động như chất bổ trợ cho phản ứng miễn dịch thích ứng.
Polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế, bao gồm tổ hợp các biến đổi được dạy ở đây có thể có các đặc tính vượt trội làm cho chúng thích hợp hơn làm phương thức điều trị.
Người ta đã xác định rằng mô hình “tất cả hoặc không có” trong lĩnh vực kỹ thuật này là không đủ để mô tả các hiện tượng sinh học liên quan đến công dụng điều trị của mARN biến đổi. Các tác giả sáng chế đã xác định rằng để cải thiện khả năng sản xuất protein, người ta có thể xem xét bản chất của biến đổi hoặc sự kết hợp của các biến đổi, phần trăm biến đổi và khảo sát nhiều cytokine hoặc số liệu để xác định đặc điểm hiệu quả và rủi ro của mARN biến đổi cụ thể.
Theo một khía cạnh của sáng chế, các phương pháp xác định hiệu quả của mARN biến đổi so với mARN không biến đổi bao gồm việc đo và phân tích một hoặc nhiều xytokin có biểu hiện được kích hoạt bằng cách sử dụng axit nucleic ngoại sinh theo sáng chế. Các giá trị này được so sánh với việc sử dụng axit nucleic đã được biến đổi hoặc với thước đo chuẩn như phản ứng của cytokine, PolyIC, R-848 hoặc chuẩn khác đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này.
Một ví dụ về thước đo tiêu chuẩn được phát triển ở đây là thước đo tỷ lệ giữa mức hoặc lượng polypeptide (protein) được mã hóa được tạo ra trong tế bào, mô hoặc sinh vật với mức hoặc lượng của một hoặc nhiều (hoặc nhóm) cytokine có biểu hiện được kích hoạt trong tế bào, mô hoặc sinh vật do sử dụng hoặc tiếp xúc với axit nucleic biến đổi. Các tỷ lệ như vậy ở đây được gọi là Tỷ lệ Protein:Xytokine hoặc Tỷ lệ “PC”. Tỷ lệ PC càng cao thì axit nucleic biến đổi càng hiệu quả (polynucleotide mã hóa protein được đo). Tỷ lệ PC được ưu tiên, theo cytokine, theo sáng chế có thể lớn hơn 1, lớn hơn 10, lớn hơn 100, lớn hơn 1000, lớn hơn 10.000 hoặc lớn hơn. Các axit nucleic biến đổi có tỷ lệ PC cao hơn axit nucleic biến đổi có cấu trúc khác hoặc không biến đổi được ưu tiên.
Tỷ lệ PC có thể được xác định rõ hơn bằng phần trăm biến đổi có trong polynucleotit. Ví dụ, được chuẩn hóa thành axit nucleic được biến đổi 100%, việc sản xuất protein dưới dạng chức năng của cấu hình cytokine (hoặc rủi ro) hoặc cytokine có thể được xác định.
Theo một phương án, sáng chế đề xuất phương pháp xác định, giữa các thành phần hóa học, cytokine hoặc phần trăm biến đổi, hiệu quả tương đối của polynucleotit biến đổi cụ thể bất kỳ, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bằng cách so sánh Tỷ lệ PC của axit nucleic biến đổi (polynucleotit, cấu trúc bậc một). hoặc mmRNA).
mmRNA chứa các mức thay thế nucleobase khác nhau có thể được tạo ra để duy trì việc tăng sản xuất protein và giảm khả năng kích thích miễn dịch. Tỷ lệ phần trăm tương đối của bất kỳ nucleotide biến đổi nào so với nucleotide xuất hiện tự nhiên của nó có thể thay đổi trong phản ứng IVT (ví dụ: 100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,1, 0,01% 5 việc sử dụng methyl cytidine so với cytidine; 100 , 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,1, 0,01% sử dụng pseudouridine hoặc N1-methyl-pseudouridine so với uridine). mmRNA cũng có thể được tạo ra để sử dụng các tỷ lệ khác nhau bằng cách sử dụng 2 hoặc nhiều nucleotide khác nhau trên cùng một bazơ (ví dụ, các tỷ lệ khác nhau của pseudouridine và N1-methyl-pseudouridine). mmRNA cũng có thể được tạo ra với các tỷ lệ hỗn hợp ở nhiều hơn 1 vị trí “bazơ”, chẳng hạn như tỷ lệ 5 metyl cytidine/cytidine và pseudouridine/N1-methyl-pseudouridine/uridine cùng một lúc. Việc sử dụng mARN biến đổi với tỷ lệ thay đổi của các nucleotide biến đổi có thể có lợi trong việc giảm khả năng tiếp xúc với các nucleotide biến đổi về mặt hóa học. Cuối cùng, cũng có thể đưa các nucleotide biến đổi vào mmRNA theo vị trí để điều chỉnh khả năng sản xuất protein hoặc khả năng kích thích miễn dịch hoặc cả hai. Khả năng của mmRNA đó chứng minh các đặc tính được cải thiện này có thể được đánh giá trong ống nghiệm (sử dụng các xét nghiệm như xét nghiệm PBMC được mô tả ở đây) và cũng có thể được đánh giá in vivo thông qua phép đo cả quá trình sản xuất protein được mã hóa mmRNA và các chất trung gian nhận biết miễn dịch bẩm sinh như như các cytokine.
Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch tương đối của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA và bản thể không biến đổi của nó được xác định bằng cách xác định lượng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA cần thiết để tạo ra một trong các phản ứng nêu trên ở cùng mức độ với lượng đã cho của nucleotit chưa biến đổi hoặc hợp chất đối chiếu. Ví dụ, nếu cần gấp đôi lượng polynucleotit thì cấu trúc bậc một hoặc mmRNA để tạo ra phản ứng tương tự so với polynucleotit, thì cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có khả năng gây miễn dịch kém hơn hai lần so với nucleotit không biến đổi hoặc hợp chất đối chiếu.
Theo một phương án khác, khả năng sinh miễn dịch tương đối của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA và bản thể không biến đổi của nó được xác định bằng cách xác định lượng xytokin (ví dụ IL-12, IFNalpha, TNF-alpha, RANTES, MIP-lalpha hoặc beta, IL-6 , IFN-beta, hoặc IL-8) được tiết ra để đáp ứng với việc sử dụng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA, so với cùng một lượng nucleotit không biến đổi hoặc hợp chất đối chiếu. Ví dụ, nếu lượng cytokine được tiết ra bằng một nửa so với polynucleotide, thì cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA có khả năng gây miễn dịch ít hơn hai lần so với nucleotide không biến đổi. Theo một phương án khác, mức kích thích nền được trừ đi trước khi tính khả năng sinh miễn dịch theo các phương pháp trên.
Sáng chế cũng đề xuất các phương pháp thực hiện việc chuẩn độ, làm giảm hoặc loại bỏ phản ứng miễn dịch trong tế bào hoặc quần thể tế bào. Theo một số phương án, tế bào được tiếp xúc với các liều lượng khác nhau của cùng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA và phản ứng liều lượng được đánh giá. Theo một số phương án, tế bào được cho tiếp xúc với một số polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA khác nhau ở cùng hoặc các liều lượng khác nhau để xác định chế phẩm tối ưu nhằm tạo ra hiệu quả mong muốn. Về phản ứng miễn dịch, tác dụng mong muốn có thể là tránh, trốn tránh hoặc làm giảm phản ứng miễn dịch của tế bào. Hiệu quả mong muốn cũng có thể là làm thay đổi hiệu quả sản xuất protein.
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được sử dụng để làm giảm đáp ứng miễn dịch bằng cách sử dụng phương pháp được mô tả trong Công bố quốc tế số WO2013003475, được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Kích hoạt phản ứng miễn dịch: Vắc xin
Ngoài ra, một số nucleoside biến đổi nhất định, hoặc tổ hợp của chúng, khi được đưa vào polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế sẽ kích hoạt phản ứng miễn dịch bẩm sinh. Các phân tử kích hoạt như vậy rất hữu dụng làm chất bổ trợ khi kết hợp với polypeptit và/hoặc các vắc xin khác. Theo các phương án nhất định, phân tử hoạt hóa chứa vùng có thể dịch mã mà mã hóa trình tự polypeptit hữu dụng làm vắc xin, do đó mang lại khả năng tự hỗ trợ.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN theo sáng chế có thể mã hóa chất sinh miễn dịch. Việc phân phối các polynucleotide, cấu trúc sơ cấp và/hoặc mmRNA mã hóa chất gây miễn dịch có thể kích hoạt phản ứng miễn dịch. Là một ví dụ không giới hạn, các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp và/hoặc mmRNA mã hóa chất gây miễn dịch có thể được phân phối đến các tế bào để kích hoạt nhiều con đường phản ứng bẩm sinh (xem Công bố Quốc tế. Số WO2012006377; ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Như một ví dụ không giới hạn khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA theo sáng chế mã hóa chất gây miễn dịch có thể được phân phối đến động vật có xương sống với lượng liều đủ lớn để gây miễn dịch cho động vật có xương sống (xem Công bố Quốc tế. Số WO2012006372 và WO2012006369; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế có thể mã hóa trình tự polypeptit cho vắc xin và có thể còn chứa chất ức chế. Chất ức chế có thể làm giảm khả năng trình diện kháng nguyên và/hoặc ức chế các con đường khác nhau đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Như một ví dụ không giới hạn, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được sử dụng cho vắc xin kết hợp với chất ức chế mà có thể làm giảm sự trình diện kháng nguyên (xem Công bố Quốc tế. Số WO2012089225 và WO2012089338; mỗi chất trong số đó được đưa vào đây bằng cách tham chiếu toàn bộ).
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế có thể là ARN tự sao chép. Các phân tử RNA tự sao chép có thể nâng cao hiệu quả phân phối RNA và biểu hiện sản phẩm gen kèm theo. Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể bao gồm ít nhất một biến đổi được mô tả ở đây và/hoặc đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Theo một phương án, ARN tự sao chép có thể được thiết kế sao cho ARN tự sao chép không tạo ra sự sản sinh các hạt virut lây nhiễm. Là một ví dụ không giới hạn, RNA tự sao chép có thể được thiết kế bằng các phương pháp được mô tả trong US Pub. Số US20110300205 và Nhà xuất bản Quốc tế. Số WO2011005799, mỗi nội dung trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, các polynucleotit tự sao chép, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế có thể mã hóa protein mà có thể làm tăng đáp ứng miễn dịch. Là một ví dụ không giới hạn, các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA có thể là mARN tự sao chép có thể mã hóa ít nhất một kháng nguyên (xem Số Công bố Hoa Kỳ US20110300205 và Số Công bố Quốc tế WO2011005799, WO2013006838 và WO2013006842; mỗi công bố là được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, các polynucleotit tự sao chép, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra bằng cách sử dụng các phương pháp được mô tả ở đây hoặc đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Là một ví dụ không giới hạn, RNA tự sao chép có thể được tạo ra để phân phối bằng các phương pháp được mô tả trong Geall và cộng sự (Phân phối vắc xin RNA tự khuếch đại phi vi rút, PNAS 2012; PMID: 22908294).
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể mã hóa các peptide lưỡng tính và/hoặc peptit lưỡng tính gây miễn dịch.
Theo phương án, chế phẩm chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể còn bao gồm peptit lưỡng tính và/hoặc peptit lưỡng tính gây miễn dịch. Như một ví dụ không giới hạn, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bao gồm peptide lưỡng tính và/hoặc peptit lưỡng tính sinh miễn dịch có thể được bào chế như mô tả trong US. Quán rượu. Số US20110250237 và Nhà xuất bản Quốc tế. Số WO2010009277 và WO2010009065; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể có tác dụng kích thích miễn dịch. Là một ví dụ không giới hạn, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA có thể mã hóa tất cả hoặc một phần của bộ gen virus ARN sợi dương hoặc âm (xem Số xuất bản quốc tế WO2012092569 và Số xuất bản Hoa Kỳ US20120177701, mỗi mã trong số này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Trong một ví dụ không giới hạn khác, polynucleotit có tác dụng kích thích miễn dịch, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được tạo ra với tá dược để sử dụng như được mô tả ở đây và/hoặc đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này (xem Số xuất bản quốc tế WO2012068295 và Số xuất bản Hoa Kỳ US20120213812 , mỗi nội dung trong số đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Theo một phương án, phản ứng của vắc-xin được bào chế bằng các phương pháp được mô tả ở đây có thể được tăng cường bằng cách bổ sung các hợp chất khác nhau để tạo ra hiệu quả điều trị. Là một ví dụ không giới hạn, chế phẩm vắc xin có thể bao gồm peptit liên kết MHC II hoặc peptit có trình tự tương tự với peptit liên kết MHC II (xem Số xuất bản quốc tế WO2012027365, WO2011031298 và số xuất bản Hoa Kỳ US20120070493, US20110110965, mỗi mã trong số này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Một ví dụ khác, chế phẩm vắc xin có thể chứa các hợp chất nicotinic biến đổi có thể tạo ra phản ứng kháng thể với dư lượng nicotin trong đối tượng (xem Số xuất bản quốc tế WO2012061717 và Số xuất bản Hoa Kỳ US20120114677, mỗi thông số này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn) .
Đột biến xảy ra tự nhiên
Theo một phương án khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmRNA có thể được sử dụng để biểu hiện các biến thể của protein xuất hiện tự nhiên có hoạt tính cải thiện bệnh, bao gồm tăng hoạt tính sinh học, cải thiện kết quả của bệnh nhân, hoặc chức năng bảo vệ, v.v. Nhiều yếu tố cải biến như vậy các gen đã được mô tả ở động vật có vú (Nadeau, Current Opinion in Genetics & Development 2003 13:290-295; Hamilton và Yu, PLoS Genet. 2012; 8:e1002644; Corder et al., Nature Genetics 1994 7:180-184; tất cả được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Các ví dụ ở người bao gồm protein Apo E2, protein biến thể Apo A-I (Apo A-I Milano, Apo A-I Paris), protein Yếu tố IX hiếu động (Factor IX Padua Arg338Lys), đột biến transthyretin (TTR Thr1 l9Met). Biểu hiện của ApoE2 (cys112, cys158) đã được chứng minh là mang lại khả năng bảo vệ so với các dạng đồng phân ApoE khác (ApoE3 (cys112, arg158) và ApoE4 (arg112, arg158)) bằng cách giảm tính nhạy cảm với bệnh Alzheimer và có thể các tình trạng khác như bệnh tim mạch ( Corder và cộng sự, Nature Genetics 1994 7:180-184; Seripa và cộng sự, Trẻ hóa Res. 2011 14:491-500; Liu và cộng sự 2013 9:106-118; toàn bộ của chúng). Sự biểu hiện của các biến thể Apo A-I có liên quan đến việc giảm cholesterol (deGoma và Rader, 2011 Nature Rev Cardiol 8:266-271; Nissen và cộng sự, 2003 JAMA 290:2292-2300; tất cả được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ). Trình tự axit amin của ApoA-I ở một số quần thể nhất định đã được đổi thành cysteine ở Apo A-I Milano (Arg 173 đổi thành Cys) và ở Apo A-I Paris (Arg 151 đổi thành Cys). Đột biến yếu tố IX ở vị trí R338 L (FIX Padua) tạo ra protein Yếu tố IX có hoạt tính tăng gấp 10 lần (Simioni và cộng sự, N Engl J Med. 2009 361:1671-1675; Finn và cộng sự, Blood. 2012 120:4521-4523; Cantore và cộng sự, Blood 2012 120:4517-20; tất cả được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ). Đột biến của transthyretin ở vị trí 104 hoặc 119 (Arg104 His, Thr 119Met) đã được chứng minh là mang lại sự bảo vệ cho những bệnh nhân cũng mang mầm bệnh gây ra đột biến Val30Met (Saraiva, Hum Mutat. 2001 17:493-503; CƠ SỞ DỮ LIỆU VỀ ĐỘT BIẾN TRANSTHYRETIN www. ibmc.up.pt/mjsaraiva/ttrmut.html; tất cả được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ). Sự khác biệt về biểu hiện lâm sàng và mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng ở bệnh nhân Met 30 của Bồ Đào Nha và Nhật Bản mang đột biến Met 119 và His104 tương ứng được quan sát thấy với tác dụng bảo vệ rõ ràng do đột biến không gây bệnh gây ra (Coelho và cộng sự 1996 Rối loạn thần kinh cơ (Bổ sung) 6: S20; Terazaki và cộng sự 1999. Biochem Biophys Res Commun 264: 365-370; tất cả được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ), mang lại độ ổn định cao hơn cho phân tử. Một mRNA biến đổi mã hóa các alen TTR bảo vệ này có thể được biểu hiện ở những bệnh nhân mắc bệnh amyloidosis TTR, do đó làm giảm tác dụng của protein TTR đột biến gây bệnh.
Đối tác tương tác chính của Groove
Như được mô tả ở đây, cụm từ “đối tác tương tác rãnh chính” dùng để chỉ các thụ thể nhận biết ARN phát hiện và phản ứng với các phối tử ARN thông qua các tương tác, ví dụ: liên kết, với mặt rãnh chính của nucleotit hoặc axit nucleic. Như vậy, các phối tử ARN bao gồm các nucleotit hoặc axit nucleic biến đổi như polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN như được mô tả ở đây làm giảm tương tác với các đối tác liên kết rãnh chính, và do đó làm giảm đáp ứng miễn dịch bẩm sinh.
Ví dụ về tương tác rãnh chính, ví dụ: ràng buộc, các đối tác bao gồm nhưng không giới hạn ở các nuclease và helicase sau đây. Trong màng, TLR (Thụ thể giống Toll) 3, 7 và 8 có thể phản ứng với các RNA chuỗi đơn và chuỗi kép. Trong tế bào chất, các thành viên của siêu họ 2 helicase DEX(D/H) và ATPase có thể cảm nhận được các RNA để bắt đầu phản ứng kháng virus. Những helicase này bao gồm RIG-I (gen cảm ứng axit retinoic I) và MDA5 (gen liên quan đến biệt hóa khối u ác tính 5). Các ví dụ khác bao gồm phòng thí nghiệm di truyền và sinh lý học 2 (LGP2), miền HIN-200 chứa protein hoặc miền chứa protein Helicase.
Nhắm mục tiêu các sinh vật gây bệnh hoặc tế bào bị bệnh
Sáng chế đề xuất phương pháp nhắm mục tiêu vào các vi sinh vật gây bệnh, như vi khuẩn, nấm men, động vật nguyên sinh, giun sán và các loại tương tự, hoặc các tế bào bị bệnh như tế bào ung thư sử dụng polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmARN mã hóa polypeptit gây độc tế bào hoặc kìm tế bào. Tốt hơn là mARN được đưa vào chứa các nucleoside biến đổi hoặc các biến đổi trình tự axit nucleic khác được dịch mã riêng, hoặc tốt hơn là, trong sinh vật gây bệnh đích, để làm giảm tác dụng ngoài mục tiêu có thể có của phương pháp điều trị. Các phương pháp như vậy rất hữu ích trong việc loại bỏ các sinh vật gây bệnh hoặc tiêu diệt các tế bào bị bệnh có trong bất kỳ vật liệu sinh học nào, bao gồm máu, tinh dịch, trứng và các vật liệu cấy ghép bao gồm phôi, mô và các cơ quan.
Xử lý sinh học
Các phương pháp được đề xuất ở đây có thể hữu ích để nâng cao hiệu suất sản phẩm protein trong quy trình nuôi cấy tế bào. Trong môi trường nuôi cấy tế bào chứa nhiều tế bào chủ, việc đưa polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được mô tả ở đây làm tăng hiệu quả sản xuất protein so với axit nucleic không biến đổi tương ứng. Hiệu suất sản xuất protein tăng lên như vậy có thể được chứng minh, ví dụ, bằng cách thể hiện sự thay đổi tế bào tăng lên, sự dịch mã protein từ polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA tăng lên, giảm sự thoái biến axit nucleic, và/hoặc giảm phản ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào chủ. Việc sản xuất protein có thể được đo bằng thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA), và hoạt tính của protein có thể được đo bằng các thử nghiệm chức năng khác nhau đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Việc sản xuất protein có thể được tạo ra trong quá trình động vật có vú được cho ăn liên tục hoặc theo đợt.
Ngoài ra, sẽ hữu ích khi tối ưu hóa sự biểu hiện của polypeptit cụ thể trong dòng tế bào hoặc tập hợp các dòng tế bào được quan tâm, đặc biệt là polypeptit được quan tâm như biến thể protein của protein tham chiếu có hoạt tính đã biết. Theo một phương án, sáng chế đề xuất phương pháp tối ưu hóa sự biểu hiện polypeptit cần quan tâm ở tế bào đích, bằng cách tạo ra nhiều loại tế bào đích, và cho mỗi loại tế bào đích tiếp xúc độc lập với một polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mã hóa mmRNA. một polypeptide được quan tâm. Các tế bào có thể được chuyển nhiễm hai hoặc nhiều polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA đồng thời hoặc tuần tự.
Theo các phương án nhất định, có thể sử dụng nhiều vòng phương pháp được mô tả ở đây để thu được các tế bào có mức biểu hiện tăng lên của một hoặc nhiều axit nucleic hoặc protein quan tâm. Ví dụ, tế bào có thể được chuyển nhiễm một hoặc nhiều polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN mã hóa axit nucleic hoặc protein quan tâm. Các tế bào có thể được phân lập theo các phương pháp được mô tả ở đây trước khi trải qua các đợt chuyển nhiễm tiếp theo với một hoặc nhiều axit nucleic khác mà mã hóa axit nucleic hoặc protein quan tâm trước khi được phân lập lại. Phương pháp này có thể hữu ích để tạo ra các tế bào có mức độ biểu hiện tăng lên của phức hợp protein, axit nucleic hoặc protein theo cùng một con đường sinh học hoặc có liên quan, các axit nucleic hoặc các protein hoạt động ngược dòng hoặc xuôi dòng của nhau, axit nucleic hoặc protein có chức năng điều biến. , kích hoạt hoặc ức chế chức năng với nhau, axit nucleic hoặc protein phụ thuộc lẫn nhau về chức năng hoặc hoạt động, hoặc axit nucleic hoặc protein có chung đặc điểm tương đồng.
Ngoài ra, điều kiện nuôi cấy có thể được thay đổi để tăng hiệu quả sản xuất protein. Sau đó, sự có mặt và/hoặc mức polypeptit quan tâm ở nhiều loại tế bào đích được phát hiện và/hoặc định lượng, cho phép tối ưu hóa sự biểu hiện của polypeptit bằng cách chọn tế bào đích hiệu quả và các điều kiện nuôi cấy tế bào liên quan đến chúng. Các phương pháp như vậy đặc biệt hữu ích khi polypeptit chứa một hoặc nhiều biến đổi sau dịch mã hoặc có cấu trúc bậc ba đáng kể, các tình huống thường làm phức tạp quá trình sản xuất protein hiệu quả.
Theo một phương án, các tế bào được sử dụng trong các phương pháp của sáng chế có thể được nuôi cấy. Các tế bào có thể được nuôi cấy ở dạng huyền phù hoặc dưới dạng nuôi cấy bám dính. Các tế bào có thể được nuôi cấy trong nhiều loại bình bao gồm, nhưng không giới hạn ở, lò phản ứng sinh học, túi tế bào, túi tạo sóng, đĩa nuôi cấy, bình và các bình khác đã được biết rõ đối với những người có hiểu biết trung bình trong lĩnh vực kỹ thuật này. Tế bào có thể được nuôi cấy trong IMDM (Invitrogen, Số danh mục 12440-53) hoặc bất kỳ môi trường phù hợp nào khác bao gồm nhưng không giới hạn ở các công thức môi trường được xác định về mặt hóa học. Các điều kiện môi trường xung quanh có thể thích hợp cho nuôi cấy tế bào, như nhiệt độ và thành phần khí quyển, đã được những người có hiểu biết trung bình trong lĩnh vực này biết rõ. Các phương pháp theo sáng chế có thể được sử dụng với tế bào bất kỳ thích hợp để sử dụng trong quá trình sản xuất protein.
Sáng chế đề xuất việc đưa lặp lại (ví dụ, chuyển nhiễm) axit nucleic đã biến đổi vào quần thể tế bào đích, ví dụ, in vitro, ex vivo, in situ, hoặc in vivo. Ví dụ: việc liên hệ với cùng một quần thể tế bào có thể được lặp lại một hoặc nhiều lần (chẳng hạn như hai, ba, bốn, năm hoặc nhiều hơn năm lần). Theo một số phương án, bước cho quần thể tế bào tiếp xúc với các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được lặp lại một số lần đủ để đạt được hiệu quả dịch mã protein xác định trước trong quần thể tế bào. Do độc tính tế bào của quần thể tế bào đích thường giảm do các biến đổi axit nucleic mang lại, nên việc chuyển nhiễm lặp lại có thể đạt được ở nhiều loại tế bào và trong nhiều loại mô khác nhau, như được đề xuất ở đây.
Theo một phương án, các phương pháp xử lý sinh học theo sáng chế có thể được sử dụng để tạo ra kháng thể hoặc các đoạn chức năng của chúng. Các mảnh chức năng có thể bao gồm Fab, Fab′, F(ab′)2, miền Fv, scFv hoặc tiểu đường. Chúng có thể thay đổi ở bất kỳ vùng nào kể cả vùng xác định bổ thể (CDR). Theo một phương án, có sự đa dạng hoàn toàn ở vùng CDR3. Theo một phương án khác, kháng thể này về cơ bản được bảo tồn ngoại trừ ở vùng CDR3.
Các kháng thể có thể được tạo ra để liên kết hoặc liên kết với bất kỳ phân tử sinh học nào, dù có nguồn gốc từ con người, gây bệnh hay không phải con người. Mầm bệnh có thể hiện diện ở động vật có vú không phải ở người, mẫu bệnh phẩm hoặc từ sản phẩm thương mại như mỹ phẩm hoặc dược phẩm. Chúng cũng có thể liên kết với bất kỳ mẫu vật hoặc mẫu nào bao gồm các mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu mô từ bất kỳ sinh vật nào.
Theo một số phương án, bước tiếp xúc được lặp lại nhiều lần với tần suất được chọn từ nhóm bao gồm: 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ, và 108 giờ và tại nồng độ dưới 20 nM, dưới 50 nM, dưới 80 nM hoặc dưới 100 nM. Các chế phẩm cũng có thể được sử dụng ở nồng độ nhỏ hơn 1 mM, nhỏ hơn 5 mM, nhỏ hơn 10 mM, nhỏ hơn 100 mM hoặc nhỏ hơn 500 mM.
Theo một số phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được thêm vào với lượng 50 phân tử trên mỗi tế bào, 100 phân tử/tế bào, 200 phân tử/tế bào, 300 phân tử/tế bào, 400 phân tử/tế bào, 500 phân tử/tế bào, 600 phân tử/ tế bào, 700 phân tử/tế bào, 800 phân tử/tế bào, 900 phân tử/tế bào, 1000 phân tử/tế bào, 2000 phân tử/tế bào hoặc 5000 phân tử/tế bào.
Theo các phương án khác, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được thêm vào ở nồng độ được chọn từ nhóm bao gồm: 0,01 fmol/106 tế bào, 0,1 fmol/106 tế bào, 0,5 fmol/106 tế bào, 0,75 fmol/106 tế bào, 1 fmol/ 106 ô, 2 fmol/106 ô, 5 fmol/106 ô, 10 fmol/106 ô, 20 fmol/106 ô, 30 fmol/106 ô, 40 fmol/106 ô, 50 fmol/106 ô, 60 fmol/106 ô , 100 fmol/106 ô, 200 fmol/106 ô, 300 fmol/106 ô, 400 fmol/106 ô, 500 fmol/106 ô, 700 fmol/106 ô, 800 fmol/106 ô, 900 fmol/106 ô, và 1 giờ chiều/106 tế bào.
Theo một số phương án, quá trình sản xuất sản phẩm sinh học được phát hiện bằng cách theo dõi một hoặc nhiều thông số xử lý sinh học có thể đo lường được, chẳng hạn như thông số được chọn từ nhóm bao gồm: mật độ tế bào, độ pH, mức oxy, mức glucoza, mức axit lactic, nhiệt độ, và sản xuất protein. Việc sản xuất protein có thể được đo lường bằng năng suất riêng (SP) (nồng độ của sản phẩm, chẳng hạn như polypeptide được biểu hiện khác loại, trong dung dịch) và có thể được biểu thị bằng mg/L hoặc g/L; cách khác, năng suất cụ thể có thể được biểu thị bằng pg/ô/ngày. Sự gia tăng SP có thể đề cập đến sự gia tăng tuyệt đối hoặc tương đối về nồng độ của sản phẩm được sản xuất trong hai nhóm điều kiện xác định (ví dụ: khi so sánh với các biện pháp kiểm soát không được xử lý bằng (các) mRNA đã sửa đổi).
Tế bào
Theo một phương án, các tế bào được chọn từ nhóm bao gồm tế bào động vật có vú, tế bào vi khuẩn, tế bào thực vật, vi sinh vật, tảo và nấm. Theo một số phương án, tế bào là tế bào của động vật có vú, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, tế bào người, chuột nhắt, chuột cống, dê, ngựa, thỏ, chuột đồng hoặc bò. Theo một phương án khác, các tế bào này có thể từ dòng tế bào đã được xác lập, bao gồm, nhưng không giới hạn ở, HeLa, NS0, SP2/0, KEK 293T, Vero, Caco, Caco-2, MDCK, COS-1, COS-7 , K562, Jurkat, CHO-K1, DG44, CHOK1SV, CHO—S, Huvec, CV-1, Huh-7, NIH3T3, HEK293, 293, A549, HepG2, EIR-90, MCF-7, U-20S, Per Tế bào buồng trứng .C6, SF9, SF21 hoặc chuột đồng Trung Quốc (CHO).
Theo một số phương án nhất định, tế bào này là tế bào nấm, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở,Chrysosporiumtế bào,Aspergillustế bào,Trichodermatế bào, tế bào Dictyostelium,Candidatế bào,Saccharomycestế bào,Schizosaccharomycestế bào vàPenicilliumtế bào.
Theo một số phương án nhất định, tế bào này là tế bào vi khuẩn như, nhưng không giới hạn ở,E. coli, B. subtilishoặc tế bào BL21. Các tế bào sơ cấp và thứ cấp được chuyển gen bằng các phương pháp theo sáng chế có thể được lấy từ nhiều loại mô khác nhau và bao gồm, nhưng không giới hạn ở tất cả các loại tế bào có thể được duy trì trong nuôi cấy. Ví dụ, các tế bào sơ cấp và thứ cấp có thể được chuyển hóa bằng các phương pháp theo sáng chế bao gồm, nhưng không giới hạn ở, nguyên bào sợi, tế bào sừng, tế bào biểu mô (ví dụ, tế bào biểu mô tuyến vú, tế bào biểu mô ruột), tế bào nội mô, tế bào thần kinh đệm, tế bào thần kinh. tế bào, các thành phần hình thành của máu (ví dụ: tế bào lympho, tế bào tủy xương), tế bào cơ và tiền thân của các loại tế bào soma này. Các tế bào sơ cấp cũng có thể được lấy từ người hiến tặng cùng loài hoặc từ một loài khác (ví dụ: chuột, chuột, thỏ, mèo, chó, lợn, bò, chim, cừu, dê, ngựa).
Thanh lọc và cách ly
Người có hiểu biết trung bình trong lĩnh vực này có thể xác định được phương pháp sử dụng để tinh chế hoặc tách protein cần quan tâm từ tế bào nuôi cấy. Nói chung, điều này được thực hiện thông qua phương pháp bắt giữ bằng cách sử dụng liên kết ái lực hoặc tinh lọc không ái lực. Nếu protein quan tâm không được tiết ra bởi các tế bào nuôi cấy thì việc ly giải tế bào nuôi cấy phải được thực hiện trước khi tinh chế hoặc phân lập. Người ta có thể sử dụng dịch nuôi cấy tế bào chưa được làm rõ có chứa protein quan tâm cùng với các thành phần môi trường nuôi cấy tế bào cũng như các chất phụ gia nuôi cấy tế bào, chẳng hạn như hợp chất chống tạo bọt và các chất dinh dưỡng và chất bổ sung khác, tế bào, mảnh vụn tế bào, protein tế bào chủ, DNA, vi rút và tương tự như trong sáng chế này. Quá trình này có thể được tiến hành trong chính lò phản ứng sinh học. Chất lỏng có thể được điều hòa trước một kích thích mong muốn như pH, nhiệt độ hoặc đặc tính kích thích khác hoặc chất lỏng có thể được điều hòa khi bổ sung (các) polyme hoặc (các) polyme có thể được thêm vào chất lỏng mang được điều hòa thích hợp đến tham số cần thiết cho điều kiện kích thích cần thiết để polyme đó hòa tan trong chất lỏng. Polyme có thể được phép lưu thông triệt để với chất lỏng và sau đó tác nhân kích thích có thể được áp dụng (thay đổi độ pH, nhiệt độ, nồng độ muối, v.v.) và kết tủa protein và polyme mong muốn có thể ra khỏi dung dịch. Polyme và (các) protein mong muốn có thể được tách ra khỏi phần còn lại của chất lỏng và tùy ý rửa một hoặc nhiều lần để loại bỏ bất kỳ chất gây ô nhiễm nào bị mắc kẹt hoặc liên kết lỏng lẻo. Sau đó, protein mong muốn có thể được thu hồi từ (các) polyme bằng cách, ví dụ, rửa giải và tương tự. Tốt hơn là, việc rửa giải có thể được thực hiện trong một tập hợp các điều kiện sao cho polyme vẫn ở dạng kết tủa và giữ lại bất kỳ tạp chất nào trong đó trong quá trình rửa giải đã chọn của protein mong muốn. Polyme và protein cũng như bất kỳ tạp chất nào có thể được hòa tan trong chất lỏng mới như nước hoặc dung dịch đệm và protein có thể được thu hồi bằng các phương pháp như ái lực, trao đổi ion, kỵ nước hoặc một số loại sắc ký khác có ưu tiên và tính chọn lọc của protein so với polyme hoặc tạp chất. Sau đó, protein được rửa giải có thể được thu hồi và có thể được thực hiện các bước xử lý bổ sung, hoặc là các bước xử lý theo mẻ hoặc cho chảy liên tục qua các bước nếu thích hợp.
Theo một phương án khác, có thể hữu ích khi tối ưu hóa sự biểu hiện của polypeptit cụ thể trong dòng tế bào hoặc tập hợp các dòng tế bào được quan tâm, đặc biệt là polypeptit được quan tâm như biến thể protein của protein tham chiếu có hoạt tính đã biết. Theo một phương án, sáng chế đề xuất phương pháp tối ưu hóa sự biểu hiện polypeptit cần quan tâm ở tế bào đích, bằng cách tạo ra nhiều loại tế bào đích, và cho mỗi loại tế bào đích tiếp xúc độc lập với mARN biến đổi mã hóa polypeptit. Ngoài ra, điều kiện nuôi cấy có thể được thay đổi để tăng hiệu quả sản xuất protein. Sau đó, sự có mặt và/hoặc mức polypeptit quan tâm ở nhiều loại tế bào đích được phát hiện và/hoặc định lượng, cho phép tối ưu hóa sự biểu hiện polypeptit quan tâm bằng cách chọn tế bào đích hiệu quả và các điều kiện nuôi cấy tế bào liên quan đến chúng. . Các phương pháp như vậy có thể hữu ích khi polypeptit quan tâm chứa một hoặc nhiều biến đổi sau dịch mã hoặc có cấu trúc bậc ba đáng kể, thường làm phức tạp quá trình sản xuất protein hiệu quả.
Phục hồi protein
Tốt hơn là, protein quan tâm có thể được thu hồi từ môi trường nuôi cấy dưới dạng polypeptide được tiết ra, hoặc nó có thể được thu hồi từ dịch phân giải tế bào chủ nếu được biểu hiện mà không có tín hiệu bài tiết. Có thể cần phải tinh chế protein quan tâm từ các protein tái tổ hợp khác và protein của tế bào chủ theo cách thu được các chế phẩm về cơ bản đồng nhất của protein quan tâm. Các tế bào và/hoặc mảnh vụn tế bào có thể được loại bỏ khỏi môi trường nuôi cấy hoặc dịch ly giải. Sau đó, sản phẩm quan tâm có thể được tinh chế khỏi các protein hòa tan, polypeptide và axit nucleic gây ô nhiễm bằng cách, ví dụ, phân đoạn trên cột ái lực miễn dịch hoặc cột trao đổi ion, kết tủa ethanol, HPLC pha đảo (RP-HPLC), sắc ký SEPHADEX®, sắc ký trên silica hoặc trên nhựa trao đổi cation như DEAE. Các phương pháp tinh chế protein khác loại được biểu hiện bằng tế bào chủ là đã biết rõ trong lĩnh vực kỹ thuật này.
Các phương pháp và chế phẩm được mô tả ở đây có thể được sử dụng để tạo ra các protein có khả năng làm giảm hoặc ngăn chặn phản ứng sinh học của chất chủ vận nội sinh và/hoặc đối kháng thụ thể hoặc phân tử tín hiệu ở đối tượng động vật có vú. Ví dụ, tín hiệu của thụ thể IL-12 và IL-23 có thể được tăng cường trong các rối loạn tự miễn dịch mãn tính như bệnh đa xơ cứng và các bệnh viêm nhiễm như viêm khớp dạng thấp, bệnh vẩy nến, bệnh lupus ban đỏ, viêm cột sống dính khớp và bệnh Chron (Kikly K, Liu L, Na S). , Sedgwich J D (2006) Ý kiến. Theo một phương án khác, axit nucleic mã hóa chất đối kháng thụ thể chemokine. Các thụ thể chemokine CXCR-4 và CCR-5 cần thiết để HIV xâm nhập vào tế bào chủ (Arenzana-Seisdedos F et al, (1996) Nature. 3 tháng 10; 383 (6599):400).
Làm im lặng gen
Các polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA được mô tả ở đây rất hữu ích để làm im lặng sự biểu hiện (tức là ngăn chặn hoặc làm giảm đáng kể) sự biểu hiện của một hoặc nhiều gen mục tiêu trong quần thể tế bào. Polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA mã hóa polypeptit quan tâm có khả năng điều khiển quá trình metyl hóa histon H3 đặc hiệu theo trình tự được đưa vào các tế bào trong quần thể trong các điều kiện sao cho polypeptit được dịch mã và làm giảm quá trình phiên mã gen của gen mục tiêu thông qua quá trình metyl hóa histon H3 và sự hình thành chất dị nhiễm sắc tiếp theo. Theo một số phương án, cơ chế làm im lặng được thực hiện trên quần thể tế bào có ở đối tượng động vật có vú. Bằng ví dụ không giới hạn, gen mục tiêu hữu ích là thành viên họ Janus Kinase-2 bị đột biến, trong đó đối tượng động vật có vú biểu hiện gen mục tiêu đột biến mắc bệnh tăng sinh tủy do hoạt động kinaza bất thường.
Việc sử dụng đồng thời các polynucleotit, cấu trúc bậc một và tác nhân mmRNA và RNAi cũng được đề xuất ở đây.
Điều chế các con đường sinh học
Các polynucleotide dịch mã nhanh, các cấu trúc sơ cấp và mmRNA được đưa vào tế bào mang lại một cơ chế mong muốn để điều chỉnh các con đường sinh học mục tiêu. Sự điều chế như vậy bao gồm sự đối kháng hoặc chủ nghĩa chủ nghĩa của một con đường nhất định. Theo một phương án, sáng chế đề xuất phương pháp đối kháng con đường sinh học trong tế bào bằng cách cho tế bào tiếp xúc với lượng hữu hiệu của chế phẩm chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN mã hóa polypeptit cần quan tâm, trong các điều kiện sao cho polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA được định vị vào trong tế bào và polypeptit có khả năng được dịch mã trong tế bào từ các polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA, trong đó polypeptit ức chế hoạt tính của polypeptit có chức năng trong con đường sinh học. Các con đường sinh học được lấy làm ví dụ là các con đường khiếm khuyết trong rối loạn tự miễn dịch hoặc rối loạn viêm như bệnh đa xơ cứng, viêm khớp dạng thấp, bệnh vẩy nến, bệnh lupus ban đỏ, viêm đại tràng viêm cột sống dính khớp, hoặc bệnh Crohn; đặc biệt, sự đối kháng của các đường truyền tín hiệu IL-12 và IL-23 có ích đặc biệt. (Xem Kikly K, Liu L, Na S, Sedgwick J D (2006) Curr. Opin. Immunol. 18 (6): 670-5).
Hơn nữa, đề xuất là polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN mã hóa chất đối kháng thụ thể chemokine; Các thụ thể chemokine CXCR-4 và CCR-5 là cần thiết cho sự xâm nhập của HIV vào tế bào chủ (Arenzana-Seisdedos F et al, (1996) Nature. 3 tháng 10; 383(6599):400).
Ngoài ra, sáng chế đề xuất các phương pháp kích thích con đường sinh học trong tế bào bằng cách cho tế bào tiếp xúc với lượng hữu hiệu của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA mã hóa polypeptit tái tổ hợp trong các điều kiện sao cho axit nucleic được định vị vào tế bào và polypeptit tái tổ hợp được định vị trong tế bào. có khả năng được dịch mã từ axit nucleic vào tế bào, và polypeptit tái tổ hợp tạo ra hoạt tính của polypeptit có chức năng trong con đường sinh học. Các con đường sinh học gây đau được lấy làm ví dụ bao gồm các con đường điều biến việc xác định số phận của tế bào. Sự đau đớn như vậy có thể đảo ngược hoặc nói cách khác là không thể đảo ngược.
Biểu hiện phối tử hoặc thụ thể trên bề mặt tế bào
Theo một số khía cạnh và phương án về các khía cạnh được mô tả ở đây, các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA được mô tả ở đây có thể được sử dụng để biểu hiện phối tử hoặc thụ thể phối tử trên bề mặt của tế bào (ví dụ, gốc dẫn đường). Phối tử hoặc phần thụ thể phối tử được gắn vào bề mặt tế bào có thể cho phép tế bào có được tương tác sinh học mong muốn với mô hoặc tác nhân in vivo. Phối tử có thể là kháng thể, đoạn kháng thể, aptamer, peptit, vitamin, cacbohydrat, protein hoặc polypeptit, thụ thể, ví dụ, thụ thể trên bề mặt tế bào, phân tử bám dính, glycoprotein, gốc đường, tác nhân trị liệu, thuốc, glycosaminoglycan, hoặc bất kỳ sự kết hợp nào của chúng. Ví dụ, phối tử có thể là kháng thể nhận biết kháng nguyên đặc hiệu của tế bào ung thư, làm cho tế bào có khả năng tương tác ưu tiên với các tế bào khối u để cho phép định vị đặc hiệu khối u của tế bào được biến đổi. Phối tử có thể mang lại khả năng tích tụ thành phần tế bào trong mô cần xử lý, vì phối tử được ưu tiên có thể có khả năng tương tác với phân tử đích trên mặt ngoài của mô cần xử lý. Các phối tử có khả năng phản ứng chéo hạn chế với các mô khác thường được ưu tiên hơn.
Trong một số trường hợp, phối tử có thể hoạt động như một nhóm dẫn đường cho phép tế bào hướng tới mô cụ thể hoặc tương tác với phối tử cụ thể. Các gốc dẫn truyền như vậy có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, bất kỳ thành viên nào của cặp liên kết cụ thể, kháng thể, kháng thể đơn dòng, hoặc dẫn xuất hoặc chất tương tự của chúng, bao gồm nhưng không giới hạn ở: đoạn Fv, đoạn Fv chuỗi đơn (scFv), đoạn Fab′, đoạn F(ab′)2, kháng thể miền đơn, kháng thể lạc đà và đoạn kháng thể, kháng thể được làm tương thích với người và đoạn kháng thể, và dạng đa hóa trị của các loại trên; thuốc thử liên kết đa hóa trị bao gồm nhưng không giới hạn: kháng thể đơn đặc hiệu hoặc đặc hiệu kép, chẳng hạn như đoạn Fv được ổn định bằng disulfua, đoạn scFv song song ((SCFV)2), thể hai thể, thể ba hoặc tứ thể, thường được liên kết cộng hóa trị hoặc được ổn định theo cách khác (tức là, dây kéo hoặc chuỗi xoắn leucine được ổn định) các đoạn scFv; và các gốc dẫn đường khác bao gồm ví dụ, aptamer, thụ thể, và protein dung hợp.
Theo một số phương án, nhóm dẫn đường có thể là kháng thể gắn kết bề mặt, có thể cho phép điều chỉnh tính đặc hiệu nhắm mục tiêu tế bào. Điều này đặc biệt hữu ích vì các kháng thể đặc hiệu cao có thể được tạo ra để chống lại một epitop quan tâm đối với vị trí nhắm mục tiêu mong muốn. Theo một phương án, nhiều kháng thể được biểu hiện trên bề mặt của tế bào và mỗi kháng thể có thể có độ đặc hiệu khác nhau đối với mục tiêu mong muốn. Những cách tiếp cận như vậy có thể làm tăng tính hấp dẫn và tính đặc hiệu của các tương tác dẫn đường.
Một nghệ nhân lành nghề có thể chọn bất kỳ phân tử dẫn đường nào dựa trên vị trí hoặc chức năng mong muốn của tế bào, ví dụ như phối tử thụ thể estrogen, chẳng hạn như tamoxifen, có thể nhắm mục tiêu các tế bào đến các tế bào ung thư vú phụ thuộc estrogen có số lượng thụ thể estrogen tăng lên trên bề mặt tế bào. Các ví dụ không giới hạn khác về tương tác phối tử/thụ thể bao gồm CCRI (ví dụ, để điều trị các mô khớp hoặc não bị viêm trong bệnh viêm khớp dạng thấp và/hoặc bệnh đa xơ cứng), CCR7, CCR8 (ví dụ, nhắm mục tiêu vào mô hạch bạch huyết), CCR6, CCR9 , CCR10 (ví dụ: để nhắm mục tiêu đến mô ruột), CCR4, CCR10 (ví dụ: để nhắm mục tiêu vào da), CXCR4 (ví dụ: để tăng cường khả năng di chuyển nói chung), HCELL (ví dụ: để điều trị chứng viêm và rối loạn viêm, tủy xương), Alpha4beta7 (ví dụ: nhắm mục tiêu vào niêm mạc ruột), VLA-4/VCAM-1 (ví dụ: nhắm mục tiêu vào nội mô). Nói chung, thụ thể bất kỳ liên quan đến việc nhắm đích (ví dụ, sự di căn của ung thư) có thể được khai thác để sử dụng trong các phương pháp và chế phẩm được mô tả ở đây.
Điều chế dòng tế bào
Sáng chế đề xuất các phương pháp gây ra sự thay đổi số phận tế bào ở tế bào động vật có vú đích. Tế bào động vật có vú đích có thể là tế bào tiền thân và sự biến đổi này có thể liên quan đến việc thúc đẩy quá trình biệt hóa thành một dòng hoặc ngăn chặn sự biệt hóa đó. Theo cách khác, tế bào động vật có vú đích có thể là một tế bào đã biệt hóa, và việc thay đổi số phận tế bào bao gồm việc thúc đẩy quá trình khử biệt hóa thành tế bào tiền thân đa năng, hoặc ngăn chặn quá trình khử biệt hóa như vậy, chẳng hạn như quá trình khử biệt hóa của các tế bào ung thư thành tế bào gốc ung thư. Trong các trường hợp mong muốn thay đổi số phận tế bào, lượng mARN hiệu quả mã hóa polypeptit cảm ứng số phận tế bào được đưa vào tế bào đích trong các điều kiện sao cho gây ra sự thay đổi số phận tế bào. Theo một số phương án, các mARN biến đổi này rất hữu ích để lập trình lại một quần thể con tế bào từ kiểu hình thứ nhất sang kiểu hình thứ hai. Việc lập trình lại như vậy có thể là tạm thời hoặc vĩnh viễn.
Tùy ý, việc lập trình lại sẽ khiến ô đích tiếp nhận kiểu hình trung gian.
Ngoài ra, các phương pháp theo sáng chế đặc biệt hữu ích để tạo ra các tế bào gốc đa năng cảm ứng (tế bào iPS) do hiệu quả chuyển nhiễm cao, khả năng tái truyền nhiễm tế bào và khả năng bền vững của lượng polypeptit tái tổ hợp được tạo ra ở đích. tế bào. Hơn nữa, việc sử dụng các tế bào iPS được tạo ra bằng cách sử dụng các phương pháp được mô tả ở đây dự kiến sẽ làm giảm tỷ lệ hình thành u quái.
Sáng chế cũng đề xuất các phương pháp làm giảm sự biệt hóa tế bào trong quần thể tế bào đích. Ví dụ, quần thể tế bào đích chứa một hoặc nhiều loại tế bào tiền thân được tiếp xúc với chế phẩm có lượng polynucleotit, cấu trúc bậc một và mmRNA mã hóa polypeptit, trong các điều kiện sao cho polypeptit được dịch mã và làm giảm sự biệt hóa của tiền chất tế bào. Theo các phương án không giới hạn, quần thể tế bào đích chứa mô bị tổn thương ở đối tượng là động vật có vú hoặc mô bị ảnh hưởng bởi quy trình phẫu thuật. Tế bào tiền thân là, ví dụ, tế bào tiền thân cơ địa, tế bào tiền thân thần kinh, hoặc tế bào tiền thân trung mô.
Theo một phương án cụ thể, sáng chế đề xuất polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA mã hóa một hoặc nhiều yếu tố biệt hóa Gata4, Mef2c và Tbx4. Các yếu tố do mRNA tạo ra này được đưa vào nguyên bào sợi và thúc đẩy quá trình tái lập trình thành tế bào cơ tim. Việc lập trình lại như vậy có thể được thực hiện in vivo, bằng cách cho miếng vá có chứa mRNA hoặc vật liệu khác tiếp xúc với mô tim bị tổn thương để tạo điều kiện tái tạo tim. Quá trình như vậy thúc đẩy quá trình hình thành tế bào cơ tim thay vì xơ hóa.
Hòa giải cái chết của tế bào
Theo một phương án, polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc chế phẩm mmRNA có thể được sử dụng để tạo ra quá trình chết theo chương trình trong tế bào (ví dụ, tế bào ung thư) bằng cách làm tăng sự biểu hiện của thụ thể chết, phối tử thụ thể chết hoặc tổ hợp của chúng. Phương pháp này có thể được sử dụng để gây chết tế bào ở bất kỳ tế bào mong muốn nào và đặc biệt hữu ích trong điều trị ung thư khi tế bào thoát khỏi các tín hiệu chết theo chương trình tự nhiên.
Apoptosis có thể được gây ra bởi nhiều con đường truyền tín hiệu độc lập hội tụ theo cơ chế tác động cuối cùng bao gồm nhiều tương tác giữa một số “thụ thể tử vong” và các phối tử của chúng, thuộc về siêu họ thụ thể/phối tử của yếu tố hoại tử khối u (TNF). Các thụ thể tử vong có đặc điểm tốt nhất là CD95 (“Fas”), TNFRI (p55), thụ thể tử vong 3 (DR3 hoặc Apo3/TRAMO), DR4 và DR5 (apo2-TRAIL-R2). Cơ chế tác động cuối cùng của quá trình apoptosis có thể là sự kích hoạt một loạt proteinase được gọi là caspase. Việc kích hoạt các caspase này dẫn đến sự phân cắt một loạt protein quan trọng của tế bào và làm chết tế bào. Cơ chế phân tử của quá trình chết theo chương trình do các thụ thể/phối tử gây ra đã được biết rõ trong lĩnh vực kỹ thuật này. Ví dụ, apoptosis qua trung gian Fas/FasL được tạo ra bằng cách liên kết ba phân tử FasL, tạo ra sự điều chỉnh của thụ thể Fas thông qua các miền chết ở đầu C (DD), từ đó tuyển dụng protein tiếp hợp FADD (protein liên kết với Fas với miền chết) và Caspase-8. Quá trình oligome hóa phức hợp ba phân tử này, Fas/FAIDD/caspase-8, dẫn đến sự phân cắt proenzym caspase-8 thành caspase-8 hoạt động, từ đó bắt đầu quá trình apoptosis bằng cách kích hoạt các caspase xuôi dòng khác thông qua quá trình phân giải protein, bao gồm cả caspase-3 . Các phối tử chết nói chung là apoptotic khi được hình thành thành các bộ phận hoặc bậc cấu trúc cao hơn. Là các monome, chúng có thể đóng vai trò là tác nhân chống apoptotic bằng cách cạnh tranh với các chất cắt để liên kết với các thụ thể tử vong.
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc thành phần mmRNA mã hóa cho thụ thể chết (ví dụ, Fas, TRAIL, TRAMO, TNFR, TLR, v.v.). Các tế bào được tạo ra để biểu hiện thụ thể chết bằng cách chuyển nhiễm các polynucleotide, cấu trúc sơ cấp và mmRNA trở nên dễ bị chết do phối tử kích hoạt thụ thể đó. Tương tự, các tế bào được tạo ra để biểu hiện phối tử chết, ví dụ, trên bề mặt của chúng, sẽ khiến các tế bào có thụ thể chết khi tế bào được chuyển nhiễm tiếp xúc với tế bào đích. Theo một phương án khác, các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp và thành phần mmRNA mã hóa cho phối tử thụ thể tử vong (ví dụ, FasL, TNF, v.v.). Theo một phương án khác, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và chế phẩm mmARN mã hóa caspase (ví dụ, caspase 3, caspase 8, caspase 9, v.v.). Trong trường hợp các tế bào ung thư thường biểu hiện là không thể phân biệt chính xác với dạng tăng sinh không tăng sinh hoặc tăng sinh có kiểm soát, thì theo một phương án khác, tổng hợp, polynucleotit, cấu trúc sơ cấp và thành phần mmRNA mã hóa cho cả thụ thể chết và phối tử kích hoạt thích hợp của nó. Theo một phương án khác, thành phần tổng hợp, polynucleotit, cấu trúc sơ cấp và mmRNA mã hóa yếu tố biệt hóa mà khi được biểu hiện trong tế bào ung thư, chẳng hạn như tế bào gốc ung thư, sẽ cảm ứng tế bào biệt hóa thành kiểu hình không gây bệnh hoặc không tự làm mới (ví dụ: giảm tốc độ tăng trưởng tế bào, giảm phân chia tế bào, v.v.) hoặc khiến tế bào chuyển sang giai đoạn tế bào không hoạt động (ví dụ: giai đoạn nghỉ).
Người có hiểu biết trung bình trong lĩnh vực kỹ thuật này sẽ đánh giá cao rằng việc sử dụng các kỹ thuật gây ra apoptosis có thể yêu cầu các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA được nhắm mục tiêu thích hợp, ví dụ, các tế bào khối u để ngăn chặn tình trạng chết tế bào trên diện rộng không mong muốn. Do đó, người ta có thể sử dụng cơ chế phân phối (ví dụ, phối tử hoặc kháng thể gắn vào, liposome nhắm mục tiêu, v.v.) để nhận biết kháng nguyên ung thư sao cho các polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA chỉ được biểu hiện trong tế bào ung thư.
Ứng dụng mỹ phẩm
Theo một phương án, các polynucleotit, cấu trúc bậc một và/hoặc mmARN có thể được sử dụng để điều trị, cải thiện hoặc phòng ngừa các tình trạng bệnh lý về thẩm mỹ. Những tình trạng như vậy bao gồm mụn trứng cá, bệnh rosacea, sẹo, nếp nhăn, bệnh chàm, bệnh zona, bệnh vẩy nến, đốm đồi mồi, vết bớt, da khô, vết chai, phát ban (ví dụ: tã lót, nhiệt), ghẻ, nổi mề đay, mụn cóc, côn trùng cắn, bạch biến, gàu, tàn nhang và các dấu hiệu lão hóa nói chung.
VI. Bộ dụng cụ và thiết bị Bộ dụng cụ
Sáng chế đề xuất nhiều bộ dụng cụ khác nhau để thực hiện các phương pháp theo sáng chế một cách thuận tiện và/hoặc hiệu quả. Thông thường, bộ dụng cụ sẽ bao gồm đủ số lượng và/hoặc số lượng thành phần để cho phép người dùng thực hiện nhiều phương pháp điều trị cho (các) đối tượng và/hoặc thực hiện nhiều thử nghiệm.
Theo một khía cạnh, sáng chế đề xuất các kit chứa các phân tử (polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA) theo sáng chế. Theo một phương án, bộ này bao gồm một hoặc nhiều kháng thể chức năng hoặc đoạn chức năng của nó.
Các bộ dụng cụ này có thể dùng để sản xuất protein, bao gồm polynucleotit thứ nhất, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bao gồm vùng có thể dịch mã. Kit này còn có thể bao gồm bao bì và hướng dẫn và/hoặc chất phân phối để tạo thành chế phẩm bào chế. Chất phân phối có thể bao gồm nước muối, dung dịch đệm, lipidoid hoặc chất phân phối bất kỳ bộc lộ ở đây.
Theo một phương án, dung dịch đệm có thể bao gồm natri clorua, canxi clorua, phosphat và/hoặc EDTA. Theo một phương án khác, dung dịch đệm có thể bao gồm, nhưng không giới hạn ở, nước muối, nước muối có 2 mM canxi, 5% sucrose, 5% sucrose với 2 mM canxi, 5% Mannitol, 5% Mannitol với 2 mM canxi, Ringer's lactate , natri clorua, natri clorua với 2 mM canxi và mannose (Xem ví dụ: Nhà xuất bản Hoa Kỳ số 20120258046; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn). Theo một phương án khác, dung dịch đệm có thể được kết tủa hoặc có thể được đông khô. Lượng của mỗi thành phần có thể thay đổi để tạo ra các công thức dung dịch đệm đơn giản hoặc dung dịch đệm đơn giản có nồng độ cao hơn, ổn định và có khả năng tái tạo. Các thành phần này cũng có thể được thay đổi để tăng độ ổn định của ARN biến đổi trong dung dịch đệm trong một khoảng thời gian và/hoặc trong nhiều điều kiện khác nhau. Theo một khía cạnh, sáng chế đề xuất các kit để sản xuất protein, bao gồm: polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bao gồm vùng dịch mã, được cung cấp với lượng hữu hiệu để tạo ra lượng protein mong muốn được mã hóa bởi vùng dịch mã khi được đưa vào đích tế bào; polynucleotit thứ hai bao gồm axit nucleic ức chế, được cung cấp với lượng hữu hiệu để ức chế đáng kể phản ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào; và đóng gói và hướng dẫn.
Theo một khía cạnh, sáng chế đề xuất các kit để sản xuất protein, bao gồm polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bao gồm vùng có thể dịch mã, trong đó polynucleotit này thể hiện sự thoái hóa giảm nhờ nucleaza tế bào, cũng như bao bì và hướng dẫn.
Theo một khía cạnh, sáng chế đề xuất các kit để sản xuất protein, bao gồm polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA bao gồm vùng có thể dịch mã, trong đó polynucleotit này biểu hiện sự thoái biến giảm bởi nucleaza tế bào, và tế bào động vật có vú thích hợp để dịch mã vùng có thể dịch mã của axit nucleic đầu tiên.
Theo một phương án, mức Protein C có thể được đo bằng xét nghiệm miễn dịch. Bạn có thể mua và cung cấp xét nghiệm từ bất kỳ nhà cung cấp nào, bao gồm BioMerieux, Inc. (Durham, NC), Abbott Laboratories (Abbott Park, IL), Siemens Medical Solutions USA, Inc. (Malvern, PA), BIOPORTO® Diagnostics A /S (Gentofte, Đan Mạch), USCN® Life Science Inc. (Houston, TX) hoặc Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN). Theo phương án này, thử nghiệm này có thể được sử dụng để đánh giá mức Protein C hoặc dạng hoạt hóa của nó hoặc biến thể được phân phối dưới dạng hoặc để đáp ứng với việc sử dụng phân tử mARN biến đổi.
Thiết bị
Sáng chế đề xuất thiết bị có thể kết hợp các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA mã hóa các polypeptit quan tâm. Các thiết bị này chứa ở dạng công thức ổn định các thuốc thử để tổng hợp polynucleotide ở dạng công thức sẵn có để chuyển ngay đến đối tượng có nhu cầu, chẳng hạn như bệnh nhân. Các ví dụ không giới hạn về polypeptit được quan tâm bao gồm yếu tố tăng trưởng và/hoặc chất kích thích tạo mạch để chữa lành vết thương, kháng sinh peptit để hỗ trợ kiểm soát nhiễm trùng, và kháng nguyên để kích thích nhanh phản ứng miễn dịch đối với vi rút mới được xác định.
Các thiết bị cũng có thể được sử dụng cùng với sáng chế. Theo một phương án, thiết bị được sử dụng để đánh giá mức protein đã được sử dụng ở dạng mARN biến đổi. Thiết bị này có thể bao gồm máu, nước tiểu hoặc xét nghiệm chất lỏng sinh học khác. Nó có thể lớn đến mức bao gồm một nền tảng phòng thí nghiệm trung tâm tự động hoặc một thiết bị nhỏ để bàn phi tập trung. Nó có thể là điểm chăm sóc hoặc một thiết bị cầm tay. Ví dụ, theo phương án này, Protein C hoặc APC có thể được định lượng trước, trong hoặc sau khi xử lý bằng Protein C mã hóa mARN biến đổi (zymogen của nó), APC hoặc bất kỳ biến thể nào của nó. Protein C, còn được gọi là autoprothrobin IIA và yếu tố đông máu XIV là một zymogen, hoặc tiền chất của serine protease, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa đông máu và tạo ra hoạt động tiêu sợi huyết trong cơ thể. Nó được tổng hợp ở gan dưới dạng một polypeptide chuỗi đơn nhưng trải qua quá trình xử lý hậu dịch mã để tạo ra chất trung gian hai chuỗi. Dạng trung gian của Protein C được chuyển đổi thông qua sự phân cắt qua trung gian trobin của peptide 12 gốc từ đầu amino của chuỗi nặng đến phân tử thành dạng hoạt động, được gọi là “protein C hoạt hóa” (APC). Thiết bị này có thể hữu ích trong nỗ lực khám phá thuốc như một xét nghiệm chẩn đoán đồng hành liên quan đến điều trị Protein C hoặc APC chẳng hạn như đối với nhiễm trùng huyết hoặc nhiễm trùng huyết nặng. Trong các nghiên cứu ban đầu, người ta cho rằng APC có khả năng giảm tỷ lệ tử vong trong nhiễm trùng huyết nặng. Theo dòng công việc này, các nghiên cứu lâm sàng đã dẫn đến sự chấp thuận của FDA đối với một hợp chất, drotrecogin alfa hoạt hóa (protein C tái tổ hợp). Tuy nhiên, vào cuối năm 2011, thuốc đã bị rút khỏi bán ở tất cả các thị trường sau kết quả của nghiên cứu PROWESS-SHOCK, cho thấy nghiên cứu này không đáp ứng được mục tiêu chính là giảm đáng kể về mặt thống kê tỷ lệ tử vong do mọi nguyên nhân trong 28 ngày ở bệnh nhân mắc bệnh sốc nhiễm trùng. Sáng chế đề xuất các phân tử mARN biến đổi có thể được sử dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng huyết nặng và nhiễm trùng máu giúp khắc phục các vấn đề trước đây hoặc các vấn đề liên quan đến việc tăng hiệu quả biểu hiện protein ở động vật có vú.
Theo một số phương án, thiết bị này là thiết bị độc lập và có khả năng truy cập từ xa không dây tùy chọn để nhận hướng dẫn tổng hợp và/hoặc phân tích polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA được tạo ra. Thiết bị này có khả năng tổng hợp di động ít nhất một polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA và tốt hơn là số lượng không giới hạn các polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA khác nhau. Theo các phương án nhất định, thiết bị có thể được vận chuyển bởi một hoặc một số ít người. Trong các phương án khác, thiết bị được điều chỉnh kích thước để vừa với mặt bàn hoặc bàn làm việc. Theo các phương án khác, thiết bị được điều chỉnh kích thước để vừa với vali, ba lô hoặc vật có kích thước tương tự. Theo một phương án khác, thiết bị này có thể là thiết bị chăm sóc sức khỏe hoặc thiết bị cầm tay. Theo các phương án khác, thiết bị này được điều chỉnh kích thước để vừa với phương tiện, chẳng hạn như ô tô, xe tải hoặc xe cứu thương, hoặc phương tiện quân sự như xe tăng hoặc xe chở quân. Thông tin cần thiết để tạo ra polypeptide mã hóa mRNA biến đổi cần quan tâm hiện diện trong môi trường máy tính có thể đọc được trong thiết bị.
Theo một phương án, thiết bị có thể được sử dụng để đánh giá mức protein đã được sử dụng ở dạng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA. Thiết bị này có thể bao gồm máu, nước tiểu hoặc xét nghiệm chất lỏng sinh học khác.
Theo một số phương án, thiết bị này có khả năng giao tiếp (ví dụ: giao tiếp không dây) với cơ sở dữ liệu về trình tự axit nucleic và polypeptit. Thiết bị chứa ít nhất một khối mẫu để chèn một hoặc nhiều bình mẫu. Các bình mẫu như vậy có khả năng tiếp nhận bất kỳ số lượng vật liệu nào ở dạng lỏng hoặc dạng khác như DNA mẫu, nucleotide, enzyme, chất đệm và các thuốc thử khác. Các bình chứa mẫu cũng có khả năng được làm nóng và làm mát bằng cách tiếp xúc với khối mẫu. Khối mẫu thường liên lạc với đế thiết bị có một hoặc nhiều bộ điều khiển điện tử cho ít nhất một khối mẫu. Tốt hơn là, khối mẫu chứa mô-đun gia nhiệt, phân tử gia nhiệt này có khả năng làm nóng và/hoặc làm mát bình mẫu và các chất chứa trong đó đến nhiệt độ trong khoảng từ −20 C đến trên +100 C. Đế thiết bị được kết nối với nguồn điện áp như pin hoặc nguồn điện áp bên ngoài. Thiết bị này cũng chứa các phương tiện để lưu trữ và phân phối vật liệu để tổng hợp RNA.
Tùy ý, khối mẫu chứa mô đun để tách axit nucleic tổng hợp được. Ngoài ra, thiết bị còn chứa mô-đun phân tách được liên kết hoạt động với khối mẫu. Tốt hơn là thiết bị này có chứa phương tiện để phân tích axit nucleic tổng hợp được. Phân tích như vậy bao gồm nhận dạng trình tự (được chứng minh chẳng hạn như bằng phương pháp lai), không có trình tự không mong muốn, đo tính toàn vẹn của mRNA tổng hợp (chẳng hạn như bằng phép đo độ nhớt vi lỏng kết hợp với phép đo quang phổ), nồng độ và/hoặc hiệu lực của RNA biến đổi (chẳng hạn như bằng phép đo quang phổ).
Theo một số phương án nhất định, thiết bị này được kết hợp với phương tiện để phát hiện mầm bệnh có trong vật liệu sinh học thu được từ đối tượng, ví dụ:IBISHệ thống PLEX-ID (Abbott, Abbott Park, TL) để nhận dạng vi sinh vật.
Các thiết bị thích hợp để sử dụng trong việc phân phối dược phẩm trong da được mô tả ở đây bao gồm các thiết bị kim ngắn như các thiết bị được mô tả trong US Pat. số 4.886.499; 5.190.521; 5.328.483; 5.527.288; 4.270.537; 5.015.235; 5.141.496; và 5.417.662; mỗi nội dung đó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Các chế phẩm trong da có thể được sử dụng bằng các thiết bị giới hạn chiều dài xuyên thấu hiệu quả của kim vào da, chẳng hạn như các chế phẩm được mô tả trong ấn phẩm PCT WO 99/34850 (ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn) và các chế phẩm có chức năng tương đương với chúng. Thiết bị phun tia cung cấp chế phẩm chất lỏng đến lớp hạ bì thông qua máy phun tia chất lỏng và/hoặc qua kim xuyên qua lớp sừng và tạo ra tia tới lớp hạ bì là thích hợp. Ví dụ, thiết bị phun tia phản lực được mô tả trong US Pat. số 5.480.381; 5.599.302; 5.334.144; 5.993.412; 5.649.912; 5.569.189; 5.704.911; 5.383.851; 5.893.397; 5.466.220; 5.339.163; 5.312.335; 5.503.627; 5.064.413; 5.520.639; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 4.940.460; và các ấn phẩm PCT WO 97/37705 và WO 97/13537; mỗi nội dung đó đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Các thiết bị phân phối bột/hạt đạn đạo sử dụng khí nén để đẩy nhanh vắc xin ở dạng bột xuyên qua các lớp ngoài của da đến lớp hạ bì là phù hợp. Ngoài ra, ống tiêm thông thường có thể được sử dụng theo phương pháp tiêm trong da mantoux cổ điển.
Theo một số phương án, thiết bị này có thể là máy bơm hoặc bao gồm ống thông để truyền hợp chất hoặc chế phẩm theo sáng chế qua hàng rào máu não. Các thiết bị này bao gồm nhưng không giới hạn ở thiết bị phân phối khứu giác được điều áp, thiết bị điện chuyển ion, thiết bị vi lỏng nhiều lớp, và các thiết bị tương tự. Các thiết bị như vậy có thể di động hoặc cố định. Chúng có thể được cấy ghép hoặc gắn bên ngoài vào cơ thể hoặc kết hợp chúng.
Thiết bị sử dụng có thể được sử dụng để phân phối các polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế theo các phác đồ dùng đơn, đa liều hoặc chia liều được dạy ở đây. Các thiết bị như vậy được mô tả dưới đây.
Phương pháp và thiết bị đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này để sử dụng nhiều lần vào tế bào, cơ quan và mô được dự tính để sử dụng cùng với các phương pháp và chế phẩm bộc lộ ở đây như là các phương án của sáng chế. Chúng bao gồm, ví dụ, các phương pháp và thiết bị có nhiều kim, thiết bị lai sử dụng ví dụ lumen hoặc ống thông cũng như các thiết bị sử dụng cơ chế điều khiển nhiệt, dòng điện hoặc bức xạ.
Theo sáng chế, các thiết bị đa cấp này có thể được sử dụng để phân phối liều đơn, liều đa hoặc liều chia như đề cập ở đây.
Một phương pháp đưa tác nhân trị liệu vào mô rắn đã được mô tả bởi Bahrami et al. và được dạy ví dụ trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20110230839, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Bahrami, một dãy kim được tích hợp vào một thiết bị cung cấp lượng chất lỏng gần như bằng nhau tại bất kỳ vị trí nào trong mô rắn nói trên dọc theo chiều dài của mỗi kim.
Một thiết bị vận chuyển vật liệu sinh học qua mô sinh học đã được mô tả bởi Kodgule et al. và được dạy ví dụ trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20110172610, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Kodgule, nhiều kim siêu nhỏ làm từ một hoặc nhiều kim loại và có đường kính ngoài từ khoảng 200 micron đến khoảng 350 micron và chiều dài ít nhất 100 micron được tích hợp vào thiết bị cung cấp peptide, protein, carbohydrate, phân tử axit nucleic. , lipid và các hoạt chất dược phẩm khác hoặc sự kết hợp của chúng.
Một đầu dò phân phối để đưa tác nhân trị liệu vào mô đã được mô tả bởi Gunday et al. và được dạy chẳng hạn trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20110270184, toàn bộ nội dung của từng tài liệu đó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Gunday, nhiều kim tiêm được tích hợp vào thiết bị để di chuyển các viên nang gắn liền giữa vị trí được kích hoạt và vị trí bất hoạt để đẩy tác nhân ra khỏi viên nang thông qua các kim.
Thiết bị y tế tiêm nhiều lần đã được mô tả bởi Assaf và được dạy ví dụ trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20110218497, toàn bộ nội dung của thiết bị này được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Assaf, nhiều kim được tích hợp vào thiết bị có một khoang được kết nối với một hoặc nhiều kim nói trên và một phương tiện để liên tục đổ đầy chất lỏng y tế vào khoang sau mỗi lần tiêm.
Theo một phương án, polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc mmRNA được tiêm dưới da hoặc tiêm bắp thông qua ít nhất 3 mũi kim đến ba vị trí khác nhau, tùy ý, liền kề, cùng một lúc, hoặc trong khoảng thời gian 60 phút (ví dụ, tiêm đến 4,5, 6, 7 , 8, 9 hoặc 10 địa điểm cùng lúc hoặc trong khoảng thời gian 60 phút). Các liều phân chia có thể được sử dụng đồng thời cho mô lân cận bằng cách sử dụng các thiết bị được mô tả trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ số 20110230839 và 20110218497, mỗi thiết bị này được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Một hệ thống cấy ghép ít nhất một phần để tiêm một chất vào cơ thể bệnh nhân, đặc biệt là hệ thống kích thích cương cứng dương vật đã được Forsell mô tả và được dạy ví dụ trong Ấn phẩm Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20110196198, toàn bộ nội dung của hệ thống này được đưa vào đây bằng cách viện dẫn . Theo Forsell, nhiều kim được tích hợp vào thiết bị được cấy ghép cùng với một hoặc nhiều vỏ liền kề thể hang bên trái và bên phải của bệnh nhân. Một bể chứa và một máy bơm cũng được cấy vào để cung cấp thuốc qua kim tiêm.
Phương pháp phân phối qua da lượng sắt có hiệu quả điều trị đã được Berenson mô tả và được dạy ví dụ trong Ấn phẩm Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20100130910, nội dung của nó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Berenson, nhiều kim có thể được sử dụng để tạo ra nhiều kênh vi mô trong lớp sừng nhằm tăng cường vận chuyển sắt ion qua da trên miếng dán điện di ion.
Phương pháp phân phối vật liệu sinh học qua mô sinh học đã được Kodgule và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong Ấn phẩm Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20110196308, nội dung của nó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Kodgule, nhiều vi kim có khả năng phân hủy sinh học chứa hoạt chất trị liệu được kết hợp trong một thiết bị cung cấp protein, carbohydrate, phân tử axit nucleic, lipid và các thành phần hoạt tính dược phẩm khác hoặc sự kết hợp của chúng.
Miếng dán thấm qua da chứa chế phẩm độc tố botulinum đã được Donovan mô tả và được dạy ví dụ trong Ấn bản Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20080220020, nội dung của nó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Donovan, nhiều mũi kim được tích hợp vào miếng dán sẽ cung cấp độc tố botulinum dưới lớp sừng thông qua những chiếc kim nói trên chiếu xuyên qua lớp sừng của da mà không làm vỡ mạch máu.
Một bình chứa thuốc nhỏ, dùng một lần hoặc bơm vá, có thể chứa khoảng 0,2 đến 15 mL công thức chất lỏng có thể được đặt trên da và cung cấp công thức liên tục dưới da bằng cách sử dụng một lỗ khoan nhỏ cần thiết (ví dụ: thước đo 26 đến 34). Như các ví dụ không giới hạn, máy bơm vá có thể có kích thước lò xo 50 mm x 76 mm x 20 mm có kim cỡ 30 đến 34 (BD™ Microinfuser, Franklin Lakes NJ), 41 mm x 62 mm x 17 mm với 2 mL bình chứa được sử dụng để phân phối thuốc như insulin (OMNIPOD®, Insulet Corporation Bedford, MA) hoặc đường kính 43-60 mm, dày 10 mm với bình chứa 0,5 đến 10 mL (PATCHPUMP®, SteadyMed Therapeutics, San Francisco, CA). Hơn nữa, máy bơm vá có thể chạy bằng pin và/hoặc có thể sạc lại.
Đầu dò lạnh để sử dụng hoạt chất đến vị trí xử lý đông lạnh đã được mô tả bởi Toubia và được dạy ví dụ trong Ấn bản Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20080140061, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Toubia, nhiều kim được đưa vào đầu dò để tiếp nhận hoạt chất vào buồng và đưa tác nhân vào mô.
Phương pháp điều trị hoặc ngăn ngừa tình trạng viêm hoặc thúc đẩy các khớp khỏe mạnh đã được Stock và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong Ấn phẩm Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20090155186, toàn bộ nội dung của phương pháp này được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Stock, nhiều kim được tích hợp trong một thiết bị quản lý các chế phẩm có chứa các hợp chất điều biến truyền tín hiệu.
Một hệ thống tiêm nhiều vị trí đã được mô tả bởi Kimmell et al. và được dạy ví dụ trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20100256594, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Kimmell, nhiều kim được tích hợp vào một thiết bị đưa thuốc vào lớp sừng thông qua các kim.
Một phương pháp đưa interferon vào khoang trong da đã được mô tả bởi Dekker et al. và được dạy chẳng hạn trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20050181033, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Dekker, nhiều kim có lỗ thoát với chiều cao tiếp xúc từ 0 đến 1 mm được tích hợp vào một thiết bị giúp cải thiện dược động học và sinh khả dụng bằng cách đưa chất ở độ sâu từ 0,3 mm đến 2 mm.
Phương pháp đưa gen, enzym và tác nhân sinh học đến tế bào mô đã được Desai mô tả và được dạy ví dụ trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20030073908, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Desai, nhiều kim tiêm được tích hợp vào một thiết bị được đưa vào cơ thể và truyền chất lỏng thuốc qua các kim nói trên.
Phương pháp điều trị rối loạn nhịp tim bằng tế bào nguyên bào sợi đã được Lee và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20040005295, nội dung của nó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Lee, nhiều kim được tích hợp vào thiết bị để đưa tế bào nguyên bào sợi vào vùng mô cục bộ.
Shachar et al. Phương pháp sử dụng máy bơm điều khiển từ tính để điều trị khối u não đã được mô tả. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 7.799.012 (phương pháp) và 7.799.016 (thiết bị), toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Shachar, nhiều kim tiêm được tích hợp vào máy bơm để đẩy thuốc qua kim với tốc độ được kiểm soát.
Các phương pháp điều trị rối loạn chức năng của bàng quang ở động vật có vú cái đã được mô tả bởi Versi et al. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 8.029.496, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Versi, một loạt các kim siêu nhỏ được tích hợp vào một thiết bị đưa tác nhân trị liệu qua kim trực tiếp vào tam giác của bàng quang.
Một thiết bị vận chuyển qua da bằng kim siêu nhỏ đã được Angel và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ ở US Pat. Số 7.364.568, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Angel, nhiều kim được tích hợp vào thiết bị vận chuyển một chất vào bề mặt cơ thể thông qua các kim được đưa vào bề mặt từ các hướng khác nhau. Thiết bị vận chuyển qua da bằng vi kim có thể là hệ thống vi kim đặc hoặc hệ thống vi kim rỗng. Như một ví dụ không giới hạn, hệ thống kim siêu nhỏ rắn có thể có công suất lên tới 0,5 mg, với 300-1500 kim siêu nhỏ rắn trên cm2cao khoảng 150-700 μm được phủ một lớp thuốc. Các vi kim xuyên qua lớp sừng và lưu lại trên da trong thời gian ngắn (ví dụ: 20 giây đến 15 phút). Trong một ví dụ khác, hệ thống kim siêu nhỏ có dung tích lên tới 3 mL để cung cấp các công thức dạng lỏng sử dụng 15-20 kim siêu nhỏ trên cm2 có chiều cao khoảng 950 μm. Các mũi kim siêu nhỏ xuyên qua da để cho phép các công thức chất lỏng chảy từ thiết bị vào da. Hệ thống kim siêu nhỏ rỗng có thể được đeo từ 1 đến 30 phút tùy thuộc vào khối lượng công thức và độ nhớt.
Một thiết bị truyền dưới da đã được Dalton và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong U.S. Pat. Số 7.150.726, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Dalton, nhiều kim được tích hợp vào thiết bị đưa chất lỏng qua kim vào mô dưới da.
Mikszta et al. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 7,473,247, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Mitszta, ít nhất một kim siêu nhỏ rỗng được tích hợp vào thiết bị để đưa vắc xin đến da của đối tượng ở độ sâu từ 0,025 mm đến 2 mm.
Một phương pháp cung cấp insulin đã được Pettis và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong U.S. Pat. Số 7.722.595, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Pettis, hai kim được tích hợp vào một thiết bị trong đó cả hai kim về cơ bản đâm đồng thời vào da với kim đầu tiên ở độ sâu dưới 2,5 mm để đưa insulin đến khoang trong da và kim thứ hai ở độ sâu lớn hơn 2,5 mm và nhỏ hơn hơn 5,0 mm để đưa insulin đến khoang dưới da.
Việc tiêm qua da dưới lực hút đã được mô tả bởi Kochamba et al. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 6,896,666, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Kochamba, nhiều kim tương đối liền kề với nhau được tích hợp vào một thiết bị tiêm chất lỏng bên dưới lớp da.
Một thiết bị để rút hoặc phân phối một chất qua da đã được Down và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong U.S. Pat. Số 6.607.513, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Down, nhiều bộ phận xuyên qua da được tích hợp vào thiết bị có chiều dài từ khoảng 100 micron đến khoảng 2000 micron và có kích thước khoảng 30 đến 50 gauge.
Một thiết bị đưa chất vào da đã được Palmer và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong U.S. Pat. Số 6,537,242, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Palmer, một loạt các kim siêu nhỏ được tích hợp vào thiết bị sử dụng cụm kéo dài để tăng cường sự tiếp xúc của kim với da và mang lại khả năng phân phối chất đồng đều hơn.
Một thiết bị truyền dịch để phân phối thuốc cục bộ đã được Zamoyski mô tả và được dạy ví dụ ở U.S. Pat. Số 6,468,247, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Zamoyski, nhiều kim tiêm dưới da được tích hợp vào thiết bị để tiêm nội dung của thuốc tiêm dưới da vào mô khi ống tiêm dưới da được rút lại.
Prausnitz và cộng sự đã mô tả một phương pháp tăng cường vận chuyển thuốc và phân tử sinh học qua mô bằng cách cải thiện sự tương tác giữa vi kim và da người. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 6.743.211, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Prausnitz, nhiều kim siêu nhỏ được tích hợp vào một thiết bị có khả năng tạo ra bề mặt cứng hơn và ít biến dạng hơn để áp dụng các kim siêu nhỏ.
Một thiết bị để sử dụng thuốc nội tạng đã được Ting và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong US Pat. Số 6.077.251, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Ting, nhiều kim có lỗ mở ở bên để tăng cường sử dụng được tích hợp vào một thiết bị mà bằng cách kéo dài và rút kim từ và vào trong buồng kim sẽ ép dược chất từ ngăn chứa vào kim nói trên và tiêm dược chất này vào cơ quan đích.
Giá đỡ nhiều kim và cổng truyền dịch đa kênh dưới da đã được Brown mô tả và được dạy ví dụ trong US Pat. Số 4.695.273, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Brown, nhiều kim trên giá đỡ kim được đưa qua vách ngăn của cổng truyền và liên lạc với các buồng cách ly trong cổng truyền nói trên.
Một ống tiêm dưới da kép đã được Horn mô tả và được dạy ví dụ trong U.S. Pat. Số 3.552.394, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Horn, hai kim được tích hợp vào thiết bị cách nhau dưới 68 mm và có thể có kiểu dáng và chiều dài khác nhau, do đó cho phép thực hiện tiêm ở các độ sâu khác nhau.
Một ống tiêm có nhiều kim và nhiều ngăn chứa chất lỏng đã được Hershberg mô tả và được dạy ví dụ trong U.S. Pat. Số 3.572.336, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Hershberg, nhiều kim tiêm được tích hợp vào ống tiêm có nhiều ngăn chứa chất lỏng và có khả năng tiêm đồng thời các loại thuốc không tương thích mà không thể trộn lẫn trong một lần tiêm.
Một dụng cụ phẫu thuật để tiêm chất lỏng trong da đã được mô tả bởi Eliscu et al. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 2.588.623, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Eliscu, nhiều kim được tích hợp vào dụng cụ để tiêm chất lỏng vào trong da với phạm vi phân tán rộng hơn.
Một thiết bị phân phối đồng thời một chất tới nhiều ống dẫn sữa mẹ đã được Hùng mô tả và được dạy ví dụ trong EP 1818017, toàn bộ nội dung của thiết bị này được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Hùng, nhiều lumen được tích hợp vào thiết bị để chèn qua các lỗ của mạng lưới ống và cung cấp chất lỏng cho mạng lưới ống.
Ống thông để đưa thuốc vào mô của tim hoặc các cơ quan khác đã được Tkebuchava mô tả và được dạy ví dụ trong WO2006138109, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Tkebuchava, hai kim cong được kết hợp để đi vào thành cơ quan theo một quỹ đạo dẹt.
Các thiết bị cung cấp tác nhân y tế đã được mô tả bởi Mckay et al. và được giảng dạy chẳng hạn trong WO2006118804, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Mckay, nhiều kim với nhiều lỗ trên mỗi kim được tích hợp vào các thiết bị để tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân phối theo vùng tới mô, chẳng hạn như không gian đĩa bên trong của đĩa đệm cột sống.
Phương pháp đưa trực tiếp chất điều hòa miễn dịch vào khoang trong da của da động vật có vú đã được Pettis mô tả và được dạy ví dụ trong WO2004020014, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Pettis, nhiều kim được tích hợp vào một thiết bị đưa chất qua kim đến độ sâu từ 0,3 mm đến 2 mm.
Các phương pháp và thiết bị để đưa các chất vào ít nhất hai ngăn trên da để hấp thu toàn thân và cải thiện dược động học đã được Pettis et al mô tả. và được giảng dạy chẳng hạn trong WO2003094995, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Pettis, nhiều kim có chiều dài từ khoảng 300 μm đến khoảng 5 mm được tích hợp vào một thiết bị đưa đến các khoang mô trong da và dưới da cùng một lúc.
Một thiết bị phân phối thuốc có kim và con lăn đã được Zimmerman et al mô tả. và được giảng dạy chẳng hạn trong WO2012006259, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Zimmerman, nhiều kim rỗng được đặt trong một con lăn được tích hợp vào thiết bị để chuyển nội dung trong bể chứa qua các kim khi con lăn quay.
Thiết bị phân phối thuốc như ống đỡ động mạch đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này và được dạy ví dụ trong Pat. Số 8,333,799, Nhà xuất bản Hoa Kỳ. Số US20060020329, US20040172127 và US20100161032; toàn bộ nội dung của từng tài liệu này được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Các chế phẩm chứa polynucleotit, cấu trúc bậc một, mmRNA được mô tả ở đây có thể được phân phối bằng cách sử dụng ống đỡ động mạch. Ngoài ra, stent được sử dụng ở đây có thể có khả năng phân phối nhiều polynucleotit, cấu trúc sơ cấp và/hoặc mmRNA và/hoặc chế phẩm ở tốc độ phân phối giống nhau hoặc khác nhau. Các ví dụ không giới hạn về nhà sản xuất ống đỡ động mạch bao gồm CORDIS® (Miami, FL) (CYPHER®), Boston Scientific Corporation (Natick, MA) (TAXUS®), Medtronic (Minneapolis, MN) (ENDEAVOUR®) và Abbott (Abbott Park, TL) (XIENCE V®).
Phương pháp và thiết bị sử dụng ống thông và/hoặc Lumens
Các phương pháp và thiết bị sử dụng ống thông và lumen có thể được sử dụng để sử dụng mmRNA theo sáng chế theo lịch trình dùng thuốc một lần, nhiều lần hoặc nhiều lần. Các phương pháp và thiết bị như vậy được mô tả dưới đây.
Việc truyền nguyên bào cơ xương qua ống thông đến cơ tim của những trái tim bị tổn thương đã được Jacoby và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong Ấn phẩm Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20060263338, nội dung của nó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Jacoby, nhiều mũi kim được tích hợp vào thiết bị, ít nhất một phần của thiết bị này được đưa vào mạch máu và đưa thành phần tế bào qua các mũi kim vào vùng cục bộ của tim đối tượng.
Một thiết bị điều trị bệnh hen suyễn sử dụng chất độc thần kinh đã được Deem và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20060225742, nội dung của nó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Deem, nhiều kim tiêm được tích hợp vào thiết bị đưa chất độc thần kinh qua kim vào mô phế quản.
Một phương pháp quản lý các liệu pháp đa thành phần đã được Nayak mô tả và được dạy ví dụ trong U.S. Pat. Số 7.699.803, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Nayak, nhiều ống tiêm có thể được tích hợp vào một thiết bị trong đó có thể bao gồm các khe sâu để kiểm soát độ sâu mà chất điều trị được phân phối trong mô.
Một thiết bị phẫu thuật để cắt bỏ một kênh và đưa ít nhất một tác nhân trị liệu vào vùng mô mong muốn đã được McIntyre và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong US Pat. Số 8.012.096, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo McIntyre, nhiều kim được tích hợp vào thiết bị để phân phối tác nhân trị liệu vào vùng mô xung quanh ống và đặc biệt phù hợp cho các hoạt động tái tạo mạch xuyên cơ tim.
Các phương pháp điều trị rối loạn chức năng của bàng quang ở động vật có vú cái đã được Versi và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong U.S. Pat. Số 8.029.496, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Versi, một loạt các kim siêu nhỏ được tích hợp vào một thiết bị đưa tác nhân trị liệu qua kim trực tiếp vào tam giác của bàng quang.
Yeshurun và cộng sự đã mô tả một thiết bị và phương pháp đưa chất lỏng vào hàng rào sinh học linh hoạt. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 7.998.119 (thiết bị) và 8.007.466 (phương pháp), toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Yeshurun, các kim siêu nhỏ trên thiết bị xuyên qua và mở rộng vào hàng rào sinh học linh hoạt và chất lỏng được bơm qua lỗ của các kim siêu nhỏ rỗng.
Phương pháp tiêm một chất vào vùng thượng tâm mạc vào vùng mô của tim có bề mặt thượng tâm mạc và được bố trí trong thân đã được Bonner và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong U.S. Pat. Số 7.628.780, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Bonner, các thiết bị này có trục dài và đầu tiêm ở xa để đưa kim vào mô và tiêm các chất y tế vào mô qua kim.
Một thiết bị để bịt kín vết thủng đã được Nielsen và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong U.S. Pat. Số 7.972.358, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Nielsen, nhiều kim được tích hợp vào thiết bị để đưa chất đóng kín vào mô xung quanh đường đâm thủng.
Một phương pháp hình thành cơ và hình thành mạch đã được mô tả bởi Chiu et al. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 6.551.338, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Chiu, 5 đến 15 kim có đường kính tối đa ít nhất là 1,25 mm và chiều dài có hiệu quả để tạo ra độ sâu đâm từ 6 đến 20 mm được tích hợp vào một thiết bị đưa vào gần cơ tim và cung cấp mạch máu ngoại sinh hoặc cơ tim. yếu tố tác động đến cơ tim thông qua các ống dẫn trong ít nhất một số kim nói trên.
Một phương pháp điều trị mô tuyến tiền liệt đã được mô tả bởi Bolmsj et al. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 6.524.270, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Bolmsj, một thiết bị bao gồm một ống thông được đưa qua niệu đạo có ít nhất một đầu rỗng có thể mở rộng vào mô tuyến tiền liệt xung quanh. Một loại thuốc làm se và giảm đau được truyền qua đầu nói trên vào mô tuyến tiền liệt nói trên.
Một phương pháp truyền dịch vào vị trí trong xương đã được mô tả bởi Findlay et al. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 6.761.726, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Findlay, nhiều kim được tích hợp vào một thiết bị có khả năng xuyên qua lớp vỏ cứng của vật liệu được bao phủ bởi một lớp vật liệu mềm và cung cấp chất lỏng ở khoảng cách xác định trước bên dưới lớp vật liệu cứng nói trên.
Một thiết bị tiêm thuốc vào thành mạch đã được mô tả bởi Vigil et al. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 5.713.863, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Vigil, nhiều kim tiêm được gắn trên mỗi ống linh hoạt trong thiết bị để đưa chất lỏng thuốc qua ống thông nhiều lumen vào các ống linh hoạt này và ra khỏi các kim phun này để truyền vào thành mạch.
Một ống thông để đưa tác nhân trị liệu và/hoặc chẩn đoán đến mô xung quanh đường đi của cơ thể đã được mô tả bởi Faxon et al. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 5,464,395, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Faxon, ít nhất một ống kim được đưa vào ống thông để đưa các tác nhân mong muốn đến mô thông qua những chiếc kim nhô ra phía ngoài ống thông.
Ống thông bóng để phân phối tác nhân điều trị đã được Orr mô tả và được dạy ví dụ trong WO2010024871, nội dung của nó được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Orr, nhiều kim được tích hợp vào các thiết bị đưa tác nhân trị liệu đến các độ sâu khác nhau trong mô. Theo một khía cạnh khác, bóng rửa giải thuốc có thể được sử dụng để phân phối các chế phẩm được mô tả ở đây. Bóng phủ thuốc có thể được sử dụng trong các ứng dụng tổn thương mục tiêu, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn, tái hẹp trong ống đỡ động mạch, điều trị tổn thương ở các mạch quanh co, tổn thương chia đôi, tổn thương xương đùi/ngón chân và tổn thương bên dưới đầu gối.
Perry và cộng sự đã mô tả một thiết bị để phân phối các tác nhân điều trị (ví dụ, polynucleotide, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA) đến mô được xử lý xung quanh một lumin. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Quán rượu. US20100125239, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Perry, ống thông có một quả bóng có thể được phủ một chất điều trị bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và được mô tả trong Perry. Khi quả bóng nở ra, tác nhân trị liệu sẽ tiếp xúc với các mô xung quanh. Ngoài ra, thiết bị này có thể có một nguồn nhiệt để thay đổi nhiệt độ của lớp phủ trên quả bóng nhằm giải phóng tác nhân trị liệu vào mô.
Phương pháp và thiết bị sử dụng dòng điện
Các phương pháp và thiết bị sử dụng dòng điện có thể được sử dụng để phân phối mmRNA theo sáng chế theo các phác đồ dùng liều đơn, đa liều hoặc chia liều được dạy ở đây. Các phương pháp và thiết bị như vậy được mô tả dưới đây.
Thiết bị trị liệu cảm ứng điện collagen đã được Marquez mô tả và được dạy ví dụ trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20090137945, toàn bộ nội dung của thiết bị này được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Marquez, nhiều mũi kim được đưa vào thiết bị, liên tục xuyên qua da và hút vào da một phần chất được bôi lên da trước tiên.
Một hệ thống điện động học đã được mô tả bởi Etheredge et al. và được dạy chẳng hạn trong Công bố Bằng sáng chế Hoa Kỳ 20070185432, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Etheredge, những chiếc kim siêu nhỏ được tích hợp vào một thiết bị truyền dòng điện đưa thuốc qua kim đến vị trí điều trị được nhắm mục tiêu.
Một thiết bị điện di ion đã được mô tả bởi Matsumura et al. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 7,437,189, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Matsumura, nhiều kim được tích hợp vào thiết bị có khả năng đưa thuốc ion hóa vào cơ thể sống với tốc độ cao hơn hoặc hiệu quả cao hơn.
Việc cung cấp các hoạt chất sinh học trong da bằng cách tiêm không cần kim và điện di đã được Hoffmann và cộng sự mô tả và được dạy ví dụ trong US Pat. Số 7.171.264, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Hoffmann, một hoặc nhiều kim tiêm không cần kim được tích hợp vào thiết bị điện di và sự kết hợp giữa tiêm không kim và điện di là đủ để đưa tác nhân vào tế bào trên da, cơ hoặc niêm mạc.
Một phương pháp phân phối nội bào qua trung gian điện hóa đã được mô tả bởi Lundkvist et al. và được dạy ví dụ ở Hoa Kỳ Pat. Số 6.625.486, toàn bộ nội dung của nó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Lundkvist, một cặp điện cực kim được tích hợp vào ống thông. Ống thông này được đặt vào trong lòng cơ thể sau đó kéo dài các điện cực hình kim để thâm nhập vào mô xung quanh lòng này. Sau đó, thiết bị đưa chất này qua ít nhất một trong số các điện cực kim này và tạo ra điện trường bằng cặp điện cực kim này để cho phép chất đó đi qua màng tế bào vào các tế bào tại vị trí điều trị.
Một hệ thống phân phối miễn dịch qua da đã được mô tả bởi Levin et al. và được giảng dạy chẳng hạn trong WO2006003659, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Levin, nhiều điện cực được tích hợp vào thiết bị sử dụng năng lượng điện giữa các điện cực để tạo ra các kênh vi mô trong da nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc truyền qua da.
Phương pháp truyền năng lượng RF vào da đã được Schomacker mô tả và được dạy ví dụ trong WO2011163264, toàn bộ nội dung của phương pháp này được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Theo Schomacker, nhiều kim được tích hợp vào một thiết bị sử dụng chân không để kéo da tiếp xúc với một tấm để kim đâm vào da qua các lỗ trên tấm và cung cấp năng lượng RF.
VII. Các định nghĩa
Ở những vị trí khác nhau trong bản mô tả hiện tại, các nhóm thế của hợp chất theo sáng chế được bộc lộ theo nhóm hoặc theo khoảng. Mục đích cụ thể của sáng chế là bao gồm từng tổ hợp con riêng lẻ của các thành viên trong các nhóm và dãy như vậy. Ví dụ: thuật ngữ “C1-6alkyl” được thiết kế đặc biệt để bộc lộ riêng từng metyl, etyl, C3alkyl, C4alkyl, C5alkyl và C6alkyl.
Giới thiệu: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “khoảng” có nghĩa là +/− 10% giá trị được nêu.
Sử dụng kết hợp: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “sử dụng kết hợp” hoặc “sử dụng kết hợp” có nghĩa là hai hoặc nhiều chất được sử dụng cho đối tượng cùng lúc hoặc trong một khoảng thời gian sao cho có thể có sự chồng chéo về tác dụng của từng tác nhân trên bệnh nhân. Theo một số phương án, chúng được sử dụng cách nhau khoảng 60, 30, 15, 10, 5 hoặc 1 phút. Theo một số phương án, việc sử dụng các chất này được đặt đủ gần nhau sao cho đạt được hiệu quả kết hợp (ví dụ, tác dụng hiệp đồng).
Động vật: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “động vật” dùng để chỉ bất kỳ thành viên nào của giới động vật. Theo một số phương án, “động vật” dùng để chỉ con người ở bất kỳ giai đoạn phát triển nào. Theo một số phương án, “động vật” dùng để chỉ động vật không phải con người ở bất kỳ giai đoạn phát triển nào. Theo các phương án nhất định, động vật không phải người là động vật có vú (ví dụ, loài gặm nhấm, chuột nhắt, chuột cống, thỏ, khỉ, chó, mèo, cừu, gia súc, linh trưởng hoặc lợn). Theo một số phương án, động vật bao gồm nhưng không giới hạn ở động vật có vú, chim, bò sát, lưỡng cư, cá và giun. Theo một số phương án, động vật này là động vật chuyển gen, động vật được biến đổi gen, hoặc động vật vô tính.
Kháng nguyên quan tâm hoặc kháng nguyên mong muốn: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “kháng nguyên quan tâm” hoặc “kháng nguyên mong muốn” bao gồm các protein và các phân tử sinh học khác được đề xuất ở đây được liên kết đặc hiệu miễn dịch bởi các kháng thể và đoạn, đột biến, biến thể, và các biến đổi của chúng được mô tả ở đây . Ví dụ về các kháng nguyên được quan tâm bao gồm, nhưng không giới hạn ở, insulin, yếu tố tăng trưởng giống insulin, hGH, tPA, cytokine, như interleukin (IL), ví dụ, IL-1, IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferon (IFN) alpha, IFN beta, IFN gamma, IFN omega hoặc IFN tau, yếu tố hoại tử khối u (TNF), chẳng hạn như TNF alpha và TNF beta, TNF gamma, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 và VEGF.
Xấp xỉ: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “xấp xỉ” hoặc “khoảng,” được áp dụng cho một hoặc nhiều giá trị quan tâm, đề cập đến giá trị tương tự với giá trị tham chiếu đã nêu. Theo các phương án nhất định, thuật ngữ “xấp xỉ” hoặc “khoảng” dùng để chỉ dải giá trị nằm trong khoảng 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% hoặc ít hơn theo một trong hai hướng (lớn hơn hoặc nhỏ hơn) của mức đã nêu giá trị tham chiếu trừ khi có quy định khác hoặc có bằng chứng khác trong ngữ cảnh (trừ khi con số đó vượt quá 100% giá trị có thể có).
Liên kết với: Như được sử dụng ở đây, các thuật ngữ “liên kết với”, “liên hợp”, “được liên kết”, “được gắn” và “được gắn kết” khi được sử dụng cho hai hoặc nhiều gốc, có nghĩa là các gốc được liên kết hoặc kết nối về mặt vật lý với nhau, trực tiếp hoặc thông qua một hoặc nhiều gốc bổ sung đóng vai trò là tác nhân liên kết, để tạo thành cấu trúc đủ ổn định sao cho các gốc vẫn liên kết về mặt vật lý trong các điều kiện mà cấu trúc này được sử dụng, ví dụ, các điều kiện sinh lý. Một “liên kết” không nhất thiết phải hoàn toàn thông qua liên kết hóa học cộng hóa trị trực tiếp. Nó cũng có thể gợi ý liên kết ion hoặc hydro hoặc khả năng kết nối dựa trên sự lai hóa đủ ổn định sao cho các thực thể “liên kết” vẫn được liên kết về mặt vật lý.
Hai chức năng: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “hai chức năng” dùng để chỉ chất, phân tử hoặc gốc bất kỳ có khả năng hoặc duy trì ít nhất hai chức năng. Các chức năng có thể ảnh hưởng đến cùng một kết quả hoặc một kết quả khác nhau. Cấu trúc tạo ra chức năng có thể giống hoặc khác nhau. Ví dụ, các ARN biến đổi chức năng kép theo sáng chế có thể mã hóa peptit gây độc tế bào (chức năng thứ nhất) trong khi các nucleoside tạo nên ARN mã hóa, về bản chất, là chất gây độc tế bào (chức năng thứ hai). Trong ví dụ này, việc chuyển RNA biến đổi chức năng kép đến tế bào ung thư sẽ không chỉ tạo ra phân tử peptit hoặc protein có thể cải thiện hoặc điều trị ung thư mà còn cung cấp một lượng nucleoside gây độc tế bào cho tế bào cần thoái hóa, thay vì dịch mã RNA biến đổi xảy ra.
Tương thích sinh học: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “tương thích sinh học” có nghĩa là tương thích với các tế bào, mô, cơ quan hoặc hệ thống sống có ít hoặc không có nguy cơ bị tổn thương, nhiễm độc hoặc bị hệ thống miễn dịch đào thải.
Có thể phân hủy sinh học: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “có thể phân hủy sinh học” có nghĩa là có khả năng được phân hủy thành các sản phẩm vô hại nhờ hoạt động của các sinh vật sống.
Hoạt tính sinh học: Như được sử dụng ở đây, cụm từ “có hoạt tính sinh học” dùng để chỉ đặc tính của chất bất kỳ có hoạt tính trong hệ thống sinh học và/hoặc sinh vật. Ví dụ, một chất mà khi được sử dụng cho một sinh vật sẽ có tác dụng sinh học đối với sinh vật đó, được coi là có hoạt tính sinh học. Theo các phương án cụ thể, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA theo sáng chế có thể được coi là có hoạt tính sinh học nếu ngay cả một phần của polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA cũng có hoạt tính sinh học hoặc bắt chước hoạt tính được coi là có liên quan về mặt sinh học.
Thuật ngữ hóa học: Phần sau đây cung cấp định nghĩa về các thuật ngữ hóa học khác nhau từ “acyl” đến “thiol”.
Thuật ngữ “acyl,” như được sử dụng ở đây, biểu thị nhóm hydro hoặc nhóm alkyl (ví dụ, nhóm haloalkyl), như được định nghĩa ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nhóm cacbonyl, như được định nghĩa ở đây, và được lấy ví dụ bởi formyl (tức là nhóm carboxyaldehyde), acetyl, propionyl, butanoyl và nhóm tương tự. Nhóm acyl không được thế được lấy làm ví dụ bao gồm từ 1 đến 7, từ 1 đến 11, hoặc từ 1 đến 21 nguyên tử cacbon. Theo một số phương án, nhóm alkyl còn được thế bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được mô tả ở đây.
Thuật ngữ “acylamino,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm acyl, như được định nghĩa ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nhóm amino, như được định nghĩa ở đây (tức là, —N(RN1)—C(O)—R, trong đó R là H hoặc C được thay thế tùy ý1-6, C1-10, hoặc C1-20nhóm alkyl và RN1như được định nghĩa ở đây). Các nhóm axylamino không được ví dụ bao gồm từ 1 đến 41 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 1 đến 7, từ 1 đến 13, từ 1 đến 21, từ 2 đến 7, từ 2 đến 13, từ 2 đến 21, hoặc từ 2 đến 41 nguyên tử cacbon) . Theo một số phương án, nhóm alkyl còn được thế bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được mô tả ở đây, và/hoặc nhóm amino là —NH2hoặc —NHRN1, trong đó RN1độc lập là OH, NO2, NH2, NRN22, VÌ THẾ2HOẶCN2, VÌ THẾ2RN2, xin lỗiN2, alkyl hoặc aryl và mỗi RN2có thể là H, alkyl hoặc aryl.
Thuật ngữ “axyloxy,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm acyl, như được định nghĩa ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nguyên tử oxy (tức là, —O—C(O)—R, trong đó R là H hoặc tùy ý được thế C1-6, C1-10, hoặc C1-20nhóm alkyl). Nhóm axyloxy không được thế được lấy làm ví dụ bao gồm từ 1 đến 21 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 1 đến 7 hoặc từ 1 đến 11 nguyên tử cacbon). Theo một số phương án, nhóm alkyl còn được thế bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được mô tả ở đây, và/hoặc nhóm amino là —NH2hoặc —NHRN1, trong đó RN1độc lập là OH, NO2, NH2, NRN22, VÌ THẾ2HOẶCN2, VÌ THẾ2RN2, xin lỗiN2, alkyl hoặc aryl và mỗi RN2có thể là H, alkyl hoặc aryl.
Thuật ngữ “alkaryl,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm aryl, như được định nghĩa ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nhóm alkylene, như được định nghĩa ở đây. Các nhóm alkaryl không được thế được lấy làm ví dụ là từ 7 đến 30 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 7 đến 16 hoặc từ 7 đến 20 nguyên tử cacbon, chẳng hạn như C1-6kiềm-C6-10aryl, C1-10kiềm-C6-10aryl hoặc C1-20kiềm-C6-10aryl). Theo một số phương án, mỗi alkyl và aryl có thể được thế tiếp bằng các nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được xác định ở đây cho các nhóm tương ứng. Các nhóm khác đứng trước tiền tố “alk-” được xác định theo cách tương tự, trong đó “alk” dùng để chỉ nhóm C1-6alkylene, trừ khi có ghi chú khác, và cấu trúc hóa học kèm theo được xác định ở đây.
Thuật ngữ “alkcycloalkyl” thể hiện nhóm xycloalkyl, như được định nghĩa ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nhóm alkyl, như được định nghĩa ở đây (ví dụ, nhóm alkyl từ 1 đến 4, từ 1 đến 6, từ 1 đến 10, hoặc tạo thành từ 1 đến 20 nguyên tử cacbon). Theo một số phương án, alkyl và xycloalkyl mỗi loại có thể được thế tiếp bằng 1, 2, 3 hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây cho nhóm tương ứng.
Thuật ngữ “alkenyl,” như được sử dụng ở đây, biểu thị các nhóm mạch thẳng hoặc phân nhánh hóa trị một, trừ khi có quy định khác, từ 2 đến 20 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 2 đến 6 hoặc từ 2 đến 10 nguyên tử cacbon) chứa một hoặc nhiều cacbon-cacbon kép. liên kết và được lấy làm ví dụ bởi ethenyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 2-metyl-1-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, và tương tự. Alkenyl bao gồm cả đồng phân cis và trans. Các nhóm alkyl có thể được thế tùy ý bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế được chọn độc lập từ amino, aryl, xycloalkyl, hoặc dị vòng (ví dụ, dị vòng), như được xác định ở đây, hoặc nhóm thế alkyl ví dụ bất kỳ được mô tả ở đây.
Thuật ngữ “alkenyloxy” đại diện cho một nhóm thế hóa học có công thức —OR, trong đó R là C2-20nhóm ankenyl (ví dụ, C2-6hoặc C2-10alkenyl), trừ khi có quy định khác. Các nhóm alkenyloxy ví dụ bao gồm ethenyloxy, propenyloxy, và nhóm tương tự. Theo một số phương án, nhóm alkenyl có thể được thế tiếp bằng nhóm 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây (ví dụ, nhóm hydroxy).
Thuật ngữ “alkheteroaryl” dùng để chỉ nhóm dị vòng, như được định nghĩa ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nhóm alkyl, như được định nghĩa ở đây. Các nhóm alkheteroaryl không được thế được lấy làm ví dụ là từ 2 đến 32 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 2 đến 22, từ 2 đến 18, từ 2 đến 17, từ 2 đến 16, từ 3 đến 15, từ 2 đến 14, từ 2 đến 13, hoặc từ 2 đến 12 cacbon, chẳng hạn như C1-6kiềm-C1-12dị vòng, C1-10kiềm-C1-12dị vòng hoặc C1-20kiềm-C1-12dị vòng). Theo một số phương án, alkyl và dị vòng mỗi loại có thể được thế tiếp bằng các nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được xác định ở đây cho nhóm tương ứng. Các nhóm Alkheteroaryl là một tập hợp con của các nhóm alkheterocyclyl.
Thuật ngữ “alkheterocyclyl” thể hiện nhóm dị vòng, như được định nghĩa ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nhóm alkyl, như được định nghĩa ở đây. Các nhóm alkheterocyclyl không được thế được lấy làm ví dụ là từ 2 đến 32 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 2 đến 22, từ 2 đến 18, từ 2 đến 17, từ 2 đến 16, từ 3 đến 15, từ 2 đến 14, từ 2 đến 13, hoặc từ 2 đến 12 cacbon, chẳng hạn như C1-6kiềm-C1-12dị vòng, C1-10kiềm-C1-12dị vòng, hoặc C1-20kiềm-C1-12dị vòng). Theo một số phương án, mỗi alkyl và dị vòng có thể được thế tiếp bằng các nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được xác định ở đây cho nhóm tương ứng.
Thuật ngữ “alkoxy” đại diện cho một nhóm thế hóa học có công thức —OR, trong đó R là C1-20nhóm alkyl (ví dụ, C1-6hoặc C1-10alkyl), trừ khi có quy định khác. Các nhóm alkoxy được lấy làm ví dụ bao gồm methoxy, ethoxy, propoxy (ví dụ, n-propoxy và isopropoxy), t-butoxy, và nhóm tương tự. Theo một số phương án, nhóm alkyl có thể được thế tiếp bằng nhóm thế 1, 2, 3, hoặc 4 như được xác định ở đây (ví dụ, hydroxy hoặc alkoxy).
Thuật ngữ “alkoxyalkoxy” biểu thị nhóm alkoxy được thay thế bằng nhóm alkoxy. Các nhóm alkoxyalkoxy không được thế được lấy làm ví dụ bao gồm từ 2 đến 40 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 2 đến 12 hoặc từ 2 đến 20 nguyên tử cacbon, chẳng hạn như C1-6alkoxy-C1-6kiềm, C1-10alkoxy-C1-10alkoxy hoặc C1-20alkoxy-C1-20alkoxy). Theo một số phương án, mỗi nhóm alkoxy có thể được thế tiếp bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây.
Thuật ngữ “alkoxyalkyl” thể hiện nhóm alkyl được thế bằng nhóm alkoxy. Các nhóm alkoxyalkyl không được thế được lấy làm ví dụ bao gồm từ 2 đến 40 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 2 đến 12 hoặc từ 2 đến 20 nguyên tử cacbon, chẳng hạn như C1-6alkoxy-C1-6alkyl, C1-10alkoxy-C1-10alkyl hoặc C1-20alkoxy-C1-20alkyl). Theo một số phương án, alkyl và alkoxy mỗi loại có thể được thế tiếp bằng các nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được xác định ở đây cho nhóm tương ứng.
Thuật ngữ “alkoxycarbonyl,” như được sử dụng ở đây, đại diện cho alkoxy, như được định nghĩa ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nguyên tử carbonyl (ví dụ, —C(O)—OR, trong đó R là H hoặc C được thế tùy ý1-6, C1-10, hoặc C1-20nhóm alkyl). Alkoxycarbonyl không được thế ví dụ bao gồm từ 1 đến 21 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 1 đến 11 hoặc từ 1 đến 7 nguyên tử cacbon). Theo một số phương án, nhóm alkoxy còn được thế bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được mô tả ở đây.
Thuật ngữ “alkoxycarbonylkoxy,” như được sử dụng ở đây, biểu thị nhóm alkoxy, như được định nghĩa ở đây, được thế bằng nhóm alkoxycarbonyl, như được định nghĩa ở đây (ví dụ, —O— alkyl-C(O)—OR, trong đó R là nhóm tùy chọn C thay thế1-6, C1-10, hoặc C1-20nhóm alkyl). Alkoxycarbonylalkoxy không được thế ví dụ bao gồm từ 3 đến 41 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 3 đến 10, từ 3 đến 13, từ 3 đến 17, từ 3 đến 21, hoặc từ 3 đến 31 nguyên tử cacbon, chẳng hạn như C1-6alkoxycarbonyl-C1-6kiềm, C1-10alkoxycarbonyl-C1-10alkoxy hoặc C1-20alkoxycarbonyl-C1-20alkoxy). Theo một số phương án, mỗi nhóm alkoxy còn được thế độc lập bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế, như được mô tả ở đây (ví dụ, nhóm hydroxy).
Thuật ngữ “alkoxycarbonylalkyl,” như được sử dụng ở đây, biểu thị nhóm alkyl, như được định nghĩa ở đây, được thế bằng nhóm alkoxycarbonyl, như được định nghĩa ở đây (ví dụ, -alkyl-C(O)—OR, trong đó R là C được thế tùy ý1-20, C1-10, hoặc C1-6nhóm alkyl). Alkoxycarbonylalkyl không được thế ví dụ bao gồm từ 3 đến 41 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 3 đến 10, từ 3 đến 13, từ 3 đến 17, từ 3 đến 21, hoặc từ 3 đến 31 nguyên tử cacbon, chẳng hạn như C1-6alkoxycarbonyl-C1-6alkyl, C1-10alkoxycarbonyl-C1-10alkyl hoặc C1-20alkoxycarbonyl-C1-20alkyl). Theo một số phương án, mỗi nhóm alkyl và alkoxy còn được thế độc lập bằng các nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được mô tả ở đây (ví dụ, nhóm hydroxy).
Thuật ngữ “alkyl,” như được sử dụng ở đây, bao gồm cả nhóm bão hòa chuỗi thẳng và chuỗi nhánh từ 1 đến 20 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 1 đến 10 hoặc từ 1 đến 6), trừ khi được quy định khác. Các nhóm alkyl được lấy ví dụ bằng metyl, etyl, n- và iso-propyl, n-, sec-, iso- và tert-butyl, neopentyl, và các nhóm tương tự, và có thể tùy ý được thế bằng một, hai, ba, hoặc, trong trường hợp nhóm alkyl có từ hai nguyên tử cacbon trở lên, bốn nhóm thế được chọn độc lập từ nhóm gồm: (1) C1-6kiềm; (2) C1-6alkylsulfinyl; (3) amino, như được định nghĩa ở đây (ví dụ, amino không được thế (tức là, —NH2) hoặc amino thay thế (tức là —N(RN1)2, trong đó RN1được xác định cho amino); (4) C6-10aryl-C1-6kiềm; (5) azido; (6) hào quang; (7) (C2-9dị vòng)oxy; (8) hydroxy; (9) nitơ; (10) oxo (ví dụ, carboxyaldehyde hoặc acyl); (11) C1-7spirocyclyl; (12) thioalkoxy; (13) thiol; (14) -CO2RMỘT', trong đó RMỘT'được chọn từ nhóm gồm (a) C1-20alkyl (ví dụ, C1-6alkyl), (b) C2-20alkenyl (ví dụ, C2-6ankenyl), (c) C6-10aryl, (d) hydro, (e) C1-6kiềm-C1-10aryl, (f) amino-C1-20alkyl, (g) polyetylen glycol của —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl, và (h) amino-polyethylene glycol của —NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và mỗi RN1độc lập là hydro hoặc C được thay thế tùy ý1-6alkyl; (15) —C(O)NRB'Rc', trong đó mỗi RB′và RC'được chọn độc lập từ nhóm gồm (a) hydro, (b) C1-6alkyl, (c) C6-10aryl và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (16) -SO2RD′, trong đó RD′ được chọn từ nhóm gồm (a) C1-6alkyl, (b) C6-10aryl, (c) C1-6kiềm-C6-10aryl và (d) hydroxy; (17) —SO2NRE’RF’, trong đó mỗi RE' và RF’được chọn độc lập từ nhóm gồm (a) hydro, (b) C1-6alkyl, (c) C6-10aryl và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (18) —C(O)RG′, trong đó RG′được chọn từ nhóm gồm (a) C1-20alkyl (ví dụ, C1-6alkyl), (b) C2-20alkenyl (ví dụ, C2-6ankenyl), (c) C6-10aryl, (d) hydro, (e) C1-6 alk-C6-10aryl, (f) amino-C1-20alkyl, (g) polyetylen glycol của —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl, và (h) amino-polyethylene glycol của —NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và mỗi RN1độc lập là hydro hoặc C được thay thế tùy ý1-6alkyl; (19) —NRH’C(O)R, trong đó RH’được chọn từ nhóm gồm (a1) hydro và (b1) C1-6alkyl và R1′được chọn từ nhóm gồm (a2) C1-20alkyl (ví dụ, C1-6alkyl), (b2) C2-20alkenyl (ví dụ, C2-6ankenyl), (c2) C6-10aryl, (d2) hydro, (e2) C1-6kiềm-C6-10aryl, (f2) amino-C1-20alkyl, (g2) polyetylen glycol của —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl, và (h2) amino-polyethylene glycol của —NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và mỗi RN1độc lập là hydro hoặc C được thay thế tùy ý1-6alkyl; (20) —NRJ’C(O)HOẶCK’, trong đó R′ được chọn từ nhóm bao gồm (al) hydro và (b1) C1-6alkyl và RK’được chọn từ nhóm gồm (a2) C1-20alkyl (ví dụ, C1-6alkyl), (b2) C2-20alkenyl (ví dụ, C2-6ankenyl), (c2) C6-10aryl, (d2) hydro, (e2) C1-6kiềm-C6-10aryl, (f2) amino-C1-20alkyl, (g2) polyetylen glycol của —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl, và (h2) amino-polyethylene glycol của —NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và mỗi RN1độc lập là hydro hoặc C được thay thế tùy ý1-6alkyl; và (21) amitin. Theo một số phương án, mỗi nhóm trong số này có thể được thay thế thêm như được mô tả ở đây. Ví dụ, nhóm alkylene của C1-alkaryl có thể được thế tiếp bằng nhóm oxo để thu được nhóm thế aryloyl tương ứng.
Thuật ngữ “alkylen” và tiền tố “alk-,” như được sử dụng ở đây, biểu thị nhóm hydrocacbon hóa trị hai bão hòa thu được từ hydrocacbon bão hòa mạch thẳng hoặc mạch nhánh bằng cách loại bỏ hai nguyên tử hydro, và được lấy ví dụ bằng metylen, etylen, isopropylen, và những thứ tương tự. Thuật ngữ “Cx-yalkylene” và tiền tố “Cx-yalk-” đại diện cho các nhóm alkylene có từ nguyên tử cacbon x đến y. Các giá trị mẫu mực cho x là 1, 2, 3, 4, 5 và 6 và các giá trị mẫu mực cho y là 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, hoặc 20 (ví dụ: C1-6, C1-10, C2-20, C2-6, C2-10, hoặc C2-20alkyl). Theo một số phương án, alkyl có thể được thế tiếp bằng nhóm 1, 2, 3 hoặc 4 thế như được xác định ở đây cho nhóm alkyl.
Thuật ngữ “alkylsulfinyl,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm alkyl được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nhóm —S(O)—. Các nhóm alkylsulfinyl không được thế được lấy làm ví dụ là từ 1 đến 6, từ 1 đến 10, hoặc từ 1 đến 20 nguyên tử cacbon. Theo một số phương án, nhóm alkyl có thể được thế tiếp bằng nhóm 1, 2, 3 hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây.
Thuật ngữ “alkylsulfinylalkyl,” như được sử dụng ở đây, biểu thị nhóm alkyl, như được định nghĩa ở đây, được thế bằng nhóm alkylsulfinyl. Các nhóm alkylsulfinylalkyl không được thế được lấy làm ví dụ là từ 2 đến 12, từ 2 đến 20, hoặc từ 2 đến 40 nguyên tử cacbon. Theo một số phương án, mỗi nhóm alkyl có thể được thế tiếp bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây.
Thuật ngữ “alkynyl,” như được sử dụng ở đây, biểu thị các nhóm chuỗi thẳng hoặc phân nhánh hóa trị một từ 2 đến 20 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 2 đến 4, từ 2 đến 6, hoặc từ 2 đến 10 nguyên tử cacbon) chứa liên kết ba cacbon-cacbon và được lấy làm ví dụ là ethynyl, 1-propynyl, và chất tương tự. Các nhóm alkynyl có thể được thế tùy ý bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế được chọn, độc lập, từ aryl, xycloalkyl, hoặc dị vòng (ví dụ, dị vòng), như được xác định ở đây, hoặc nhóm thế alkyl ví dụ bất kỳ được mô tả ở đây .
Thuật ngữ “alkynyloxy” đại diện cho một nhóm thế hóa học có công thức —OR, trong đó R là C2-20nhóm alkynyl (ví dụ, C2-6hoặc C2-10alkynyl), trừ khi có quy định khác. Các nhóm alkynyloxy được lấy làm ví dụ bao gồm ethynyloxy, propynyloxy, và nhóm tương tự. Theo một số phương án, nhóm alkynyl có thể được thế tiếp bằng nhóm 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây (ví dụ, nhóm hydroxy).
Thuật ngữ “amidin,” như được sử dụng ở đây, tượng trưng cho —C(═NH)NH2nhóm.
Thuật ngữ “amino,” như được sử dụng ở đây, tượng trưng cho —N(RN1)2, trong đó mỗi RN1độc lập là H, OH, NO2, N(RN2)2, VÌ THẾ2HOẶCN2, VÌ THẾ2RN2, xin lỗiN2, nhóm bảo vệ N, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aryl, alkaryl, xycloalkyl, alkcycloalkyl, carboxyalkyl, sulfoalkyl, dị vòng (ví dụ, nitroaryl), hoặc alkheterocyclyl (ví dụ, alkheteroaryl), trong đó mỗi nhóm trong số này kể lại RN1các nhóm có thể được thay thế tùy ý, như được xác định ở đây cho mỗi nhóm; hoặc hai RN1kết hợp để tạo thành dị vòng hoặc nhóm bảo vệ N, và trong đó mỗi RN2độc lập là H, alkyl, hoặc aryl. Nhóm amino theo sáng chế có thể là amino không được thế (tức là —NH2) hoặc amino thay thế (tức là —N(RN1)2). Theo một phương án được ưu tiên, amino là —NH2hoặc —NHRN1, trong đó RN1độc lập là OH, NO2, NH2, NRN22, VÌ THẾ2HOẶCN2, VÌ THẾ2RN2, xin lỗiN2, alkyl, carboxyalkyl, sulfoalkyl, hoặc aryl, và mỗi RN2có thể là H, C1-20alkyl (ví dụ, C1-6alkyl) hoặc C6-10aryl.
Thuật ngữ “axit amin,” như được mô tả ở đây, được dùng để chỉ phân tử có chuỗi bên, nhóm amino, và nhóm axit (ví dụ, nhóm cacboxy của—CO2H hoặc nhóm sulfo của -SO3H), trong đó axit amin được gắn vào nhóm phân tử gốc bằng chuỗi bên, nhóm amino, hoặc nhóm axit (ví dụ, chuỗi bên). Theo một số phương án, axit amin được gắn vào nhóm phân tử gốc bằng nhóm cacbonyl, trong đó chuỗi bên hoặc nhóm amino được gắn vào nhóm cacbonyl. Chuỗi bên được lấy làm ví dụ bao gồm alkyl, aryl, dị vòng, alkaryl, alkheterocyclyl, aminoalkyl, carbamoylalkyl, và carboxyalkyl được thế tùy ý. Axit amin ví dụ bao gồm alanin, arginin, asparagine, axit aspartic, cystein, axit glutamic, glutamin, glyxin, histidin, hydroxynorvalin, isoleuxin, leuxin, lysin, methionin, norvaline, ornithin, phenylalanin, proline, pyrrolysin, selenocystein, serin, taurine, threonine, tryptophan, tyrosine và valine. Các nhóm axit amin có thể được thay thế tùy ý bằng một, hai, ba hoặc, trong trường hợp nhóm axit amin có hai nguyên tử cacbon trở lên, bốn nhóm thế được chọn độc lập từ nhóm bao gồm: (1) C1-6kiềm; (2) C1-6alkylsulfinyl; (3) amino, như được định nghĩa ở đây (ví dụ, amino không được thế (tức là, —NH2) hoặc amino thay thế (tức là —N(RN1)2, trong đó RN1được xác định cho amino); (4) C6-10aryl-C1-6kiềm; (5) azido; (6) hào quang; (7) (C2-9dị vòng)oxy; (8) hydroxy; (9) nitơ; (10) oxo (ví dụ, carboxyaldehyde hoặc acyl); (11) C1.7 spirocyclyl; (12) thioalkoxy; (13) thiol; (14) -CO2RMỘT', trong đó RMỘT'được chọn từ nhóm gồm (a) C1-20alkyl (ví dụ, C1-6alkyl), (b) C2-20alkenyl (ví dụ, C2-6ankenyl), (c) C6-10aryl, (d) hydro, (e) C1-6kiềm-C6-10aryl, (f) amino-C1-20alkyl, (g) polyetylen glycol của —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl, và (h) amino-polyethylene glycol của —NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6, hoặc từ 1 đến 10), và mỗi RN độc lập là hydro hoặc C được thế tùy ý1-6alkyl; (15) —C(O)NRB'Rc', trong đó mỗi RB′và RC'được chọn độc lập từ nhóm gồm (a) hydro, (b) C1-6alkyl, (c) C6-10aryl và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (16) -SO2RD', trong đó RD'được chọn từ nhóm gồm (a) C1-6alkyl, (b) C6-10aryl, (c) C1-6kiềm-C6-10aryl và (d) hydroxy; (17) —SO2NRE’RF’, trong đó mỗi RE’và RF’được chọn độc lập từ nhóm gồm (a) hydro, (b) C1-6alkyl, (c) C6-10aryl và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (18) —C(O)RG′, trong đó RG′được chọn từ nhóm gồm (a) C1-20alkyl (ví dụ, C1-6alkyl), (b) C2-20alkenyl (ví dụ, C2-6ankenyl), (c) C6-10aryl, (d) hydro, (e) C1-6kiềm-C6-10aryl, (f) amino-C1-20alkyl, (g) polyetylen glycol của —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl, và (h) amino-polyethylene glycol của —NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và mỗi RN1độc lập là hydro hoặc C được thay thế tùy ý1-6alkyl; (19) —NRH’C(O)R′ trong đó RH’được chọn từ nhóm gồm (al) hydro và (b1) C1-6alkyl và R được chọn từ nhóm gồm (a2) C1-20alkyl (ví dụ, C1-6alkyl), (b2) C2-20alkenyl (ví dụ, C2-6ankenyl), (c2) C6-10aryl, (d2) hydro, (e2) C1-6kiềm-C6-10aryl, (f2) amino-C1-20alkyl, (g2) polyetylen glycol của —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl, và (h2) amino-polyethylene glycol của —NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và mỗi RN1độc lập là hydro hoặc C được thay thế tùy ý1-6alkyl; (20) —NRJ’C(O)HOẶCK’, trong đó RJ’được chọn từ nhóm gồm (a1) hydro và (b1) C1-6alkyl và RK’được chọn từ nhóm gồm (a2) C1-20alkyl (ví dụ, C1-6alkyl), (b2) C2-20alkenyl (ví dụ, C2-6ankenyl), (c2) C6-10aryl, (d2) hydro, (e2) C1-6kiềm-C6-10aryl, (f2) amino-C1-20alkyl, (g2) polyetylen glycol của —(CH2)s2(VÀ2CH2)s1(CH2)s3HOẶC', trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6, từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và R′ là H hoặc C1-20alkyl, và (h2) amino-polyethylene glycol của —NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1trong đó s1 là số nguyên từ 1 đến 10 (ví dụ, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 4), mỗi s2 và s3, độc lập, là số nguyên từ 0 đến 10 (ví dụ, từ 0 đến 4, từ 0 đến 6 , từ 1 đến 4, từ 1 đến 6 hoặc từ 1 đến 10) và mỗi RN1độc lập là hydro hoặc C được thay thế tùy ý1-6alkyl; và (21) amitin. Theo một số phương án, mỗi nhóm trong số này có thể được thay thế thêm như được mô tả ở đây.
Thuật ngữ “aminoalkoxy,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm alkoxy, như được định nghĩa ở đây, được thay thế bằng nhóm amino, như được định nghĩa ở đây. Mỗi alkyl và amino có thể được thế tiếp bằng các nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được mô tả ở đây đối với nhóm tương ứng (ví dụ, CO2RMỘT', trong đó RMỘT'được chọn từ nhóm gồm (a) C1-6alkyl, (b) C6-10 aryl, (c) hydro và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl, ví dụ, cacboxy).
Thuật ngữ “aminoalkyl,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm alkyl, như được định nghĩa ở đây, được thay thế bằng nhóm amino, như được định nghĩa ở đây. Mỗi alkyl và amino có thể được thế tiếp bằng các nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được mô tả ở đây đối với nhóm tương ứng (ví dụ, CO2RMỘT', trong đó RMỘT'được chọn từ nhóm gồm (a) C1-6alkyl, (b) C6-10aryl, (c) hydro và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl, ví dụ, cacboxy).
Thuật ngữ “aryl,” như được sử dụng ở đây, thể hiện hệ vòng cacbo vòng đơn, hai vòng, hoặc đa vòng có một hoặc hai vòng thơm và được lấy ví dụ bởi phenyl, naphthyl, 1,2-dihydronaphthyl, 1,2,3,4- tetrahydronaphthyl, anthracenyl, phenanthrenyl, fluorenyl, indanyl, indenyl, và các chất tương tự, và có thể tùy ý được thế bằng 1, 2, 3, 4 hoặc 5 nhóm thế được chọn độc lập từ nhóm bao gồm: (1) C1.7 acyl (ví dụ , cacboxyaldehyde); (2) C1-20alkyl (ví dụ, C1-6alkyl, C1-6alkoxy-C1-6alkyl, C1-6alkylsulfinyl-C1-6alkyl, amino-C1-6alkyl, azido-C1-6alkyl, (cacboxyaldehyde)-C1-6alkyl, halo-C1-6alkyl (ví dụ, perfluoroalkyl), hydroxy-C1-6alkyl, nitro-C1-6alkyl hoặc C1-6thioalkoxy-C1-6alkyl); (3) C1-20alkoxy (ví dụ, C1-6alkoxy, chẳng hạn như perfluoroalkoxy); (4) C1-6alkylsulfinyl; (5) C6-10aryl; (6) amin; (7) C1-6kiềm-C6-10aryl; (8) azido; (9) C3-8xycloalkyl; (10) C1-6kiềm-C3-8xycloalkyl; (11) hào quang; (12) C1-12dị vòng (ví dụ, C1-12dị vậtl); (13) (C1-12dị vòng)oxy; (14) hydroxy; (15) nitơ; (16) C1-20thioalkoxy (ví dụ, C1-6thioalkoxy); (17) —(CH2)qCO2RMỘT', trong đó q là số nguyên từ 0 đến 4 và RMỘT'được chọn từ nhóm gồm (a) C1-6alkyl, (b) C6-10aryl, (c) hydro và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (18) —(CH2)qCONRB′RC', trong đó q là số nguyên từ 0 đến 4 và trong đó RB′và RC'được chọn độc lập từ nhóm gồm (a) hydro, (b) C1-6alkyl, (c) C6-10aryl và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (19) —(CH2)qVÌ THẾ2RD', trong đó q là số nguyên từ 0 đến 4 và trong đó RD'được chọn từ nhóm gồm (a) alkyl, (b) C6-10aryl và (c) alk-C6-10aryl; (20) —(CH2)qVÌ THẾ2NRE’RF’, trong đó q là một số nguyên từ 0 đến 4 và trong đó mỗi RE’và RF’được chọn độc lập từ nhóm gồm (a) hydro, (b) C1-6alkyl, (c) C6-10aryl và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (21) thiol; (22) C6-10aryloxy; (23) C3-8xycloalkoxy; (24) C6-10aryl-C1-6kiềm; (25) C1-6kiềm-C1-12dị vòng (ví dụ, C1-6kiềm-C1-12dị vậtl); (26) C2-20ankenyl; và (27) C2-20alkynyl. Theo một số phương án, mỗi nhóm trong số này có thể được thay thế thêm như được mô tả ở đây. Ví dụ, nhóm alkylene của C1-alkaryl hoặc C1-alkheterocyclyl có thể được thế tiếp bằng nhóm oxo để thu được nhóm thế aryloyl và (heterocyclyl)oyl tương ứng.
Thuật ngữ “arylalkoxy,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm alkaryl, như được xác định ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nguyên tử oxy. Các nhóm alkoxyalkyl không được thế được lấy làm ví dụ bao gồm từ 7 đến 30 nguyên tử cacbon (ví dụ, từ 7 đến 16 hoặc từ 7 đến 20 nguyên tử cacbon, như C6-10aryl-C1-6kiềm, C6-10aryl-C1-10alkoxy hoặc C6-10aryl-C1-20alkoxy). Theo một số phương án, nhóm arylalkoxy có thể được thế bằng 1, 2, 3 hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây
Thuật ngữ “aryloxy” biểu thị một nhóm thế hóa học có công thức —OR′, trong đó R′ là nhóm aryl gồm 6 đến 18 nguyên tử cacbon, trừ khi được quy định khác. Theo một số phương án, nhóm aryl có thể được thế bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây.
Thuật ngữ “aryloyl,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm aryl, như được định nghĩa ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nhóm cacbonyl. Các nhóm aryyl không được thế được lấy làm ví dụ có từ 7 đến 11 nguyên tử cacbon. Theo một số phương án, nhóm aryl có thể được thế bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây.
Thuật ngữ “azido” đại diện cho một —N3nhóm, cũng có thể được biểu diễn dưới dạng —N═N═N.
Thuật ngữ “hai vòng,” như được sử dụng ở đây, được dùng để chỉ cấu trúc có hai vòng, mà có thể thơm hoặc không thơm. Cấu trúc hai vòng bao gồm các nhóm spirocyclyl, như được xác định ở đây, và hai vòng có chung một hoặc nhiều cầu nối, trong đó các cầu nối này có thể bao gồm một nguyên tử hoặc chuỗi bao gồm hai, ba, hoặc nhiều nguyên tử. Nhóm hai vòng ví dụ bao gồm nhóm cacbocyclyl hai vòng, trong đó vòng thứ nhất và vòng thứ hai là nhóm cacbocyclyl, như được xác định ở đây; nhóm aryl hai vòng, trong đó vòng thứ nhất và vòng thứ hai là nhóm aryl, như được xác định ở đây; nhóm dị vòng hai vòng, trong đó vòng thứ nhất là nhóm dị vòng và vòng thứ hai là nhóm carbocyclyl (ví dụ, aryl) hoặc dị vòng (ví dụ, dị vòng); và nhóm dị vòng hai vòng, trong đó vòng thứ nhất là nhóm dị vòng và vòng thứ hai là nhóm carbocyclyl (ví dụ, aryl) hoặc nhóm dị vòng (ví dụ, dị vòng). Theo một số phương án, nhóm hai vòng có thể được thế bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây cho nhóm xycloalkyl, dị vòng, và aryl.
Thuật ngữ “carbocyclyl” và “carbocyclyl,” như được sử dụng ở đây, được dùng để chỉ C được thay thế tùy chọn.3-12cấu trúc một vòng, hai vòng hoặc ba vòng trong đó các vòng, có thể thơm hoặc không thơm, được tạo thành bởi các nguyên tử cacbon. Cấu trúc vòng cacbon bao gồm các nhóm cycloalkyl, cycloalkenyl và aryl.
Thuật ngữ “carbamoyl,” như được sử dụng ở đây, thể hiện —C(O)—N(RN1)2, trong đó ý nghĩa của mỗi RN1được tìm thấy trong định nghĩa về “amino” được đề xuất ở đây.
Thuật ngữ “carbamoylalkyl,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm alkyl, như được định nghĩa ở đây, được thế bằng nhóm carbamoyl, như được định nghĩa ở đây. Nhóm alkyl có thể được thế tiếp bằng nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được mô tả ở đây.
Thuật ngữ “carbamyl,” như được sử dụng ở đây, được dùng để chỉ nhóm carbamate có cấu trúc —NRN1C(═O)HOẶC hoặc —OC(═O)N(RN1)2, trong đó ý nghĩa của mỗi RN1được tìm thấy trong định nghĩa về “amino” được đề xuất ở đây, và R là alkyl, xycloalkyl, alkcycloalkyl, aryl, alkaryl, dị vòng (ví dụ, dị vòng), hoặc alkheterocyclyl (ví dụ, alkheteroaryl), như được xác định ở đây.
Thuật ngữ “cacbonyl,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm C(O), nhóm này cũng có thể được biểu thị là C═O.
Thuật ngữ “cacboxyaldehyde” biểu thị nhóm acyl có cấu trúc -CHO.
Thuật ngữ “cacboxy,” như được sử dụng ở đây, có nghĩa là—CO2H.
Thuật ngữ “carboxyalkoxy,” như được sử dụng ở đây, biểu thị nhóm alkoxy, như được định nghĩa ở đây, được thay thế bằng nhóm carboxy, như được định nghĩa ở đây. Nhóm alkoxy có thể được thế tiếp bằng nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được mô tả ở đây đối với nhóm alkyl.
Thuật ngữ “carboxyalkyl,” như được sử dụng ở đây, biểu thị nhóm alkyl, như được định nghĩa ở đây, được thay thế bằng nhóm carboxy, như được định nghĩa ở đây. Nhóm alkyl có thể được thế tiếp bằng nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được mô tả ở đây.
Thuật ngữ “cyano,” như được sử dụng ở đây, đại diện cho nhóm —CN.
Thuật ngữ “cycloalkoxy” đại diện cho một nhóm thế hóa học có công thức —OR, trong đó R là C3-8nhóm xycloalkyl, như được xác định ở đây, trừ khi có quy định khác. Nhóm xycloalkyl có thể được thế tiếp bằng nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được mô tả ở đây. Các nhóm xycloalkoxy không được thế được lấy làm ví dụ là từ 3 đến 8 nguyên tử cacbon. Theo một số phương án, nhóm xycloalkyl có thể được thế tiếp bằng nhóm 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được mô tả ở đây.
Thuật ngữ “xycloalkyl,” như được sử dụng ở đây biểu thị nhóm hydrocacbon vòng không thơm bão hòa hóa trị một hoặc không bão hòa từ ba đến tám nguyên tử cacbon, trừ khi có quy định khác, và được lấy ví dụ bằng xyclopropyl, xyclobutyl, xyclopentyl, xyclohexyl, xycloheptyl, bicyclo[2.2.1 .]heptyl, và những thứ tương tự. Khi nhóm xycloalkyl bao gồm một liên kết đôi cacbon-cacbon thì nhóm xycloalkyl có thể được gọi là nhóm “cycloalkenyl”. Các nhóm xycloalkenyl được lấy làm ví dụ bao gồm xyclopentenyl, xyclohexenyl, và nhóm tương tự. Các nhóm xycloalkyl theo sáng chế có thể được thay thế tùy ý bằng: (1) C1-7acyl (ví dụ, cacboxyaldehyde); (2) C1-20alkyl (ví dụ, C1-6alkyl, C1-6alkoxy-C1-6alkyl, C1-6alkylsulfinyl-C1-6alkyl, amino-C1-6alkyl, azido-C1-6 alkyl, (cacboxyaldehyde)-C1-6alkyl, halo-C1-6alkyl (ví dụ, perfluoroalkyl), hydroxy-C1-6 alkyl, nitro-C1-6 alkyl, hoặc C1-6thioalkoxy-C1-6alkyl); (3) C1-20alkoxy (ví dụ, C1-6alkoxy, chẳng hạn như perfluoroalkoxy); (4) C1-6alkylsulfinyl; (5) C6-10aryl; (6) amin; (7) C1-6kiềm-C6-10aryl; (8) azido; (9) C3-8xycloalkyl; (10) C1-6kiềm-C3-8xycloalkyl; (11) hào quang; (12) Dị vòng C1-12 (ví dụ, C1-12dị vậtl); (13) (C1-12dị vòng)oxy; (14) hydroxy; (15) nitơ; (16) C1-20thioalkoxy (ví dụ, C1-6thioalkoxy); (17) —(CH2)qCO2RMỘT', trong đó q là số nguyên từ 0 đến 4 và RMỘT'được chọn từ nhóm gồm (a) C1-6alkyl, (b) C6-10aryl, (c) hydro và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (18) —(CH2)qCONRB′RC', trong đó q là số nguyên từ 0 đến 4 và trong đó RB′và RC'được chọn độc lập từ nhóm gồm (a) hydro, (b) C6-10alkyl, (c) C6. 10 aryl và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (19) —(CH2)qVÌ THẾ2RD', trong đó q là số nguyên từ 0 đến 4 và trong đó RD'được chọn từ nhóm gồm (a) C6-10alkyl, (b) C6-10aryl và (c) C1-6kiềm-C6-10aryl; (20) —(CH2)qVÌ THẾ2NRE’RF’, trong đó q là một số nguyên từ 0 đến 4 và trong đó mỗi RE' và RF' được chọn độc lập từ nhóm gồm (a) hydro, (b) C6-10alkyl, (c) C6-10aryl và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (21) thiol; (22) C6-10aryloxy; (23) C3-8xycloalkoxy; (24) C6-10aryl-C1-6kiềm; (25) C1-6kiềm-C1-12dị vòng (ví dụ, C1-6kiềm-C1-12dị vậtl); (26) oxo; (27) C2-20ankenyl; và (28) C2-20alkynyl. Theo một số phương án, mỗi nhóm trong số này có thể được thay thế thêm như được mô tả ở đây. Ví dụ, nhóm alkylene của C1-alkaryl hoặc C1-alkheterocyclyl có thể được thế tiếp bằng nhóm oxo để thu được nhóm thế aryloyl và (heterocyclyl)oyl tương ứng.
Thuật ngữ “chất đồng phân không đối quang,” như được sử dụng ở đây có nghĩa là chất đồng phân lập thể không phải là hình ảnh phản chiếu của nhau và không thể xếp chồng lên nhau.
Thuật ngữ “lượng hữu hiệu” của chất, như được sử dụng ở đây, là lượng đủ để tạo ra các kết quả có lợi hoặc mong muốn, ví dụ, kết quả lâm sàng, và, như vậy, “lượng hữu hiệu” phụ thuộc vào bối cảnh mà nó đang được sử dụng. áp dụng. Ví dụ, trong trường hợp sử dụng chất điều trị bệnh ung thư, lượng hữu hiệu của chất này là, ví dụ, lượng đủ để đạt được hiệu quả điều trị bệnh ung thư, như được xác định ở đây, so với phản ứng thu được khi không sử dụng chất này .
Thuật ngữ “chất đồng phân đối ảnh,” như được sử dụng ở đây, có nghĩa là mỗi dạng hoạt tính quang học riêng lẻ của hợp chất theo sáng chế, có độ tinh khiết quang học hoặc lượng dư chất đồng phân đối ảnh (như được xác định bằng tiêu chuẩn phương pháp trong lĩnh vực kỹ thuật này) ít nhất là 80% (tức là, ít nhất 90% của một chất đồng phân đối ảnh và nhiều nhất là 10% chất đồng phân đối ảnh khác), tốt hơn là ít nhất là 90% và tốt hơn nữa ít nhất là 98%.
Thuật ngữ “quầng,” như được sử dụng ở đây, tượng trưng cho halogen được chọn từ brom, clo, iốt, hoặc flo.
Thuật ngữ “haloalkoxy,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm alkoxy, như được định nghĩa ở đây, được thế bằng nhóm halogen (tức là, F, Cl, Br, hoặc I). Một haloalkoxy có thể được thế bằng một, hai, ba, hoặc, trong trường hợp nhóm alkyl có hai nguyên tử cacbon trở lên, bốn halogen. Các nhóm halogenalkoxy bao gồm perfluoroalkoxys (ví dụ: -OCF3), —OCHF2, -VÀ2F, -OCCl3, -VÀ2CH2Thương hiệu2CH(CH2CH2Br)CH3, và —OCHICH3. Theo một số phương án, nhóm haloalkoxy có thể được thế tiếp bằng các nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được mô tả ở đây đối với nhóm alkyl.
Thuật ngữ “haloalkyl,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm alkyl, như được định nghĩa ở đây, được thế bằng nhóm halogen (tức là, F, Cl, Br, hoặc I). Haloalkyl có thể được thế bằng một, hai, ba, hoặc, trong trường hợp nhóm alkyl có hai nguyên tử cacbon trở lên, bốn halogen. Các nhóm halogenalkyl bao gồm perfluoroalkyl (ví dụ: —CF3), —CHF2, —CH2F, -CCl3, —CH2CH2Anh, —CH2CH(CH2CH2Br)CH3, và —CHICH3. Theo một số phương án, nhóm haloalkyl có thể được thế tiếp bằng các nhóm thế 1, 2, 3 hoặc 4 như được mô tả ở đây đối với nhóm alkyl.
Thuật ngữ “heteroalkylene,” như được sử dụng ở đây, để chỉ nhóm alkylene, như được định nghĩa ở đây, trong đó một hoặc hai nguyên tử cacbon cấu thành từng được thay thế bằng nitơ, oxy, hoặc lưu huỳnh. Theo một số phương án, nhóm metaalkylen có thể được thế tiếp bằng nhóm 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được mô tả ở đây đối với nhóm alkyl.
Thuật ngữ “heteroaryl,” như được sử dụng ở đây, biểu thị tập hợp con của các dị vòng, như được định nghĩa ở đây, là thơm: tức là, chúng chứa 4n+2 pi electron trong hệ vòng đơn hoặc đa vòng. Các nhóm dị vòng không được thế được lấy làm ví dụ là từ 1 đến 12 (ví dụ, 1 đến 11, 1 đến 10, 1 đến 9, 2 đến 12, 2 đến 11, 2 đến 10, hoặc 2 đến 9) nguyên tử cacbon. Theo một số phương án, dị vòng được thay thế bằng nhóm 1, 2, 3 hoặc 4 nhóm thế như được xác định cho nhóm dị vòng.
Thuật ngữ “heterocyclyl,” như được sử dụng ở đây thể hiện vòng 5, 6 hoặc 7 cạnh, trừ khi có quy định khác, chứa một, hai, ba hoặc bốn nguyên tử khác loại được chọn độc lập từ nhóm bao gồm nitơ, oxy, và lưu huỳnh. Vòng 5 cạnh có từ 0 đến 2 liên kết đôi và vòng 6 và 7 cạnh có từ 0 đến 3 liên kết đôi. Các nhóm dị vòng không được thế được lấy làm ví dụ là từ 1 đến 12 (ví dụ, 1 đến 11, 1 đến 10, 1 đến 9, 2 đến 12, 2 đến 11, 2 đến 10, hoặc 2 đến 9) nguyên tử cacbon. Thuật ngữ “heterocyclyl” cũng thể hiện hợp chất dị vòng có cấu trúc đa vòng bắc cầu trong đó một hoặc nhiều nguyên tử cacbon và/hoặc nguyên tử khác loại kết nối hai thành viên không liền kề của vòng một vòng, ví dụ, nhóm quinuclidinyl. Thuật ngữ “heterocyclyl” bao gồm các nhóm hai vòng, ba vòng và bốn vòng trong đó vòng dị vòng bất kỳ nêu trên được kết hợp với một, hai hoặc ba vòng vòng carbo, ví dụ, vòng aryl, vòng xyclohexan, vòng xyclohexen, vòng xyclopentan , vòng xyclopentene, hoặc vòng dị vòng một vòng khác, như indolyl, quinolyl, isoquinolyl, tetrahydroquinolyl, benzofuryl, benzothienyl và các vòng tương tự. Ví dụ về các dị vòng ngưng tụ bao gồm tropan và 1,2,3,5,8,8a-hexahydroindolizine. Dị vòng bao gồm pyrrolyl, pyrrolinyl, pyrrolidinyl, pyrazolyl, pyrazolinyl, pyrazolidinyl, imidazolyl, imidazolinyl, imidazolidinyl, pyridyl, piperidinyl, hom*opiperidinyl, pyrazinyl, piperazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, oxazolyl, oxazolidinyl, isoxazolyl, isoxazolidiniyl, , thiomorpholinyl, thiazolyl, thiazolidinyl, isothiazolyl, isothiazolidinyl, indolyl, indazolyl, quinolyl, isoquinolyl, quinoxalinyl, dihydroquinoxalinyl, quinazolinyl, cinnolinyl, phthalazinyl, benzimidazolyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, benzothiadiazolyl, furyl, thienyl, thiazolidinyl, isothiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, oxadiazolyl ( ví dụ: 1,2, 3-oxadiazolyl), purinyl, thiadiazolyl (ví dụ, 1,2,3-thiadiazolyl), tetrahydrofuranyl, dihydrofuranyl, tetrahydrothienyl, dihydrothienyl, dihydroindolyl, dihydroquinolyl, tetrahydroquinolyl, tetrahydroisoquinolyl, dihydroisoquinolyl, pyranyl, dihydropyranyl, dithiazolyl, benzofuranyl, isobenzofuranyl, benzothienyl, , và dạng tương tự, bao gồm các dạng dihydro và tetrahydro của chúng, trong đó một hoặc nhiều liên kết đôi bị khử và được thay thế bằng hydro. Các dị vòng được lấy làm ví dụ khác bao gồm: 2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo-oxazolyl; 2,3-dihydro-2-oxo-1H-imidazolyl; 2,3,4,5-tetrahydro-5-oxo-1H-pyrazolyl (ví dụ, 2,3,4,5-tetrahydro-2-phenyl-5-oxo-1H-pyrazolyl); 2,3,4,5-tetrahydro-2,4-dioxo-1H-imidazolyl (ví dụ, 2,3,4,5-tetrahydro-2,4-dioxo-5-metyl-5-phenyl-1H-imidazolyl) ; 2,3-dihydro-2-thioxo-1,3,4-oxadiazolyl (ví dụ, 2,3-dihydro-2-thioxo-5-phenyl-1,3,4-oxadiazolyl); 4,5-dihydro-5-oxo-1H-triazolyl (ví dụ, 4,5-dihydro-3-metyl-4-amino 5-oxo-1H-triazolyl); 1,2,3,4-tetrahydro-2,4-dioxopyridinyl (ví dụ, 1,2,3,4-tetrahydro-2,4-dioxo-3,3-diethylpyridinyl); 2,6-dioxo-piperidinyl (ví dụ, 2,6-dioxo-3-etyl-3-phenylpiperidinyl); 1,6-dihydro-6-oxopyridiminyl; 1,6-dihydro-4-oxopyrimidinyl (ví dụ, 2-(metylthio)-1,6-dihydro-4-oxo-5-metylpyrimidin-1-yl); 1,2,3,4-tetrahydro-2,4-dioxopyrimidinyl (ví dụ, 1,2,3,4-tetrahydro-2,4-dioxo-3-ethylpyrimidinyl); 1,6-dihydro-6-oxo-pyridazinyl (ví dụ, 1,6-dihydro-6-oxo-3-etylpyridazinyl); 1,6-dihydro-6-oxo-1,2,4-triazinyl (ví dụ, 1,6-dihydro-5-isopropyl-6-oxo-1,2,4-triazinyl); 2,3-dihydro-2-oxo-1H-indolyl (ví dụ, 3,3-dimethyl-2,3-dihydro-2-oxo-1H-indolyl và 2,3-dihydro-2-oxo-3,3′ -spiropropan-1H-indol-1-yl); 1,3-dihydro-1-oxo-2H-iso-indolyl; 1,3-dihydro-1,3-dioxo-2H-iso-indolyl; 1H-benzopyrazolyl (ví dụ, 1-(ethoxycarbonyl)-1H-benzopyrazolyl); 2,3-dihydro-2-oxo-1H-benzimidazolyl (ví dụ, 3-etyl-2,3-dihydro-2-oxo-1H-benzimidazolyl); 2,3-dihydro-2-oxo-benzoxazolyl (ví dụ, 5-chloro-2,3-dihydro-2-oxo-benzoxazolyl); 2,3-dihydro-2-oxo-benzoxazolyl; 2-oxo-2H-benzopyranyl; 1,4-benzodioxanyl; 1,3-benzodioxanyl; 2,3-dihydro-3-oxo,4H-1,3-benzothiazinyl; 3,4-dihydro-4-oxo-3H-quinazolinyl (ví dụ, 2-metyl-3,4-dihydro-4-oxo-3H-quinazolinyl); 1,2,3,4-tetrahydro-2,4-dioxo-3H-quinazolyl (ví dụ, 1-etyl-1,2,3,4-tetrahydro-2,4-dioxo-3H-quinazolyl); 1,2,3,6-tetrahydro-2,6-dioxo-7H-purinyl (ví dụ, 1,2,3,6-tetrahydro-1,3-dimethyl-2,6-dioxo-7H-purinyl); 1,2,3,6-tetrahydro-2,6-dioxo-1H-purinyl (ví dụ, 1,2,3,6-tetrahydro-3,7-dimethyl-2,6-dioxo-1H-purinyl); 2-oxobenz[c,d]indolyl; 1,1-dioxo-2H-naphth[1,8-c,d]isothiazolyl; và 1,8-naphthylenedicarboxamido. Các dị vòng bổ sung bao gồm 3,3a,4,5,6,6α-hexahydro-pyrrolo[3,4-b]pyrrol-(2H)-yl, và 2,5-diazabicyclo[2.2.1]heptan-2-yl, hom*opiperazinyl (hoặc diazepany), tetrahydropyranyl, dithiazolyl, benzofuranyl, benzothienyl, oxepanyl, thiepanyl, azocanyl, oxecanyl và thiocanyl. Các nhóm dị vòng cũng bao gồm các nhóm có công thức
Ở đâu
-
- E′ được chọn từ nhóm gồm —N— và —CH—; F′ được chọn từ nhóm gồm —N═CH—, —NH—CH2—, —NH—C(O)—, —NH—, —CH═N—, —CH2—NH—, —C(O)—NH—, —CH═CH—, —CH2—, —CH2CH2—, —CH2O—, —VÀ2—, —O—, và —S—; và G′ được chọn từ nhóm gồm —CH— và —N—. Nhóm dị vòng bất kỳ được đề cập ở đây có thể được thế tùy ý bằng một, hai, ba, bốn hoặc năm nhóm thế được chọn độc lập từ nhóm bao gồm: (1) C1-7acyl (ví dụ, cacboxyaldehyde); (2) C1-20alkyl (ví dụ, C1-6alkyl, C1-6alkoxy-C1-6alkyl, C1-6alkylsulfinyl-C1-6alkyl, amino-C1-6alkyl, azido-C1-6alkyl, (cacboxyaldehyde)-C1-6alkyl, halo-C1-6alkyl (ví dụ, perfluoroalkyl), hydroxy-C1-6alkyl, nitro-C1-6alkyl hoặc C1-6thioalkoxy-C1-6alkyl); (3) C1-20alkoxy (ví dụ, C1-6alkoxy, chẳng hạn như perfluoroalkoxy); (4) C1-6alkylsulfinyl; (5) C6-10aryl; (6) amin; (7) C1-6kiềm-C6-10aryl; (8) azido; (9) C3-8xycloalkyl; (10) C1-6kiềm-C3-8xycloalkyl; (11) hào quang; (12) C1-12dị vòng (ví dụ, C2-12dị vậtl); (13) (C1-12dị vòng)oxy; (14) hydroxy; (15) nitơ; (16) C1-20thioalkoxy (ví dụ, C1-6thioalkoxy); (17) —(CH2)qCO2RMỘT', trong đó q là số nguyên từ 0 đến 4 và RMỘT'được chọn từ nhóm gồm (a) C1-6alkyl, (b) C6-10aryl, (c) hydro và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (18) —(CH2)qCONRB‘Rc’, trong đó q là số nguyên từ 0 đến 4 và trong đó RB′và RC'được chọn độc lập từ nhóm gồm (a) hydro, (b) C1-6alkyl, (c) C6-10aryl và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (19) —(CH2)qVÌ THẾ2RD', trong đó q là số nguyên từ 0 đến 4 và trong đó RD'được chọn từ nhóm gồm (a) C1-6alkyl, (b) C6-10aryl và (c) C1-6kiềm-C6-10aryl; (20) —(CH2)qVÌ THẾ2NRE‘RF’, trong đó q là số nguyên từ 0 đến 4 và trong đó mỗi RE′ và RF’được chọn độc lập từ nhóm gồm (a) hydro, (b) C1-6alkyl, (c) C6-10aryl và (d) C1-6kiềm-C6-10aryl; (21) thiol; (22) C6-10aryloxy; (23) C3-8xycloalkoxy; (24) arylalkoxy; (25) C1-6kiềm-C1-12dị vòng (ví dụ, C1-6kiềm-C1-12dị vậtl); (26) oxo; (27) (C1-12dị vòng)imino; (28) C2-20ankenyl; và (29) C2-20alkynyl. Theo một số phương án, mỗi nhóm trong số này có thể được thay thế thêm như được mô tả ở đây. Ví dụ, nhóm alkylene của C1-alkaryl hoặc C1-alkheterocyclyl có thể được thế tiếp bằng nhóm oxo để thu được nhóm thế aryloyl và (heterocyclyl)oyl tương ứng.
Thuật ngữ “(heterocyclyl)imino,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm dị vòng, như được định nghĩa ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nhóm imino. Theo một số phương án, nhóm dị vòng có thể được thế bằng nhóm 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây.
Thuật ngữ “(heterocyclyl)oxy,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm dị vòng, như được định nghĩa ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nguyên tử oxy. Theo một số phương án, nhóm dị vòng có thể được thế bằng nhóm 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây.
Thuật ngữ “(heterocyclyl)oyl,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm dị vòng, như được định nghĩa ở đây, được gắn vào nhóm phân tử gốc thông qua nhóm cacbonyl. Theo một số phương án, nhóm dị vòng có thể được thế bằng nhóm 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được xác định ở đây.
Thuật ngữ “hydrocacbon,” như được sử dụng ở đây, biểu thị một nhóm chỉ bao gồm các nguyên tử cacbon và hydro.
Thuật ngữ “hydroxy,” như được sử dụng ở đây, tượng trưng cho nhóm –OH.
Thuật ngữ “hydroxyalkenyl,” như được sử dụng ở đây, biểu thị nhóm alkenyl, như được định nghĩa ở đây, được thay thế bằng một đến ba nhóm hydroxy, với điều kiện là không nhiều hơn một nhóm hydroxy có thể được gắn vào một nguyên tử cacbon của nhóm alkyl, và được lấy làm ví dụ bởi dihydroxypropenyl, hydroxyisopentenyl, và chất tương tự.
Thuật ngữ “hydroxyalkyl,” như được sử dụng ở đây, biểu thị nhóm alkyl, như được định nghĩa ở đây, được thay thế bằng một đến ba nhóm hydroxy, với điều kiện là không nhiều hơn một nhóm hydroxy có thể được gắn vào một nguyên tử cacbon của nhóm alkyl, và được lấy làm ví dụ bởi hydroxymetyl, dihydroxypropyl, và tương tự.
Thuật ngữ “chất đồng phân,” như được sử dụng ở đây, có nghĩa là chất hỗ biến, chất đồng phân lập thể, chất đồng phân đối ảnh, hoặc chất đồng phân không đối quang của hợp chất bất kỳ theo sáng chế. Người ta thừa nhận rằng các hợp chất theo sáng chế có thể có một hoặc nhiều tâm bất đối và/hoặc liên kết đôi và do đó, tồn tại dưới dạng chất đồng phân lập thể, chẳng hạn như chất đồng phân liên kết đôi (tức là, chất đồng phân E/Z hình học) hoặc chất đồng phân không đối quang (ví dụ, chất đồng phân đối ảnh). (tức là (+) hoặc (-)) hoặc các đồng phân cis/trans). Theo sáng chế, cấu trúc hóa học được mô tả ở đây, và do đó là các hợp chất theo sáng chế, bao gồm tất cả các chất đồng phân lập thể tương ứng, nghĩa là, cả dạng tinh khiết về mặt lập thể (ví dụ, tinh khiết về mặt hình học, tinh khiết về mặt đối quang, hoặc tinh khiết về mặt đối quang) và dạng tinh khiết về mặt đối ảnh và hỗn hợp đồng phân lập thể, ví dụ, racemate. Hỗn hợp đồng phân đối ảnh và đồng phân lập thể của các hợp chất theo sáng chế thường có thể được phân giải thành các chất đồng phân đối ảnh hoặc đồng phân lập thể thành phần của chúng bằng các phương pháp đã biết, chẳng hạn như sắc ký khí pha bất đối, sắc ký lỏng hiệu năng cao pha bất đối, kết tinh hợp chất này thành phức hợp muối bất đối, hoặc kết tinh hợp chất trong dung môi bất đối. Chất đồng phân đối ảnh và chất đồng phân lập thể cũng có thể thu được từ các chất trung gian, thuốc thử và chất xúc tác tinh khiết về mặt lập thể hoặc đối quang bằng các phương pháp tổng hợp bất đối xứng đã biết.
Thuật ngữ “amino được bảo vệ bằng N,” như được sử dụng ở đây, để chỉ nhóm amino, như được định nghĩa ở đây, được gắn vào một hoặc hai nhóm bảo vệ N, như được định nghĩa ở đây.
Thuật ngữ “nhóm bảo vệ N,” như được sử dụng ở đây, biểu thị các nhóm nhằm bảo vệ nhóm amino chống lại các phản ứng không mong muốn trong quy trình tổng hợp. Các nhóm bảo vệ N thường được sử dụng được bộc lộ trong Greene, “Nhóm bảo vệ trong tổng hợp hữu cơ,” 3thứPhiên bản (John Wiley & Sons, New York, 1999), được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Nhóm bảo vệ N bao gồm các nhóm acyl, aryloyl hoặc carbamyl như formyl, acetyl, propionyl, pivaloyl, t-butylacetyl, 2-chloroacetyl, 2-bromoacetyl, trifluoroacetyl, trichloroacetyl, phthalyl, o-nitrophenoxyacetyl, α-chlorobutyryl, benzoyl, 4-chlorobenzoyl, 4-bromobenzoyl, 4-nitrobenzoyl, và các chất trợ chất bất đối như D, L hoặc D được bảo vệ hoặc không được bảo vệ, axit L-amino như alanine, leucine, phenylalanine, và các chất tương tự; các nhóm chứa sulfonyl như benzensulfonyl, p-toluenesulfonyl và các nhóm tương tự; các nhóm tạo cacbamat như benzyloxycarbonyl, p-chlorobenzyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, 2-nitrobenzyloxycarbonyl, p-bromobenzyloxycarbonyl, 3,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, 2 -nitro-4,5-dimetoxybenzyloxycarbonyl, 3,4,5-trimethoxybenzyloxycarbonyl, 1-(p-biphenylyl)-1-metylethoxycarbonyl, α,α-dimetyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, benzhydryloxy carbonyl, t-butyloxycarbonyl, diisopropylmethoxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, ethoxycarbonyl, methoxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2,-trichloroethoxycarbonyl, phenoxycarbonyl, 4-nitrophenoxy carbonyl, fluorenyl-9-metoxycarbonyl, cyclopentyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl, phenylthiocarbonyl, và các nhóm tương tự, nhóm alkaryl như benzyl, triphenylmetyl, benzyloxymetyl, và các nhóm tương tự và silyl, như trimethylsilyl, và các nhóm tương tự. Các nhóm bảo vệ N được ưu tiên là formyl, acetyl, benzoyl, pivaloyl, t-butylacetyl, alanyl, phenylsulfonyl, benzyl, t-butyloxycarbonyl (Boc), và benzyloxycarbonyl (Cbz).
Thuật ngữ “nitro,” như được sử dụng ở đây, tượng trưng cho —KHÔNG2nhóm.
Thuật ngữ “oxo” như được sử dụng ở đây, tượng trưng cho ═O.
Thuật ngữ “perfluoroalkyl,” như được sử dụng ở đây, đại diện cho nhóm alkyl, như được xác định ở đây, trong đó mỗi gốc hydro liên kết với nhóm alkyl đã được thay thế bằng gốc florua. Các nhóm perfluoroalkyl được lấy làm ví dụ bằng triflometyl, pentafluoroetyl, và nhóm tương tự.
Thuật ngữ “perfluoroalkoxy,” như được sử dụng ở đây, đại diện cho nhóm alkoxy, như được xác định ở đây, trong đó mỗi gốc hydro liên kết với nhóm alkoxy đã được thay thế bằng gốc florua. Các nhóm perfluoroalkoxy được lấy làm ví dụ bằng triflometoxy, pentafluoroethoxy, và nhóm tương tự.
Thuật ngữ “spirocyclyl,” như được sử dụng ở đây, tượng trưng cho C2-7alkylene diradical, cả hai đầu của nó được liên kết với cùng một nguyên tử cacbon của nhóm gốc để tạo thành nhóm vòng xoắn, và cũng là nhóm C1-6dị alkylene diradical, cả hai đầu của chúng được liên kết với cùng một nguyên tử. Gốc dị loại tạo thành nhóm spirocyclyl có thể chứa một, hai, ba hoặc bốn dị tố được chọn độc lập từ nhóm bao gồm nitơ, oxy và lưu huỳnh. Theo một số phương án, nhóm spirocyclyl bao gồm từ một đến bảy nguyên tử cacbon, ngoại trừ nguyên tử cacbon mà gốc hai gốc được gắn vào. Các nhóm spirocyclyl theo sáng chế có thể được thay thế tùy ý bằng 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế được đề xuất ở đây làm nhóm thế tùy chọn cho nhóm xycloalkyl và/hoặc dị vòng.
Thuật ngữ “đồng phân lập thể,” như được sử dụng ở đây, dùng để chỉ tất cả các dạng đồng phân khác nhau cũng như các dạng hình dạng mà hợp chất có thể có (ví dụ, hợp chất có công thức bất kỳ được mô tả ở đây), đặc biệt là tất cả các dạng đồng phân hình dạng và hóa học lập thể có thể có, tất cả các đồng phân không đối quang , chất đồng phân đối ảnh và/hoặc chất phù hợp của cấu trúc phân tử cơ bản. Một số hợp chất theo sáng chế có thể tồn tại ở các dạng hỗ biến khác nhau, tất cả các dạng sau đều nằm trong phạm vi của sáng chế.
Thuật ngữ “sulfoalkyl,” như được sử dụng ở đây, biểu thị nhóm alkyl, như được định nghĩa ở đây, được thế bằng nhóm sulfo của —SO3H. Theo một số phương án, nhóm alkyl có thể được thế tiếp bằng nhóm 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được mô tả ở đây.
Thuật ngữ “sulfonyl,” như được sử dụng ở đây, tượng trưng cho—S(O)2- nhóm.
Thuật ngữ “thioalkaryl,” như được sử dụng ở đây, thể hiện nhóm thế hóa học có công thức —SR, trong đó R là nhóm alkaryl. Theo một số phương án, nhóm alkaryl có thể được thế tiếp bằng nhóm 1, 2, 3 hoặc 4 nhóm thế như được mô tả ở đây.
Thuật ngữ “thioalkheterocyclyl,” như được sử dụng ở đây, đại diện cho nhóm thế hóa học có công thức—SR, trong đó R là nhóm alkheterocyclyl. Theo một số phương án, nhóm alkheterocyclyl có thể được thế tiếp bằng nhóm 1, 2, 3 hoặc 4 nhóm thế như được mô tả ở đây.
Thuật ngữ “thioalkoxy,” như được sử dụng ở đây, đại diện cho nhóm thế hóa học có công thức—SR, trong đó R là nhóm alkyl, như được định nghĩa ở đây. Theo một số phương án, nhóm alkyl có thể được thế tiếp bằng nhóm 1, 2, 3, hoặc 4 nhóm thế như được mô tả ở đây.
Thuật ngữ “thiol” đại diện cho nhóm –SH.
Hợp chất: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “hợp chất” được hiểu là bao gồm tất cả các chất đồng phân lập thể, chất đồng phân hình học, chất hỗ biến, và chất đồng vị của các cấu trúc được mô tả.
Các hợp chất được mô tả ở đây có thể không đối xứng (ví dụ, có một hoặc nhiều tâm lập thể). Tất cả các chất đồng phân lập thể, chẳng hạn như chất đồng phân đối ảnh và chất đồng phân không đối quang, đều được dự định trừ khi có quy định khác. Các hợp chất theo sáng chế chứa các nguyên tử cacbon được thay thế không đối xứng có thể được phân lập ở dạng có hoạt tính quang học hoặc dạng racemic. Các phương pháp điều chế các dạng có hoạt tính quang học từ nguyên liệu ban đầu có hoạt tính quang học đã được biết đến trong lĩnh vực kỹ thuật này, chẳng hạn như bằng cách phân giải hỗn hợp racemic hoặc bằng phương pháp tổng hợp chọn lọc lập thể. Nhiều chất đồng phân hình học của olefin, liên kết đôi C═N, và tương tự cũng có thể có mặt trong các hợp chất được mô tả ở đây, và tất cả các chất đồng phân ổn định như vậy đều được đề cập trong sáng chế. Đồng phân hình học cis và trans của hợp chất theo sáng chế được mô tả và có thể được phân lập ở dạng hỗn hợp của các đồng phân hoặc ở dạng đồng phân riêng biệt.
Các hợp chất theo sáng chế cũng bao gồm các dạng hỗ biến. Các dạng hỗ biến là kết quả của việc hoán đổi một liên kết đơn với một liên kết đôi liền kề và sự di chuyển đồng thời của một proton. Các dạng hỗ biến bao gồm các chất hỗ biến nguyên hướng là các trạng thái proton hóa đồng phân có cùng công thức thực nghiệm và tổng điện tích. Ví dụ về hỗ biến hỗ biến prototropic bao gồm các cặp xeton-enol, các cặp axit amit-imidic, các cặp lactam-lactim, các cặp axit amit-imidic, các cặp enamine-imine, và các dạng hình khuyên trong đó proton có thể chiếm hai hoặc nhiều vị trí của hệ dị vòng, chẳng hạn như , 1H- và 3H-imidazole, 1H-, 2H- và 4H-1,2,4-triazole, 1H- và 2H-isoindole, và 1H- và 2H-pyrazole. Các dạng hỗ biến có thể ở trạng thái cân bằng hoặc được khóa chặt về mặt không gian vào một dạng bằng cách thay thế thích hợp.
Các hợp chất theo sáng chế cũng bao gồm tất cả các đồng vị của nguyên tử xuất hiện trong các hợp chất trung gian hoặc hợp chất cuối cùng. “Đồng vị” dùng để chỉ các nguyên tử có cùng số nguyên tử nhưng số khối khác nhau do số neutron trong hạt nhân khác nhau. Ví dụ, các đồng vị của hydro bao gồm tritium và deuterium.
Các hợp chất và muối theo sáng chế có thể được điều chế kết hợp với các phân tử dung môi hoặc nước để tạo thành solvat và hydrat bằng các phương pháp thông thường.
Được bảo tồn: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “được bảo tồn” để chỉ các gốc nucleotit hoặc axit amin của trình tự polynucleotit hoặc trình tự polypeptit, tương ứng, là những trình tự xuất hiện không biến đổi ở cùng một vị trí của hai hoặc nhiều trình tự được so sánh. Nucleotide hoặc axit amin được bảo tồn tương đối là những nucleotit hoặc axit amin được bảo tồn giữa các trình tự có liên quan nhiều hơn so với các nucleotide hoặc axit amin xuất hiện ở nơi khác trong trình tự.
Theo một số phương án, hai hoặc nhiều trình tự được cho là “bảo toàn hoàn toàn” nếu chúng giống nhau 100%. Theo một số phương án, hai hoặc nhiều trình tự được cho là “được bảo toàn cao” nếu chúng giống ít nhất 70%, giống ít nhất 80%, giống ít nhất 90%, hoặc giống nhau ít nhất 95%. Theo một số phương án, hai hoặc nhiều trình tự được cho là “được bảo toàn cao” nếu chúng giống khoảng 70%, giống khoảng 80%, giống khoảng 90%, giống nhau khoảng 95%, khoảng 98%, hoặc giống nhau khoảng 99%. . Theo một số phương án, hai hoặc nhiều trình tự được cho là “bảo toàn” nếu chúng giống ít nhất 30%, giống ít nhất 40%, giống ít nhất 50%, giống ít nhất 60%, giống ít nhất 70%, ít nhất Giống nhau 80%, giống nhau ít nhất 90% hoặc giống nhau ít nhất 95%. Theo một số phương án, hai hoặc nhiều trình tự được cho là “bảo toàn” nếu chúng giống khoảng 30%, giống khoảng 40%, giống khoảng 50%, giống khoảng 60%, giống khoảng 70%, giống khoảng 80%, giống khoảng 90 % giống nhau, giống khoảng 95%, giống khoảng 98% hoặc giống nhau khoảng 99%. Việc bảo toàn trình tự có thể áp dụng cho toàn bộ chiều dài của oligonucleotit hoặc polypeptit hoặc có thể áp dụng cho một phần, vùng hoặc đặc điểm của chúng.
Giải phóng được kiểm soát: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “giải phóng được kiểm soát” dùng để chỉ dược phẩm hoặc profin giải phóng hợp chất phù hợp với dạng giải phóng cụ thể để tạo ra kết quả điều trị.
Tuần hoàn hoặc tuần hoàn: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “tuần hoàn” dùng để chỉ sự hiện diện của một vòng lặp liên tục. Các phân tử tuần hoàn không nhất thiết phải có dạng tròn, chỉ cần nối với nhau để tạo thành một chuỗi các tiểu đơn vị không bị gián đoạn. Các phân tử tuần hoàn như ARN hoặc mARN được thao tác di truyền theo sáng chế có thể là các đơn vị đơn lẻ hoặc các phân tử đa phân tử hoặc bao gồm một hoặc nhiều thành phần của cấu trúc bậc phức tạp hoặc bậc cao hơn.
Thuốc kìm tế bào: Như được sử dụng ở đây, “thuốc kìm tế bào” dùng để chỉ việc ức chế, làm giảm, ức chế sự phát triển, phân chia hoặc nhân lên của tế bào (ví dụ, tế bào động vật có vú (ví dụ, tế bào người)), vi khuẩn, vi rút, nấm, động vật nguyên sinh, ký sinh trùng , prion, hoặc sự kết hợp của chúng.
Gây độc tế bào: Như được sử dụng ở đây, “gây độc tế bào” dùng để chỉ việc tiêu diệt hoặc gây ra tác dụng gây tổn thương, độc hại hoặc gây chết người trên tế bào (ví dụ, tế bào động vật có vú (ví dụ, tế bào người)), vi khuẩn, vi rút, nấm, động vật nguyên sinh, ký sinh trùng, prion , hoặc sự kết hợp của chúng.
Giao hàng: Như được sử dụng ở đây, “giao hàng” dùng để chỉ hành động hoặc cách thức giao hợp chất, chất, thực thể, phân nửa, hàng hóa hoặc trọng tải.
Chất phân phối: Như được sử dụng ở đây, “chất phân phối” dùng để chỉ chất bất kỳ tạo điều kiện thuận lợi, ít nhất một phần, cho việc phân phối polynucleotit, cấu trúc sơ cấp hoặc mmRNA trong cơ thể đến các tế bào được nhắm mục tiêu.
Bị mất ổn định: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “không ổn định,” “làm mất ổn định,” hoặc “vùng làm mất ổn định” có nghĩa là vùng hoặc phân tử kém ổn định hơn dạng ban đầu, dạng hoang dại hoặc dạng tự nhiên của cùng một vùng hoặc phân tử.
Nhãn có thể phát hiện: Như được sử dụng ở đây, “nhãn có thể phát hiện” dùng để chỉ một hoặc nhiều chất đánh dấu, tín hiệu hoặc phần được gắn, kết hợp hoặc liên kết với thực thể khác mà dễ dàng được phát hiện bằng các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này bao gồm chụp X quang, huỳnh quang, phát quang hóa, enzym hoạt động, độ hấp thụ và những thứ tương tự. Các nhãn có thể phát hiện được bao gồm đồng vị phóng xạ, chất huỳnh quang, chất mang màu, enzym, thuốc nhuộm, ion kim loại, phối tử như biotin, avidin, streptavidin và haptens, chấm lượng tử, và các chất tương tự. Các nhãn có thể phát hiện được có thể được đặt ở vị trí bất kỳ trong peptit hoặc protein được mô tả ở đây. Chúng có thể nằm trong các axit amin, peptit hoặc protein hoặc nằm ở đầu N hoặc C.
Phân hủy: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “phân hủy” có nghĩa là chia nhỏ thành các phần hoặc thành phần nhỏ hơn. Khi đề cập đến polypeptide hoặc protein, quá trình tiêu hóa sẽ dẫn đến việc sản xuất peptide.
Xa: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “xa” có nghĩa là nằm cách xa trung tâm hoặc cách xa một điểm hoặc khu vực quan tâm.
Phác đồ dùng thuốc: Như được sử dụng ở đây, “phác đồ dùng thuốc” là một phác đồ sử dụng hoặc phác đồ điều trị, phòng ngừa hoặc chăm sóc giảm nhẹ do bác sĩ xác định.
Hệ số phân chia liều (DSF) -tỷ lệ của PUD của điều trị chia liều chia cho PUD của tổng liều hàng ngày hoặc liều đơn vị. Giá trị được lấy từ việc so sánh các nhóm chế độ dùng thuốc.
Đóng gói: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “đóng gói” có nghĩa là bao bọc, bao quanh hoặc bao bọc.
Tín hiệu phân tách protein được mã hóa: Như được sử dụng ở đây, “tín hiệu phân tách protein được mã hóa” dùng để chỉ trình tự nucleotit mã hóa tín hiệu phân tách protein.
Được thiết kế: Như được sử dụng ở đây, các phương án của sáng chế được "thiết kế" khi chúng được thiết kế để có đặc điểm hoặc đặc tính, dù là về cấu trúc hay hóa học, thay đổi từ điểm bắt đầu, loại hoang dã hoặc phân tử tự nhiên.
Exosome: Như được sử dụng ở đây, “exosome” là túi được tiết ra bởi tế bào động vật có vú hoặc phức hợp liên quan đến sự thoái hóa ARN.
Biểu hiện: Như được sử dụng ở đây, “sự biểu hiện” của trình tự axit nucleic được dùng để chỉ một hoặc nhiều sự kiện sau: (1) tạo ra mẫu RNA từ trình tự DNA (ví dụ, bằng cách phiên mã); (2) xử lý bản phiên mã RNA (ví dụ: bằng cách ghép nối, chỉnh sửa, hình thành nắp 5′ và/hoặc xử lý đầu 3′); (3) dịch mã RNA thành polypeptide hoặc protein; và (4) biến đổi sau dịch mã của polypeptit hoặc protein.
Đặc điểm: Như được sử dụng ở đây, “đặc điểm” dùng để chỉ đặc điểm, tính chất hoặc yếu tố đặc biệt.
Công thức: Như được sử dụng ở đây, “chế phẩm” bao gồm ít nhất polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmRNA và chất phân phối.
Mảnh: “Mảnh,” như được sử dụng ở đây, dùng để chỉ một phần. Ví dụ, các đoạn protein có thể bao gồm các polypeptit thu được bằng cách tiêu hóa protein có chiều dài đầy đủ được phân lập từ tế bào nuôi cấy.
Chức năng: Như được sử dụng ở đây, phân tử sinh học “chức năng” là phân tử sinh học ở dạng mà nó thể hiện đặc tính và/hoặc hoạt động đặc trưng cho nó.
Tính tương đồng: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “sự tương đồng” dùng để chỉ mối liên quan tổng thể giữa các phân tử polyme, ví dụ giữa các phân tử axit nucleic (ví dụ: phân tử DNA và/hoặc phân tử RNA) và/hoặc giữa các phân tử polypeptide. Theo một số phương án, các phân tử polyme được coi là “tương đồng” với nhau nếu trình tự của chúng ít nhất là 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% hoặc 99% giống hoặc tương tự. Thuật ngữ “tương đồng” nhất thiết phải đề cập đến sự so sánh giữa ít nhất hai trình tự (trình tự polynucleotide hoặc polypeptide). Theo sáng chế, hai trình tự polynucleotit được coi là tương đồng nếu các polypeptit mà chúng mã hóa ít nhất khoảng 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, hoặc thậm chí 99% trong ít nhất một đoạn. ít nhất khoảng 20 axit amin. Theo một số phương án, trình tự polynucleotit tương đồng được đặc trưng bởi khả năng mã hóa một đoạn gồm ít nhất 4-5 axit amin được xác định duy nhất. Đối với các trình tự polynucleotide có chiều dài nhỏ hơn 60 nucleotide, tính tương đồng được xác định bằng khả năng mã hóa một đoạn ít nhất 4-5 axit amin được xác định duy nhất. Theo sáng chế, hai trình tự protein được coi là tương đồng nếu các protein này giống nhau ít nhất khoảng 50%, 60%, 70%, 80% hoặc 90% đối với ít nhất một dải có ít nhất khoảng 20 axit amin.
Tính đồng nhất: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “tính đồng nhất” dùng để chỉ mối liên quan tổng thể giữa các phân tử polyme, ví dụ, giữa các phân tử oligonucleotit (ví dụ, các phân tử ADN và/hoặc các phân tử ARN) và/hoặc giữa các phân tử polypeptide. Ví dụ, việc tính toán phần trăm nhận dạng của hai trình tự polynucleotide có thể được thực hiện bằng cách sắp xếp hai trình tự này nhằm mục đích so sánh tối ưu (ví dụ, các khoảng trống có thể được đưa vào trong một hoặc cả hai trình tự axit nucleic thứ nhất và thứ hai để có được sự liên kết tối ưu và không -các trình tự giống nhau có thể được bỏ qua vì mục đích so sánh). Theo một số phương án nhất định, độ dài của trình tự được sắp thẳng hàng cho mục đích so sánh ít nhất là 30%, ít nhất 40%, ít nhất 50%, ít nhất 60%, ít nhất 70%, ít nhất 80%, ít nhất 90%, ít nhất ít nhất 95% hoặc 100% độ dài của chuỗi tham chiếu. Sau đó, các nucleotide ở vị trí nucleotide tương ứng sẽ được so sánh. Khi một vị trí trong trình tự đầu tiên bị chiếm bởi cùng một nucleotide với vị trí tương ứng trong trình tự thứ hai thì các phân tử giống hệt nhau ở vị trí đó. Sự đồng nhất phần trăm giữa hai chuỗi là hàm của số lượng vị trí giống hệt nhau được chia sẻ bởi các chuỗi, có tính đến số lượng khoảng trống và độ dài của mỗi khoảng trống, cần được đưa vào để căn chỉnh tối ưu hai chuỗi. Việc so sánh các trình tự và xác định phần trăm đồng nhất giữa hai trình tự có thể được thực hiện bằng thuật toán toán học. Ví dụ, phần trăm nhận dạng giữa hai chuỗi nucleotide có thể được xác định bằng cách sử dụng các phương pháp như các phương pháp được mô tả trong Sinh học phân tử tính toán, Lesk, A. M., ed., Nhà xuất bản Đại học Oxford, New York, 1988; Điện toán sinh học: Dự án tin học và bộ gen, Smith, D. W., ed., Nhà xuất bản học thuật, New York, 1993; Phân tích trình tự trong sinh học phân tử, von Heinje, G., Nhà xuất bản học thuật, 1987; Phân tích dữ liệu trình tự trên máy tính, Phần I, Griffin, A. M., và Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; và Primer Phân tích trình tự, Gribskov, M. và Devereux, J., biên tập, M Stockton Press, New York, 1991; mỗi nội dung đó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Ví dụ, phần trăm nhận dạng giữa hai chuỗi nucleotide có thể được xác định bằng thuật toán của Meyers và Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), thuật toán này đã được tích hợp vào chương trình ALIGN (phiên bản 2.0) bằng cách sử dụng bảng dư lượng trọng lượng PAM120 , hình phạt độ dài khoảng cách là 12 và hình phạt khoảng cách là 4. Ngoài ra, phần trăm nhận dạng giữa hai chuỗi nucleotide có thể được xác định bằng cách sử dụng chương trình GAP trong gói phần mềm GCG bằng ma trận NWSgapdna.CMP. Các phương pháp thường được sử dụng để xác định phần trăm đồng nhất giữa các chuỗi bao gồm, nhưng không giới hạn ở những phương pháp được tiết lộ trong Carillo, H., và Lipman, D., SIAM J Ứng dụng Toán học., 48:1073 (1988); được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Các kỹ thuật xác định danh tính được mã hóa trong các chương trình máy tính có sẵn công khai. Phần mềm máy tính mẫu để xác định sự tương đồng giữa hai trình tự bao gồm, nhưng không giới hạn ở, gói chương trình GCG, Devereux, J., và cộng sự,Nghiên cứu axit nucleic,12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, và FASTA Altschul, S. F. và cộng sự,J. Phân tử. Biol.,215, 403 (1990)).
Ức chế sự biểu hiện của gen: Như được sử dụng ở đây, cụm từ “ức chế sự biểu hiện của gen” có nghĩa là làm giảm lượng sản phẩm biểu hiện của gen. Sản phẩm biểu hiện có thể là ARN được phiên mã từ gen (ví dụ, mARN) hoặc polypeptide được dịch từ mARN được phiên mã từ gen. Thông thường, việc giảm mức mARN dẫn đến giảm mức polypeptide được dịch mã từ đó. Mức độ biểu hiện có thể được xác định bằng cách sử dụng các kỹ thuật tiêu chuẩn để đo lường mRNA hoặc protein.
Trong ống nghiệm: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “trong ống nghiệm” dùng để chỉ các sự kiện xảy ra trong môi trường nhân tạo, ví dụ, trong ống nghiệm hoặc bình phản ứng, trong nuôi cấy tế bào, trong đĩa Petri, v.v., chứ không phải bên trong sinh vật (ví dụ: động vật, thực vật hoặc vi khuẩn).
In vivo: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “in vivo” dùng để chỉ các sự kiện xảy ra bên trong sinh vật (ví dụ, động vật, thực vật hoặc vi khuẩn hoặc tế bào hoặc mô của chúng).
Bị cô lập: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “cô lập” dùng để chỉ một chất hoặc thực thể đã được tách ra khỏi ít nhất một số thành phần mà nó được liên kết (dù ở dạng tự nhiên hay trong môi trường thử nghiệm). Các chất bị cô lập có thể có mức độ tinh khiết khác nhau tùy theo chất mà chúng được liên kết. Các chất và/hoặc thực thể biệt lập có thể được tách ra khỏi ít nhất khoảng 10%, khoảng 20%, khoảng 30%, khoảng 40%, khoảng 50%, khoảng 60%, khoảng 70%, khoảng 80%, khoảng 90% hoặc hơn của các thành phần khác mà chúng được liên kết ban đầu. Theo một số phương án, chất được phân lập chiếm hơn khoảng 80%, khoảng 85%, khoảng 90%, khoảng 91%, khoảng 92%, khoảng 93%, khoảng 94%, khoảng 95%, khoảng 96%, khoảng 97%, khoảng 98%, khoảng 99% hoặc nguyên chất hơn khoảng 99%. Như được sử dụng ở đây, chất được coi là “tinh khiết” nếu nó gần như không có các thành phần khác. Cách ly đáng kể: “Cách ly đáng kể” có nghĩa là hợp chất được tách biệt đáng kể khỏi môi trường mà nó được hình thành hoặc phát hiện. Việc tách một phần có thể bao gồm, ví dụ, chế phẩm được làm giàu bằng hợp chất theo sáng chế. Sự phân tách đáng kể có thể bao gồm các chế phẩm chứa ít nhất khoảng 50%, ít nhất khoảng 60%, ít nhất khoảng 70%, ít nhất khoảng 80%, ít nhất khoảng 90%, ít nhất khoảng 95%, ít nhất khoảng 97%, hoặc ít nhất ít nhất khoảng 99% trọng lượng của hợp chất theo sáng chế, hoặc muối của nó. Các phương pháp tách các hợp chất và muối của chúng là thông dụng trong lĩnh vực kỹ thuật này.
Trình liên kết: Như được sử dụng ở đây, trình tự liên kết dùng để chỉ một nhóm nguyên tử, ví dụ, 10-1.000 nguyên tử, và có thể bao gồm các nguyên tử hoặc nhóm như, nhưng không giới hạn ở, cacbon, amino, alkylamino, oxy, lưu huỳnh, sulfoxit , sulfonyl, cacbonyl và imin. Trình liên kết có thể được gắn vào nucleoside hoặc nucleoside biến đổi trên gốc nucleobase hoặc gốc đường ở đầu thứ nhất, và vào trọng tải, ví dụ, tác nhân điều trị hoặc có thể phát hiện được, ở đầu thứ hai. Trình tự liên kết có thể có độ dài đủ để không cản trở việc đưa vào trình tự axit nucleic. Trình liên kết có thể được sử dụng cho mục đích hữu ích bất kỳ, chẳng hạn như để tạo thành các phân tử đa phân tử mmRNA (ví dụ, thông qua liên kết của hai hoặc nhiều polynucleotit, cấu trúc bậc một, hoặc phân tử mmRNA) hoặc liên hợp mmRNA, cũng như để quản lý tải trọng, như được mô tả ở đây. Ví dụ về các nhóm hóa học có thể được kết hợp vào trình tự liên kết bao gồm, nhưng không giới hạn ở, alkyl, alkenyl, alkynyl, amido, amino, ete, thioether, este, alkylene, Heteroalkylene, aryl, hoặc Heterocyclyl, mỗi nhóm trong số đó có thể là tùy ý được thay thế, như được mô tả ở đây. Ví dụ về các chất liên kết bao gồm, nhưng không giới hạn ở, ankan không bão hòa, polyetylen glycol (ví dụ, các đơn vị monome ethylene hoặc propylen glycol, ví dụ, diethylene glycol, dipropylene glycol, triethylene glycol, tripropylene glycol, tetraethylene glycol, hoặc tetraethylene glycol) và dextran polyme và dẫn xuất của chúng, Các ví dụ khác bao gồm, nhưng không giới hạn ở, các gốc có thể phân tách trong trình tự liên kết, chẳng hạn như, ví dụ, liên kết disulfua (—S—S—) hoặc liên kết azo (—N═N—), mà có thể được phân cắt bằng cách sử dụng chất khử hoặc quang phân. Các ví dụ không giới hạn về liên kết có thể phân tách có chọn lọc bao gồm liên kết amido có thể được phân tách, ví dụ bằng cách sử dụng tris(2-carboxyetyl)phosphine (TCEP), hoặc các chất khử khác, và/hoặc quá trình quang phân, cũng như liên kết este có thể có thể bị phân cắt bằng cách thủy phân axit hoặc bazơ.
Vị trí liên kết microRNA (miRNA): Như được sử dụng ở đây, vị trí liên kết microRNA (miRNA) thể hiện vị trí hoặc vùng nucleotit của bản phiên mã axit nucleic mà ít nhất vùng “hạt giống” của miRNA liên kết với nó.
Được sửa đổi: Như được sử dụng ở đây, “được sửa đổi” dùng để chỉ trạng thái hoặc cấu trúc đã thay đổi của phân tử theo sáng chế. Các phân tử có thể được biến đổi theo nhiều cách bao gồm về mặt hóa học, cấu trúc và chức năng. Theo một phương án, các phân tử mARN theo sáng chế được biến đổi bằng cách đưa nucleoside và/hoặc nucleoside không có nguồn gốc tự nhiên vào, ví dụ, vì nó liên quan đến ribonucleotit tự nhiên A, U, G, và C. Nucleotide phi núi như nắp Các cấu trúc không được coi là “đã được sửa đổi” mặc dù chúng khác với cấu trúc hóa học của các ribonucleotide A, C, G, U.
Chất nhầy: Như được sử dụng ở đây, “chất nhầy” dùng để chỉ chất tự nhiên có tính nhớt và bao gồm glycoprotein chất nhầy.
Xuất hiện tự nhiên: Như được sử dụng ở đây, “xuất hiện tự nhiên” có nghĩa là tồn tại trong tự nhiên mà không cần sự trợ giúp nhân tạo.
Động vật có xương sống không phải người: Như được sử dụng ở đây, “động vật có xương sống không phải người” bao gồm tất cả các động vật có xương sống ngoại trừMột người đàn ông khôn ngoan, bao gồm cả các loài hoang dã và thuần hóa. Ví dụ về động vật có xương sống không phải con người bao gồm, nhưng không giới hạn ở động vật có vú, chẳng hạn như alpaca, bò rừng, bò rừng, lạc đà, mèo, gia súc, hươu, chó, lừa, gayal, dê, chuột lang, ngựa, lạc đà không bướu, con la, lợn , thỏ, tuần lộc, trâu nước cừu và yak.
Ngoài mục tiêu: Như được sử dụng ở đây, “ngoài mục tiêu” dùng để chỉ tác động ngoài ý muốn bất kỳ lên một hoặc nhiều mục tiêu, gen hoặc bản phiên mã tế bào bất kỳ.
Khung đọc mở: Như được sử dụng ở đây, “khung đọc mở” hoặc “ORF” dùng để chỉ trình tự không chứa codon dừng trong khung đọc nhất định.
Được liên kết theo chức năng: Như được sử dụng ở đây, cụm từ “được liên kết theo chức năng” dùng để chỉ sự kết nối chức năng giữa hai hoặc nhiều phân tử, cấu trúc, bản phiên mã, thực thể, gốc hoặc tương tự.
Được thế tùy ý: Trong đây cụm từ có dạng “X được thế tùy ý” (ví dụ, alkyl được thế tùy ý) được hiểu là tương đương với “X, trong đó X được thế tùy ý” (ví dụ, “alkyl, trong đó alkyl này được thế tùy ý”) . Điều này không có nghĩa là đặc điểm “X” (ví dụ alkyl) bản chất là tùy chọn.
Peptit: Như được sử dụng ở đây, “peptit” có chiều dài nhỏ hơn hoặc bằng 50 axit amin, ví dụ, dài khoảng 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, hoặc 50 axit amin.
Paratope: Như được sử dụng ở đây, “paratope” được dùng để chỉ vị trí liên kết kháng nguyên của kháng thể.
Bệnh nhân: Như được sử dụng ở đây, “bệnh nhân” dùng để chỉ đối tượng có thể tìm kiếm hoặc có nhu cầu điều trị, yêu cầu điều trị, đang được điều trị, sẽ được điều trị hoặc đối tượng được chăm sóc bởi một chuyên gia được đào tạo về một căn bệnh cụ thể hoặc tình trạng.
Được chấp nhận về mặt dược phẩm: Cụm từ “dược dụng” được sử dụng ở đây để chỉ các hợp chất, nguyên liệu, chế phẩm và/hoặc dạng liều mà nằm trong phạm vi đánh giá y tế hợp lý, thích hợp để sử dụng khi tiếp xúc với các mô của con người và động vật không có độc tính quá mức, kích ứng, phản ứng dị ứng hoặc các vấn đề hoặc biến chứng khác, tương xứng với tỷ lệ lợi ích/rủi ro hợp lý.
Tá dược dược dụng: Cụm từ “tá dược dược dụng,” như được sử dụng ở đây, dùng để chỉ thành phần bất kỳ ngoài các hợp chất được mô tả ở đây (ví dụ, tá dược có khả năng tạo huyền phù hoặc hòa tan hợp chất hoạt tính) và có các đặc tính về cơ bản là không độc hại và không -viêm ở bệnh nhân. Tá dược có thể bao gồm, ví dụ: chất chống dính, chất chống oxy hóa, chất kết dính, chất phủ, chất hỗ trợ nén, chất phân rã, thuốc nhuộm (màu sắc), chất làm mềm, chất nhũ hóa, chất độn (chất pha loãng), chất tạo màng hoặc lớp phủ, hương liệu, hương liệu, chất làm trơn (chất tăng cường dòng chảy), chất bôi trơn. , chất bảo quản, mực in, chất hấp thụ, chất tạo huyền phù hoặc phân tán, chất làm ngọt và nước hydrat hóa. Tá dược được lấy làm ví dụ bao gồm, nhưng không giới hạn ở: hydroxytoluen đã butylat hóa (BHT), canxi cacbonat, canxi phosphat (dibasic), canxi stearat, croscarmellose, polyvinyl pyrrolidon liên kết ngang, axit xitric, crospovidon, cystein, ethylcellulose, gelatin, hydroxypropyl xenluloza, hydroxypropyl metyl xenluloza , lactose, magie stearat, maltitol, mannitol, methionine, methylcellulose, methyl paraben, cellulose vi tinh thể, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, povidone, tinh bột tiền gelatin hóa, propyl paraben, retinyl palmitate, shellac, silicon dioxide, natri carboxymethyl cellulose, natri citrat, natri tinh bột glycolate, sorbitol, tinh bột (ngô), axit stearic, sucrose, talc, titan dioxide, vitamin A, vitamin E, vitamin C và xylitol.
Muối dược dụng: Sáng chế cũng bao gồm muối dược dụng của hợp chất được mô tả ở đây. Như được sử dụng ở đây, “muối dược dụng” dùng để chỉ dẫn xuất của hợp chất được bộc lộ trong đó hợp chất gốc được biến đổi bằng cách chuyển nửa axit hoặc bazơ hiện có thành dạng muối của nó (ví dụ, bằng cách cho nhóm bazơ tự do phản ứng với axit hữu cơ thích hợp). Ví dụ về muối dược dụng bao gồm, nhưng không giới hạn, muối khoáng hoặc axit hữu cơ của các dư lượng bazơ như amin; muối kiềm hoặc hữu cơ của dư lượng axit như axit cacboxylic; và những thứ tương tự. Các muối bổ sung axit đại diện bao gồm axetat, adipate, alginate, ascorbate, aspartate, benzensulfonate, benzoate, bisulfate, borat, butyrate, camphorate, camphorsulfonate, citrate, cyclopentanepropionate, digluconate, dodecylsulfate, ethanesulfonate, fumarate, glucoheptonate, glycerophosphate, hemisulfate, heptonate, hexanoate , hydrobromua, hydroclorua, hydroiođua, 2-hydroxy-ethanesulfonat, lactobionate, lactat, laurat, lauryl sunfat, malat, maleat, malonat, metansulfonat, 2-naphthalenesulfonat, nicotin, nitrat, oleat, oxalat, palmitat, pamoat, pectinate, persulfate, 3-phenylpropionat, photphat, picrat, pivalat, propionat, stearat, succinate, sunfat, tartrat, thiocyanate, toluenesulfonat, undecanoat, muối valat, và các muối tương tự. Các muối kim loại kiềm hoặc kiềm thổ đại diện bao gồm natri, liti, kali, canxi, magie và các chất tương tự, cũng như các cation amoni, amoni bậc bốn và amin không độc hại, bao gồm nhưng không giới hạn ở amoni, tetramethylammonium, tetraethylammonium, methylamine, dimethylamine , trimethylamine, triethylamine, ethylamine, và các loại tương tự. Muối dược dụng theo sáng chế bao gồm muối không độc thông thường của hợp chất gốc được tạo thành, ví dụ, từ axit vô cơ hoặc hữu cơ không độc. Muối dược dụng theo sáng chế có thể được tổng hợp từ hợp chất gốc chứa gốc bazơ hoặc axit bằng phương pháp hóa học thông thường. Nói chung, các muối như vậy có thể được điều chế bằng cách cho dạng axit hoặc bazơ tự do của các hợp chất này phản ứng với lượng cân bằng hóa học của bazơ hoặc axit thích hợp trong nước hoặc trong dung môi hữu cơ, hoặc trong hỗn hợp của cả hai; nói chung, các môi trường không chứa nước như ete, etyl axetat, etanol, isopropanol hoặc axetonitril được ưu tiên sử dụng. Danh sách các muối thích hợp được tìm thấy trongKhoa học Dược phẩm của Remington,17quần quèed., Công ty xuất bản Mack, Easton, Pa., 1985, tr. 1418, Muối dược phẩm: Tính chất, lựa chọn và sử dụng, P. H. Stahl và C. G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, và Berge et al.,Tạp chí khoa học dược phẩm,66, 1-19 (1977), mỗi nội dung được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Solvat dược dụng: Thuật ngữ “solvat dược dụng,” như được sử dụng ở đây, có nghĩa là hợp chất theo sáng chế trong đó các phân tử của dung môi thích hợp được đưa vào mạng tinh thể. Dung môi thích hợp có thể dung nạp được về mặt sinh lý ở liều dùng. Ví dụ, solvat có thể được điều chế bằng cách kết tinh, kết tinh lại, hoặc kết tủa từ dung dịch bao gồm dung môi hữu cơ, nước, hoặc hỗn hợp của chúng. Ví dụ về các dung môi thích hợp là etanol, nước (ví dụ, mono-, di- và tri-hydrat), N-methylpyrrolidinone (NMP), dimethyl sulfoxide (DMSO), N,N′-dimethylformamide (DMF), N,N ′-dimethylacetamide (DMAC), 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMEU), 1,3-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-(1H)-pyrimidinone (DMPU), acetonitril (ACN ), propylen glycol, etyl axetat, rượu benzyl, 2-pyrolidon, benzyl benzoat, và các chất tương tự. Khi nước là dung môi, chất hòa tan được gọi là “hydrat”.
Dược động học: Như được sử dụng ở đây, “dược động học” dùng để chỉ một hoặc nhiều đặc tính bất kỳ của phân tử hoặc hợp chất vì nó liên quan đến việc xác định số phận của các chất được sử dụng cho cơ thể sống. Dược động học được chia thành nhiều lĩnh vực bao gồm mức độ và tốc độ hấp thu, phân bố, chuyển hóa và bài tiết. Điều này thường được gọi là ADME trong đó: (A) Hấp thụ là quá trình một chất đi vào tuần hoàn máu; (D) Phân phối là sự phân tán hoặc phát tán các chất trong dịch và mô của cơ thể; (M) Trao đổi chất (hoặc Biến đổi sinh học) là sự biến đổi không thể đảo ngược của các hợp chất gốc thành chất chuyển hóa con; và (E) Bài tiết (hoặc Loại bỏ) đề cập đến việc loại bỏ các chất ra khỏi cơ thể. Trong một số ít trường hợp, một số loại thuốc sẽ tích tụ không thể phục hồi trong mô cơ thể.
Hóa lý: Như được sử dụng ở đây, “hóa lý” có nghĩa là hoặc liên quan đến một đặc tính vật lý và/hoặc hóa học.
Polypeptide trên mỗi đơn vị thuốc (PUD): Như được sử dụng ở đây, PUD hoặc sản phẩm trên mỗi đơn vị thuốc, được định nghĩa là phần chia nhỏ của tổng liều hàng ngày, thường là 1 mg, pg, kg, v.v., của một sản phẩm (chẳng hạn như polypeptide ) được đo trong dịch cơ thể hoặc mô, thường được xác định bằng nồng độ như pmol/mL, mmol/mL, v.v. chia cho số đo trong dịch cơ thể.
Phòng ngừa: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “phòng ngừa” dùng để chỉ việc trì hoãn một phần hoặc toàn bộ sự khởi phát của nhiễm trùng, bệnh tật, rối loạn và/hoặc tình trạng; trì hoãn một phần hoặc toàn bộ sự khởi phát của một hoặc nhiều triệu chứng, đặc điểm hoặc biểu hiện lâm sàng của một bệnh nhiễm trùng, bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng cụ thể; trì hoãn một phần hoặc toàn bộ sự khởi phát của một hoặc nhiều triệu chứng, đặc điểm hoặc biểu hiện của một bệnh nhiễm trùng, bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng cụ thể; trì hoãn một phần hoặc hoàn toàn sự tiến triển của nhiễm trùng, một bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng cụ thể; và/hoặc giảm nguy cơ phát triển bệnh lý liên quan đến nhiễm trùng, bệnh tật, rối loạn và/hoặc tình trạng.
Tiền dược chất: Sáng chế cũng bao gồm tiền dược chất của hợp chất được mô tả ở đây. Như được sử dụng ở đây, “tiền dược chất” dùng để chỉ chất, phân tử hoặc thực thể bất kỳ ở dạng làm vị ngữ cho chất, phân tử hoặc thực thể đó hoạt động như một liệu pháp điều trị dựa trên sự biến đổi hóa học hoặc vật lý. Các tiền thuốc có thể được liên kết cộng hóa trị hoặc cô lập theo một cách nào đó và giải phóng hoặc được chuyển hóa thành nhóm thuốc có hoạt tính trước, trong hoặc sau khi được sử dụng cho đối tượng động vật có vú. Các tiền dược chất có thể được điều chế bằng cách biến đổi các nhóm chức có trong hợp chất theo cách mà các biến đổi này được tách ra, trong thao tác thông thường hoặc trong cơ thể, đối với các hợp chất gốc. Tiền dược chất bao gồm các hợp chất trong đó các nhóm hydroxyl, amino, sulfhydryl hoặc carboxyl được liên kết với nhóm bất kỳ mà khi được sử dụng cho đối tượng động vật có vú, sẽ tách ra để tạo thành nhóm hydroxyl, amino, sulfhydryl hoặc carboxyl tự do tương ứng. Việc chuẩn bị và sử dụng tiền thuốc được thảo luận trong T. Higuchi và V. Stella, “Pro-thuốc là hệ thống phân phối mới,” Tập. 14 của A.C.S. Chuỗi hội nghị chuyên đề, và trong Chất mang sinh học có thể đảo ngược trong thiết kế thuốc, ed. Edward B. Roche, Hiệp hội Dược phẩm Hoa Kỳ và Nhà xuất bản Pergamon, 1987, cả hai tài liệu này đều được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn.
Tăng sinh: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “tăng sinh” có nghĩa là tăng trưởng, mở rộng hoặc tăng lên hoặc gây ra tăng trưởng, mở rộng hoặc tăng lên nhanh chóng. “Tăng sinh” có nghĩa là có khả năng sinh sôi nảy nở. “Chống tăng sinh” có nghĩa là có các đặc tính đối lập hoặc không phù hợp với các đặc tính tăng sinh.
Vị trí phân cắt protein: Như được sử dụng ở đây, “vị trí phân cắt protein” được dùng để chỉ vị trí mà tại đó chuỗi axit amin có thể được thực hiện phân cắt bằng phương pháp hóa học, enzym hoặc quang hóa.
Tín hiệu phân cắt protein: Như được sử dụng ở đây “tín hiệu phân cắt protein” được dùng để chỉ ít nhất một axit amin đánh dấu hoặc đánh dấu polypeptit để phân cắt.
Protein quan tâm: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “protein quan tâm” hoặc “protein mong muốn” bao gồm các protein được đề xuất ở đây và các đoạn, đột biến, biến thể, và biến đổi của chúng.
Gần: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “gần” có nghĩa là nằm gần trung tâm hơn hoặc đến một điểm hoặc vùng quan tâm hơn.
Pseudouridine: Như được sử dụng ở đây, pseudouridine được dùng để chỉ đồng phân C-glycoside của nucleoside uridine. “Chất tương tự pseudouridine” là dạng biến đổi, biến thể, dạng đồng phân hoặc dẫn xuất bất kỳ của pseudouridine. Ví dụ, chất tương tự pseudouridine bao gồm nhưng không giới hạn ở 1-carboxymethyl-pseudouridine, 1-propynyl-pseudouridine, 1-taurinomethyl-pseudouridine, 1-taurinomethyl-4-thio-pseudouridine, 1-methylpseudouridine (m1ψ), 1-metyl-4-thio-pseudouridin (m1S4ψ), 4-thio-1-metyl-pseudouridin, 3-metyl-pseudouridin (m3′), 2-thio-1-metyl-pseudouridine, 1-metyl-1-deaza-pseudouridine, 2-thio-1-metyl-1-deaza-pseudouridine, dihydropseudouridine, 2-thio-dihydropseudouridine, 2-metoxyuridine, 2 -metoxy-4-thio-uridine, 4-metoxy-pseudouridine, 4-metoxy-2-thio-pseudouridin, N1-metyl-pseudouridin, 1-metyl-3-(3-amino-3-carboxypropyl)pseudouridin (acp3ψ) và 2′-O-metyl-pseudouridine (wm).
Đã tinh chế: Như được sử dụng ở đây, “tinh chế”, “đã tinh chế”, “tinh chế” có nghĩa là làm cho về cơ bản tinh khiết hoặc trong sạch khỏi các thành phần không mong muốn, tạp chất vật liệu, tạp chất hoặc sự không hoàn hảo.
Mẫu: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “mẫu” hoặc “mẫu sinh học” dùng để chỉ một tập hợp con các mô, tế bào hoặc các bộ phận cấu thành của nó (ví dụ: dịch cơ thể, bao gồm nhưng không giới hạn ở máu, chất nhầy, dịch bạch huyết, dịch khớp, dịch não tủy nước bọt, nước ối, máu dây ối, nước tiểu, dịch âm đạo và tinh dịch). Ngoài ra, mẫu có thể bao gồm dịch đồng nhất, dịch ly giải hoặc dịch chiết được điều chế từ toàn bộ sinh vật hoặc một tập hợp con các mô, tế bào hoặc các bộ phận cấu thành của nó, hoặc một phần hoặc một phần của chúng, bao gồm nhưng không giới hạn ở, ví dụ, huyết tương, huyết thanh, dịch tủy sống , dịch bạch huyết, các phần bên ngoài của da, đường hô hấp, ruột và đường sinh dục, nước mắt, nước bọt, sữa, tế bào máu, khối u, các cơ quan. Mẫu còn đề cập đến môi trường, chẳng hạn như môi trường nuôi dưỡng hoặc gel dinh dưỡng, có thể chứa các thành phần tế bào, chẳng hạn như protein hoặc phân tử axit nucleic.
Trình tự tín hiệu: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “trình tự tín hiệu” được dùng để chỉ trình tự có thể chỉ đạo việc vận chuyển hoặc định vị protein.
Liều đơn vị: Như được sử dụng ở đây, “liều đơn vị” là liều của thuốc điều trị bất kỳ được sử dụng theo một liều/tại một thời điểm/đường đơn/điểm tiếp xúc duy nhất, tức là, trường hợp sử dụng một lần.
Tính tương tự: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “sự tương tự” dùng để chỉ mối liên quan tổng thể giữa các phân tử polyme, ví dụ giữa các phân tử polynucleotide (ví dụ: phân tử DNA và/hoặc phân tử RNA) và/hoặc giữa các phân tử polypeptide. Việc tính phần trăm độ tương tự của các phân tử polyme với nhau có thể được thực hiện theo cách tương tự như cách tính phần trăm đồng nhất, ngoại trừ việc tính phần trăm độ tương tự có tính đến các thay thế bảo toàn như được hiểu trong lĩnh vực kỹ thuật này.
Chia liều: Như được sử dụng ở đây, “liều chia” là việc chia liều đơn vị hoặc tổng liều hàng ngày thành hai liều trở lên.
Ổn định: Như được sử dụng ở đây, “ổn định” dùng để chỉ hợp chất đủ mạnh để tồn tại sau khi phân lập đến mức độ tinh khiết hữu ích từ hỗn hợp phản ứng, và tốt hơn là có khả năng bào chế thành tác nhân điều trị hiệu quả.
Đã ổn định: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “ổn định”, “ổn định”, “vùng ổn định” có nghĩa là tạo ra hoặc trở nên ổn định.
Đối tượng: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “đối tượng” hoặc “bệnh nhân” dùng để chỉ sinh vật bất kỳ mà chế phẩm theo sáng chế có thể được sử dụng, ví dụ, cho mục đích thí nghiệm, chẩn đoán, phòng bệnh và/hoặc điều trị. Các đối tượng điển hình bao gồm động vật (ví dụ: động vật có vú như chuột nhắt, chuột cống, thỏ, động vật linh trưởng không phải người và con người) và/hoặc thực vật.
Đáng kể: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “đáng kể” đề cập đến tình trạng định tính thể hiện mức độ hoặc mức độ toàn bộ hoặc gần như toàn bộ của một đặc điểm hoặc tính chất được quan tâm. Một trong những kỹ năng thông thường trong nghệ thuật sinh học sẽ hiểu rằng các hiện tượng sinh học và hóa học hiếm khi đi đến mức hoàn thiện và/hoặc tiến tới sự hoàn thiện hoặc đạt được hoặc tránh được một kết quả tuyệt đối. Do đó, thuật ngữ “về cơ bản” được sử dụng ở đây để thể hiện sự thiếu hoàn thiện tiềm ẩn vốn có trong nhiều hiện tượng sinh học và hóa học.
Gần như bằng nhau: Như được sử dụng ở đây vì nó liên quan đến sự khác biệt về thời gian giữa các liều, thuật ngữ này có nghĩa là cộng/trừ 2%.
Gần như đồng thời: Như được sử dụng ở đây và vì nó liên quan đến nhiều liều, thuật ngữ này có nghĩa là trong vòng 2 giây.
Đau khổ: Một cá nhân đang “mắc” một căn bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng đã được chẩn đoán hoặc biểu hiện một hoặc nhiều triệu chứng của một căn bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng.
Dễ mắc phải: Một cá nhân “dễ bị” mắc một căn bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng chưa được chẩn đoán và/hoặc có thể không biểu hiện các triệu chứng của bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng đó nhưng có xu hướng phát triển bệnh hoặc các triệu chứng của nó. Theo một số phương án, cá thể dễ mắc bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng (ví dụ, ung thư) có thể có đặc điểm là một hoặc nhiều đặc điểm sau: (1) đột biến gen liên quan đến sự phát triển của bệnh, rối loạn và/hoặc điều kiện; (2) tính đa hình di truyền liên quan đến sự phát triển của bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng bệnh; (3) tăng và/hoặc giảm biểu hiện và/hoặc hoạt động của protein và/hoặc axit nucleic liên quan đến bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng bệnh; (4) thói quen và/hoặc lối sống liên quan đến sự phát triển của bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng bệnh; (5) tiền sử gia đình mắc bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng bệnh; và (6) tiếp xúc và/hoặc nhiễm vi khuẩn liên quan đến sự phát triển của bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng. Theo một số phương án, cá thể dễ mắc bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng sẽ phát triển bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng đó. Theo một số phương án, cá thể dễ mắc bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng sẽ không phát triển bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng đó.
Giải phóng được duy trì: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “giải phóng được duy trì” dùng để chỉ dược phẩm hoặc profin giải phóng hợp chất phù hợp với tốc độ giải phóng trong một khoảng thời gian cụ thể.
Tổng hợp: Thuật ngữ “tổng hợp” có nghĩa là được sản xuất, chuẩn bị và/hoặc sản xuất bởi bàn tay con người. Sự tổng hợp các polynucleotit hoặc polypeptide hoặc các phân tử khác theo sáng chế có thể bằng phương pháp hóa học hoặc enzym.
Ô được nhắm mục tiêu: Như được sử dụng ở đây, “ô được nhắm mục tiêu” dùng để chỉ một hoặc nhiều ô bất kỳ được quan tâm. Các tế bào có thể được tìm thấy in vitro, in vivo, in situ hoặc trong mô hoặc cơ quan của sinh vật. Sinh vật có thể là động vật, tốt hơn là động vật có vú, tốt hơn nữa là con người và tốt nhất là bệnh nhân.
Tác nhân trị liệu: Thuật ngữ “tác nhân trị liệu” dùng để chỉ tác nhân bất kỳ mà khi được sử dụng cho đối tượng, có tác dụng điều trị, chẩn đoán và/hoặc phòng bệnh và/hoặc tạo ra tác dụng sinh học và/hoặc dược lý mong muốn.
Lượng có tác dụng điều trị: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “lượng có tác dụng điều trị” có nghĩa là lượng tác nhân được phân phối (ví dụ, axit nucleic, thuốc, tác nhân điều trị, tác nhân chẩn đoán, tác nhân phòng bệnh, v.v.) đủ khi được sử dụng. cho một đối tượng đang bị hoặc dễ bị nhiễm trùng, bệnh tật, rối loạn và/hoặc tình trạng, để điều trị, cải thiện các triệu chứng, chẩn đoán, ngăn ngừa và/hoặc trì hoãn sự khởi phát của nhiễm trùng, bệnh tật, rối loạn và/hoặc tình trạng.
Kết quả có hiệu quả về mặt điều trị: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “kết quả có hiệu quả về mặt điều trị” có nghĩa là kết quả đủ ở đối tượng đang mắc hoặc dễ bị nhiễm trùng, bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng, để điều trị, cải thiện các triệu chứng, chẩn đoán, ngăn ngừa và/hoặc trì hoãn sự khởi phát của nhiễm trùng, bệnh tật, rối loạn và/hoặc tình trạng.
Tổng liều hàng ngày: Như được sử dụng ở đây, “tổng liều hàng ngày” là lượng được đưa ra hoặc kê đơn trong khoảng thời gian 24 giờ. Nó có thể được dùng dưới dạng một đơn vị liều duy nhất.
Yếu tố phiên mã: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “yếu tố phiên mã” dùng để chỉ protein liên kết DNA điều hòa quá trình phiên mã DNA thành RNA, ví dụ, bằng cách kích hoạt hoặc ức chế phiên mã. Một số yếu tố phiên mã chỉ có tác dụng điều hòa quá trình phiên mã, trong khi những yếu tố khác hoạt động phối hợp với các protein khác. Một số yếu tố phiên mã có thể vừa kích hoạt vừa ức chế phiên mã trong những điều kiện nhất định. Nói chung, các yếu tố phiên mã liên kết trình tự mục tiêu cụ thể hoặc các trình tự rất giống với trình tự liên ứng cụ thể trong vùng điều hòa của gen mục tiêu. Các yếu tố phiên mã có thể điều hòa quá trình phiên mã của một mình gen mục tiêu hoặc trong một phức hợp với các phân tử khác.
Điều trị: Như được sử dụng ở đây, thuật ngữ “điều trị” dùng để chỉ việc làm giảm nhẹ một phần hoặc hoàn toàn, cải thiện, cải thiện, làm dịu, làm chậm sự khởi phát, ức chế sự tiến triển, giảm mức độ nghiêm trọng và/hoặc giảm tỷ lệ mắc một hoặc nhiều triệu chứng hoặc đặc điểm của bệnh. nhiễm trùng, bệnh tật, rối loạn và/hoặc tình trạng cụ thể. Ví dụ, “điều trị” ung thư có thể ám chỉ việc ức chế sự sống sót, phát triển và/hoặc sự lan rộng của khối u. Việc điều trị có thể được thực hiện cho đối tượng không có dấu hiệu của bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng và/hoặc đối tượng chỉ biểu hiện các dấu hiệu ban đầu của bệnh, rối loạn và/hoặc tình trạng nhằm mục đích giảm rủi ro phát triển bệnh lý liên quan đến bệnh tật, rối loạn và/hoặc tình trạng.
Chưa sửa đổi: Như được sử dụng ở đây, “chưa sửa đổi” dùng để chỉ chất, hợp chất hoặc phân tử bất kỳ trước khi được thay đổi theo bất kỳ cách nào. Chưa sửa đổi có thể, nhưng không phải lúc nào cũng đề cập đến dạng hoang dã hoặc dạng tự nhiên của phân tử sinh học. Các phân tử có thể trải qua một loạt các biến đổi trong đó mỗi phân tử được biến đổi có thể đóng vai trò là phân tử ban đầu “không được biến đổi” cho lần biến đổi tiếp theo.
Tương đương và phạm vi
Những người có hiểu biết về lĩnh vực kỹ thuật này sẽ nhận ra hoặc có thể xác định chắc chắn bằng cách sử dụng không quá thử nghiệm thông thường, nhiều điểm tương đương với các phương án cụ thể theo sáng chế được mô tả ở đây. Phạm vi của sáng chế không nhằm mục đích giới hạn ở phần Mô tả ở trên mà đúng hơn là được nêu trong các yêu cầu bảo hộ kèm theo.
Trong các yêu cầu bảo hộ, các mạo từ như “a”, “an” và “the” có thể có nghĩa là một hoặc nhiều hơn một trừ khi được chỉ ra ngược lại hoặc có bằng chứng rõ ràng khác từ ngữ cảnh. Các tuyên bố hoặc mô tả bao gồm “hoặc” giữa một hoặc nhiều thành viên của một nhóm được coi là thỏa mãn nếu một, nhiều hơn một hoặc tất cả các thành viên trong nhóm có mặt, làm việc hoặc liên quan đến một sản phẩm hoặc quy trình nhất định trừ khi được chỉ định ngược lại hoặc rõ ràng từ ngữ cảnh. Sáng chế bao gồm các phương án trong đó chính xác một thành viên của nhóm có mặt, được tuyển dụng trong hoặc có liên quan đến một sản phẩm hoặc quy trình nhất định. Sáng chế bao gồm các phương án trong đó nhiều hơn một hoặc tất cả các thành viên trong nhóm có mặt, được sử dụng trong hoặc có liên quan đến một sản phẩm hoặc quy trình nhất định.
Cũng cần lưu ý rằng thuật ngữ “bao gồm” nhằm mục đích mở và cho phép nhưng không yêu cầu bao gồm các yếu tố hoặc bước bổ sung. Khi thuật ngữ “bao gồm” được sử dụng ở đây, thì thuật ngữ “bao gồm” do đó cũng được bao gồm và bộc lộ.
Khi phạm vi được đưa ra, điểm cuối cũng được bao gồm. Hơn nữa, phải hiểu rằng trừ khi có chỉ dẫn khác hoặc bằng cách khác rõ ràng từ ngữ cảnh và sự hiểu biết của một người có hiểu biết thông thường về lĩnh vực kỹ thuật này, các giá trị được biểu thị dưới dạng các khoảng có thể mang bất kỳ giá trị cụ thể hoặc khoảng con nào trong các khoảng đã nêu theo các phương án khác nhau của sáng chế, đến phần mười đơn vị của giới hạn dưới của phạm vi, trừ khi ngữ cảnh có quy định khác.
Ngoài ra, cần phải hiểu rằng bất kỳ phương án cụ thể nào của sáng chế thuộc tình trạng kỹ thuật trước đó đều có thể bị loại trừ một cách rõ ràng khỏi bất kỳ một hoặc nhiều yêu cầu bảo hộ nào. Vì các phương án như vậy được cho là đã được biết đến bởi người có trình độ trung bình trong lĩnh vực kỹ thuật này nên chúng có thể bị loại trừ ngay cả khi việc loại trừ đó không được nêu rõ ràng ở đây. Bất kỳ phương án cụ thể nào của chế phẩm theo sáng chế (ví dụ, bất kỳ axit nucleic hoặc protein nào được mã hóa theo đó; bất kỳ phương pháp sản xuất nào; bất kỳ phương pháp sử dụng nào, v.v.) đều có thể bị loại trừ khỏi một hoặc nhiều yêu cầu bảo hộ bất kỳ, vì bất kỳ lý do nào, dù có hay không. liên quan đến sự tồn tại của tình trạng kỹ thuật đã có.
Tất cả các nguồn được trích dẫn, ví dụ: tài liệu tham khảo, ấn phẩm, cơ sở dữ liệu, mục cơ sở dữ liệu và nghệ thuật được trích dẫn ở đây, đều được đưa vào ứng dụng này bằng cách tham chiếu, ngay cả khi không được nêu rõ ràng trong trích dẫn. Trong trường hợp các tuyên bố trong ứng dụng tức thời và nguồn trích dẫn mâu thuẫn nhau thì tuyên bố trong ứng dụng tức thời sẽ chiếm ưu thế.
Tiêu đề của phần và bảng không nhằm mục đích hạn chế.
VÍ DỤ Ví dụ 1. Sản xuất mRNA biến tính
Các mARN biến đổi (mmRNA) theo sáng chế có thể được tạo ra bằng cách sử dụng các vật liệu và phương pháp tiêu chuẩn của phòng thí nghiệm. Khung đọc mở (ORF) của gen quan tâm có thể được bao quanh bởi vùng 5′ chưa được dịch mã (UTR) có thể chứa tín hiệu khởi đầu tịnh tiến Kozak mạnh và/hoặc alpha-globin 3′ UTR có thể bao gồm oligo(dT ) trình tự để thêm mẫu đuôi poly-A. Các mRNA biến đổi có thể được biến đổi để làm giảm phản ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào. Các sửa đổi để giảm phản ứng của tế bào có thể bao gồm pseudouridine (ψ) và 5-methyl-cytidine (5meC, 5mc hoặc m5C). (Xem, Kariko K và cộng sự. Immunity 23:165-75 (2005), Kariko K và cộng sự. Mol Ther 16:1833-40 (2008), Anderson B R và cộng sự. NAR (2010); mỗi nội dung trong số đó được đưa vào đây bằng cách viện dẫn toàn bộ).
ORF cũng có thể bao gồm nhiều phần bổ sung ngược dòng hoặc xuôi dòng khác nhau (chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở β-globin, thẻ, v.v.) có thể được đặt hàng từ một dịch vụ tối ưu hóa chẳng hạn như, nhưng giới hạn ở, DNA2.0 (Menlo Park, CA ) và có thể chứa nhiều trang web nhân bản có thể có nhận dạng XbaI. Sau khi nhận được cấu trúc, nó có thể được hoàn nguyên và chuyển thành dạng có khả năng về mặt hóa họcE coli.
Đối với sáng chế hiện tại, NEB DH5-alpha có thẩm quyềnE coliđược sử dụng. Các biến đổi được thực hiện theo hướng dẫn NEB sử dụng 100 ng plasmid. Giao thức như sau:
-
- 1 Làm tan ống NEB 5-alpha có thẩm quyềnE colitế bào trên băng trong 10 phút.
- 2 Thêm 1-5 μl chứa 1 pg-100 ng DNA plasmid vào hỗn hợp tế bào. Cẩn thận lắc ống 4-5 lần để trộn tế bào và DNA. Đừng xoáy.
- 3 Đặt hỗn hợp trên đá trong 30 phút. Không pha trộn.
- 4 Sốc nhiệt ở 42° C. trong đúng 30 giây. Không pha trộn.
- 5 Đặt trên đá trong 5 phút. Không pha trộn.
- 6 Dùng pipet lấy 950 µl SOC ở nhiệt độ phòng vào hỗn hợp.
- 7 Đặt ở 37° C. trong 60 phút. Lắc mạnh (250 vòng/phút) hoặc xoay.
- 8 Làm ấm đĩa chọn đến 37° C.
- 9 Trộn kỹ các tế bào bằng cách lắc ống và đảo ngược.
Rải 50-100 µl mỗi độ pha loãng lên đĩa chọn và ủ qua đêm ở 37° C. Ngoài ra, ủ ở 30° C. trong 24-36 giờ hoặc 25° C. trong 48 giờ.
Sau đó, một khuẩn lạc duy nhất được sử dụng để cấy vào 5 ml môi trường tăng trưởng LB bằng loại kháng sinh thích hợp và sau đó để phát triển (250 vòng/phút, 37° C.) trong 5 giờ. Sau đó, nó được sử dụng để cấy vào môi trường nuôi cấy 200 ml và để phát triển qua đêm trong cùng điều kiện.
Để phân lập plasmid (lên đến 850 pg), việc chuẩn bị maxi được thực hiện bằng cách sử dụng Invitrogen PURELINK™ HiPure Maxiprep Kit (Carlsbad, CA), theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Để tạo ra cDNA cho Phiên mã trong ống nghiệm (IVT), plasmid (ví dụ được trình bày trong
Các phương pháp được mô tả ở đây để tạo ra mARN biến đổi có thể được sử dụng để tạo ra các phân tử có mọi kích cỡ bao gồm cả các phân tử dài. MRNA biến đổi bằng các phương pháp được mô tả đã được tạo ra cho các phân tử có kích thước khác nhau bao gồm glucosidase, alpha; axit (GAA) (3,2 kb), chất điều hòa dẫn truyền màng xơ nang (CFTR) (4,7 kb), Yếu tố VII (7,3 kb), lipase axit lysosomal (45,4 kDa), glucocerebrosidase (59,7 kDa) và iduronate 2-sulfatase (76 kDa ).
Là một ví dụ không giới hạn, G-CSF có thể đại diện cho polypeptit được quan tâm. Trình tự được sử dụng trong các bước được nêu trong Ví dụ 1-5 được trình bày trong Bảng 11. Cần lưu ý rằng codon khởi đầu (ATG) đã được gạch chân trong mỗi trình tự của Bảng 11.
Ví dụ 2: PCR sản xuất cDNA
Quy trình PCR để chuẩn bị cDNA được thực hiện bằng cách sử dụng 2× KAPA HIFI™ HotStart ReadyMix của Kapa Biosystems (Woburn, MA). Hệ thống này bao gồm 2× KAPA ReadyMix 12,5 µl; Sơn lót chuyển tiếp (10 uM) 0,75 μl; Sơn lót ngược (10 uM) 0,75 μl; Mẫu cDNA 100 ng; và dH2O pha loãng thành 25,0 µl. Điều kiện phản ứng là ở 95° C. trong 5 phút. và 25 chu kỳ 98° C. trong 20 giây, sau đó 58° C. trong 15 giây, sau đó 72° C. trong 45 giây, sau đó 72° C. trong 5 phút. sau đó là 4° C. để chấm dứt.
Lớp sơn lót ngược của sáng chế tức thời chứa poly-T120cho một poly-A120trong mARN. Các mồi ngược khác có các dải poly(T) dài hơn hoặc ngắn hơn có thể được sử dụng để điều chỉnh độ dài của đuôi poly(A) trong mRNA.
Phản ứng được làm sạch bằng cách sử dụng PURELINK™ PCR Micro Kit (Carlsbad, CA) của Invitrogen theo hướng dẫn của nhà sản xuất (tối đa 5 μg). Các phản ứng lớn hơn sẽ yêu cầu làm sạch bằng sản phẩm có công suất lớn hơn. Sau khi làm sạch, cDNA được định lượng bằng NANODROP™ và được phân tích bằng điện di trên gel agarose để xác nhận cDNA có kích thước như mong đợi. Sau đó, cDNA được gửi đi phân tích trình tự trước khi tiến hành phản ứng sao chép in vitro.
Ví dụ 3. Phiên mã trong ống nghiệm (IVT)
Phản ứng sao chép in vitro tạo ra mRNA chứa các nucleotide biến đổi hoặc RNA biến đổi. Hỗn hợp nucleotide triphosphate (NTP) đầu vào được sản xuất nội bộ bằng cách sử dụng NTP tự nhiên và phi tự nhiên.
Một phản ứng phiên mã in vitro điển hình bao gồm:
Hỗn hợp IVT thô có thể được bảo quản ở nhiệt độ 4°C qua đêm để làm sạch vào ngày hôm sau. Sau đó, 1 U DNase không có RNase được sử dụng để phân hủy mẫu ban đầu. Sau 15 phút ủ ở 37° C., mRNA được tinh chế bằng Bộ MEGACLEAR™ của Ambion (Austin, TX) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bộ này có thể tinh chế tới 500 μg RNA. Sau khi làm sạch, RNA được định lượng bằng cách sử dụng NanoDrop và được phân tích bằng điện di trên gel agarose để xác nhận RNA có kích thước phù hợp và không xảy ra sự phân hủy RNA.
Ví dụ 4. Sự đóng nắp enzyme của mRNA
Việc đóng nắp mRNA được thực hiện như sau trong đó hỗn hợp bao gồm: IVT RNA 60 μg-180 μg và dH2O lên tới 72 µl. Hỗn hợp này được ủ ở 65°C trong 5 phút để làm biến tính RNA, sau đó được chuyển ngay vào đá.
Sau đó, giao thức bao gồm việc trộn Bộ đệm giới hạn 10× (0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 60 mM KCl, 12,5 mM MgCl2) (10,0 µl); 20 mM GTP (5,0 μl); 20 mM S-Adenosyl Methionine (2,5 μl); Chất ức chế RNase (100 U); 2′-O-Methyltransferase (400U); Enzym đóng nắp bệnh đậu mùa (Guanylyl transferase) (40 U); dH2O (Tối đa 28 µl); và ủ ở 37° C. trong 30 phút đối với 60 μg RNA hoặc tối đa 2 giờ đối với 180 μg RNA.
Sau đó, mRNA được tinh chế bằng Bộ công cụ MEGACLEAR™ của Ambion (Austin, TX) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi làm sạch, RNA được định lượng bằng NANODROP™ (ThermoFisher, Waltham, MA) và được phân tích bằng điện di trên gel agarose để xác nhận RNA có kích thước phù hợp và không xảy ra sự phân hủy RNA. Sản phẩm RNA cũng có thể được giải trình tự bằng cách chạy PCR phiên mã ngược để tạo ra cDNA để giải trình tự.
Ví dụ 5. Phản ứng nối đuôi PolyA
Nếu không có poly-T trong cDNA, phản ứng tạo đuôi poly-A phải được thực hiện trước khi làm sạch sản phẩm cuối cùng. Điều này được thực hiện bằng cách trộn Capped IVT RNA (100 µl); Chất ức chế RNase (20 U); Dung dịch đệm đuôi 10× (0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), NaCl 2,5 M, 100 mM MgCl2)(12,0 µl); 20 mM ATP (6,0 μl); Poly-A Polymerase (20 U); dH2O lên tới 123,5 μl và ủ ở 370 C trong 30 phút. Nếu đuôi poly-A đã có trong bản phiên mã thì phản ứng tạo đuôi có thể được bỏ qua và tiến hành làm sạch trực tiếp bằng bộ MEGACLEAR™ của Ambion (Austin, TX) (tối đa 500 μg). Poly-A Polymerase tốt hơn là một enzyme tái tổ hợp được biểu hiện trong nấm men.
Đối với các nghiên cứu được thực hiện và mô tả ở đây, đuôi poly-A được mã hóa trong khuôn mẫu IVT để có chiều dài 160 nucleotit. Tuy nhiên, cần hiểu rằng quá trình xử lý hoặc tính toàn vẹn của phản ứng tạo đuôi polyA không phải lúc nào cũng tạo ra chính xác 160 nucleotide. Do đó, các đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit, ví dụ, khoảng 150-165, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 hoặc 165 nằm trong phạm vi của sáng chế.
Ví dụ 6. Tương tự 5′ Cap và 5′ Cap tự nhiên
Việc đóng nắp 5′ của RNA biến đổi có thể được hoàn thành đồng thời trong phản ứng phiên mã in vitro bằng cách sử dụng các chất tương tự nắp RNA hóa học sau đây để tạo ra cấu trúc nắp 5′-guanosine theo giao thức của nhà sản xuất: 3′-O-Me-m7G(5′ )ppp(5′) G [giới hạn ARCA]; G(5′)ppp(5′)A; G(5′)ppp(5′)G; m7G(5′)ppp(5′)A; m7G(5′)ppp(5′)G (New England BioLabs, Ipswich, MA). Việc giới hạn 5′ của RNA biến đổi có thể được hoàn thành sau phiên mã bằng cách sử dụng Enzyme giới hạn virus Vaccinia để tạo ra cấu trúc “Cap 0”: m7G(5′)ppp(5′)G (New England BioLabs, Ipswich, MA). Cấu trúc Cap 1 có thể được tạo ra bằng cách sử dụng cả Enzyme phủ virus Vaccinia và enzyme 2′-O methyl-transferase để tạo ra: m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-methyl. Cấu trúc Cap 2 có thể được tạo ra từ cấu trúc Cap 1, sau đó là quá trình methyl hóa 2′-O-nucleotide 5′-antepenultimate bằng cách sử dụng enzyme 2′-0 methyl-transferase. Cấu trúc Cap 3 có thể được tạo ra từ cấu trúc Cap 2, sau đó là quá trình methyl hóa 2′-O-nucleotide 5′-preantepenultimate bằng cách sử dụng enzyme 2′-O methyl-transferase. Tốt hơn là, các enzym có nguồn gốc từ nguồn tái tổ hợp.
Khi được chuyển nhiễm vào tế bào động vật có vú, các mARN biến đổi này có độ ổn định trong khoảng từ 12 đến 18 giờ hoặc hơn 18 giờ, ví dụ, 24, 36, 48, 60, 72 hoặc lớn hơn 72 giờ.
Ví dụ 7. Giới hạn
A. Xét nghiệm biểu hiện protein
Các mARN tổng hợp mã hóa G-CSF của con người (cDNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31904; trình tự mRNA được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine ở mỗi vị trí uridine được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907 với đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit trong chiều dài không được hiển thị theo trình tự) chứa chất tương tự nắp ARCA (3′ O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G) hoặc cấu trúc Cap1 có thể được chuyển hóa vào tế bào sừng sơ cấp ở người ở nồng độ bằng nhau. 6, 12, 24 và 36 giờ sau khi truyền nhiễm, lượng G-CSF được tiết vào môi trường nuôi cấy có thể được phân tích bằng ELISA. Các mRNA tổng hợp tiết ra mức G-CSF cao hơn vào môi trường sẽ tương ứng với một mRNA tổng hợp có cấu trúc Cap có khả năng dịch mã cao hơn.
B. Tổng hợp phân tích độ tinh khiết
Các mARN tổng hợp mã hóa G-CSF của con người (cDNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31904; trình tự mRNA được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine ở mỗi vị trí uridine được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907 với đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit trong chiều dài không được thể hiện theo trình tự) chứa chất tương tự nắp ARCA hoặc các sản phẩm tổng hợp thô cấu trúc Cap1 có thể được so sánh về độ tinh khiết bằng cách sử dụng phương pháp điện di trên gel Agarose-Urê biến tính hoặc phân tích HPLC. Các mRNA tổng hợp có một dải hợp nhất bằng phương pháp điện di tương ứng với sản phẩm có độ tinh khiết cao hơn so với mRNA tổng hợp có nhiều dải hoặc các dải sọc. Các mRNA tổng hợp có một đỉnh HPLC duy nhất cũng sẽ tương ứng với sản phẩm có độ tinh khiết cao hơn. Phản ứng giới hạn có hiệu suất cao hơn sẽ mang lại quần thể mRNA tinh khiết hơn.
C. Phân tích Cytokine
Các mARN tổng hợp mã hóa G-CSF của con người (cDNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31904; trình tự mRNA được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine ở mỗi vị trí uridine được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907 với đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit trong chiều dài không được hiển thị theo trình tự) chứa chất tương tự nắp ARCA hoặc cấu trúc Cap1 có thể được chuyển nhiễm vào tế bào sừng sơ cấp ở người ở nhiều nồng độ. 6, 12, 24 và 36 giờ sau khi truyền, lượng cytokine gây viêm như TNF-alpha và IFN-beta được tiết vào môi trường nuôi cấy có thể được xét nghiệm bằng ELISA. Các mRNA tổng hợp tiết ra lượng cytokine gây viêm cao hơn vào môi trường sẽ tương ứng với một mRNA tổng hợp có chứa cấu trúc nắp kích hoạt miễn dịch.
D. Giới hạn hiệu suất phản ứng
Các mARN tổng hợp mã hóa G-CSF của con người (cDNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31904; trình tự mRNA được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine ở mỗi vị trí uridine được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907 với đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit trong chiều dài không được thể hiện theo trình tự) chứa chất tương tự nắp ARCA hoặc cấu trúc Cap1 có thể được phân tích về hiệu suất phản ứng đóng nắp bằng LC-MS sau khi xử lý mRNA nuclease có nắp. Việc xử lý nuclease của các mARN có nắp sẽ tạo ra hỗn hợp các nucleotide tự do và cấu trúc nắp 5′-5-triphosphate có nắp có thể được phát hiện bởi LC-MS. Lượng sản phẩm bị giới hạn trên phổ LC-MS có thể được biểu thị bằng phần trăm của tổng số mRNA từ phản ứng và sẽ tương ứng với hiệu suất phản ứng giới hạn. Cấu trúc nắp có hiệu suất phản ứng đóng nắp cao hơn sẽ có lượng sản phẩm được đóng nắp cao hơn bởi LC-MS.
Ví dụ 8. Điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR RT hoặc RNA biến đổi
Các RNA biến đổi riêng lẻ (200-400 ng trong thể tích 20 μl) hoặc các sản phẩm PCR phiên mã ngược (200-400 ng) được nạp vào giếng trên Agarose E-Gel 1,2% không biến tính (Invitrogen, Carlsbad, CA) và chạy trong 12-15 phút theo quy trình của nhà sản xuất.
Ví dụ 9. Dữ liệu quang phổ UV và định lượng RNA biến đổi Nanodrop
Các RNA biến đổi trong dung dịch đệm TE (1 μl) được sử dụng để đo độ hấp thụ UV của Nanodrop để định lượng hiệu suất của từng RNA biến đổi từ phản ứng sao chép trong ống nghiệm.
Ví dụ 10. Công thức tạo mRNA biến tính bằng Lipidoid
Các mRNA biến đổi (mmRNA) được tạo ra cho các thí nghiệm in vitro bằng cách trộn mmRNA với lipidoid theo tỷ lệ đã đặt trước khi bổ sung vào tế bào. Công thức in vivo có thể yêu cầu bổ sung thêm các thành phần bổ sung để tạo điều kiện lưu thông khắp cơ thể. Để kiểm tra khả năng của các lipidoid này trong việc tạo thành các hạt thích hợp cho hoạt động in vivo, một quy trình xây dựng công thức tiêu chuẩn được sử dụng cho các công thức siRNA-lipidoid đã được sử dụng làm điểm khởi đầu. Các công thức mmRNA-lipidoid ban đầu có thể bao gồm các hạt gồm 42% lipidoid, 48% cholesterol và 10% PEG, với khả năng tối ưu hóa hơn nữa các tỷ lệ. Sau khi hình thành hạt, mmRNA được thêm vào và được phép tích hợp với phức hợp. Hiệu quả đóng gói được xác định bằng cách sử dụng các thử nghiệm loại trừ thuốc nhuộm tiêu chuẩn.
Vật liệu và phương pháp cho ví dụ 11-15
A. Tổng hợp lipid
Sáu lipit, DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, 98N12-5, C12-200 và DLin-MC3-DMA, được tổng hợp bằng các phương pháp được nêu trong lĩnh vực kỹ thuật này để tạo ra công thức với ARN biến đổi. DLin-DMA và tiền chất được tổng hợp như mô tả trong Heyes et. al, J. Thông cáo Kiểm soát, 2005, 107, 276-287. DLin-K-DMA và DLin-KC2-DMA và các tiền chất được tổng hợp như mô tả trong Semple et. al, Công nghệ sinh học tự nhiên, 2010, 28, 172-176. 98N12-5 và tiền chất được tổng hợp như mô tả trong Akinc et. al, Công nghệ sinh học tự nhiên, 2008, 26, 561-569.
C12-200 và tiền chất được tổng hợp theo phương pháp được nêu trong Love et. al, PNAS, 2010, 107, 1864-1869. 2-epoxydodecan (5,10 g, 27,7 mmol, 8,2 đương lượng) được bổ sung vào lọ chứa Amin 200 (0,723 g, 3,36 mmol, 1 đương lượng) và thanh khuấy. Lọ được đậy kín và làm ấm đến 80° C. Phản ứng được khuấy trong 4 ngày ở 80° C. Sau đó, hỗn hợp này được tinh chế bằng sắc ký silica gel sử dụng gradient từ diclometan tinh khiết (DCM) đến DCM:MeOH 98:2. Hợp chất mục tiêu được tinh chế thêm bằng RP-HPLC để thu được hợp chất mong muốn.
DLin-MC3-DMA và các tiền chất được tổng hợp theo các quy trình được mô tả trong WO 2010054401 ở đây được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn. Hỗn hợp chứa dilinoleyl metanol (1,5 g, 2,8 mmol, 1 đương lượng), axit N,N-dimetylaminobutyric (1,5 g, 2,8 mmol, 1 đương lượng), DIPEA (0,73 mL, 4,2 mmol, 1,5 đương lượng) và TBTU(1,35 g, 4,2 mmol, 1,5 eq) trong 10 mL DMF được khuấy trong 10 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, hỗn hợp phản ứng được pha loãng trong ete và rửa bằng nước. Lớp hữu cơ được làm khô trên natri sulfat khan, lọc và cô dưới áp suất giảm. Sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký silica gel sử dụng gradient DCM đến DCM:MeOH 98:2. Sau đó, hợp chất đích được tinh chế thêm RP-HPLC bằng cách sử dụng cột YMC—Gói C4 để thu được hợp chất đích.
B. Hình thành các hạt nano RNA biến tính
Dung dịch lipid tổng hợp, 1,2-dstearoyl-3-phosphatidylcholine (DSPC) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), cholesterol (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Đức) và α-[3′-(1,2- dimyristoyl-3-propanoxy)-carboxamide-propyl]-ω-methoxy-polyoxyethylene (PEG-c-DOMG) (NOF, Bouwelven, Bỉ) được điều chế ở nồng độ 50 mM trong etanol và được bảo quản ở −20° C. Lipit được kết hợp để thu được tỷ lệ mol 50:10:38,5:1,5 (Lipid: DSPC: Cholesterol: PEG-c-DOMG) và pha loãng bằng etanol đến nồng độ lipid cuối cùng là 25 mM. Dung dịch mARN biến đổi ở nồng độ 1-2 mg/mL trong nước được pha loãng trong dung dịch đệm natri citrat 50 mM ở độ pH bằng 3 để tạo thành dung dịch mARN biến tính gốc. Các chế phẩm chứa lipid và mARN biến đổi được bào chế bằng cách kết hợp dung dịch lipid tổng hợp với dung dịch mARN biến đổi ở tỷ lệ trọng lượng tổng lipid và mARN biến đổi là 10:1, 15:1, 20:1 và 30:1. Dung dịch etanol lipid được tiêm nhanh chóng vào dung dịch mRNA biến tính trong nước để thu được huyền phù chứa 33% etanol. Các dung dịch được tiêm bằng tay (MI) hoặc bằng sự hỗ trợ của bơm ống tiêm (SP) (Bơm ống tiêm kép Harvard Pump 33 Thiết bị Harvard Holliston, MA).
Để loại bỏ ethanol và đạt được sự trao đổi đệm, các công thức này đã được thẩm tách hai lần bằng dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,4 ở thể tích gấp 200 lần sản phẩm chính sử dụng băng cassette Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific Inc. Rockford , IL) với ngưỡng trọng lượng phân tử (MWCO) là 10 kD. Lần thẩm tách đầu tiên được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ và sau đó các công thức được thẩm tách qua đêm ở nhiệt độ 4° C. Huyền phù hạt nano thu được được lọc qua bộ lọc vô trùng 0,2 μm (Sarstedt, Numbrecht, Đức) vào lọ thủy tinh và đóng kín bằng nắp gập .
C. Đặc tính của công thức
Máy Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, UK) đã được sử dụng để xác định kích thước hạt, chỉ số polydispersity (PDI) và thế zeta của các hạt nano mRNA biến tính trong 1×PBS trong việc xác định kích thước hạt và 15 mM PBS trong việc xác định thế zeta.
Quang phổ tia cực tím nhìn thấy được sử dụng để xác định nồng độ của công thức hạt nano mRNA đã biến đổi. 100 µL công thức pha loãng trong 1×PBS được thêm vào 900 µL hỗn hợp metanol và cloroform 4:1 (v/v). Sau khi trộn, phổ hấp thụ của dung dịch được ghi lại trong khoảng từ 230 nm đến 330 nm trên máy quang phổ DU 800 (Beckman Coulter, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Nồng độ RNA biến đổi trong công thức hạt nano được tính toán dựa trên hệ số tuyệt chủng của RNA biến đổi được sử dụng trong công thức và dựa trên sự khác biệt giữa độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và giá trị cơ bản ở bước sóng 330 nm.
Xét nghiệm RNA QUANT-IT™ RIBOGREEN® (Invitrogen Corporation Carlsbad, CA) đã được sử dụng để đánh giá khả năng đóng gói RNA biến đổi bằng hạt nano. Các mẫu được pha loãng đến nồng độ khoảng 5 μg/mL trong dung dịch đệm TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5). 50 μL mẫu đã pha loãng được chuyển sang đĩa polystyrene 96 giếng, sau đó thêm 50 μL dung dịch đệm TE hoặc 50 μL dung dịch Triton X-100 2% vào. Đĩa được ủ ở nhiệt độ 37°C trong 15 phút. Thuốc thử RIBOGREEN® được pha loãng theo tỷ lệ 1:100 trong dung dịch đệm TE, 100 µL dung dịch này được thêm vào từng giếng. Cường độ huỳnh quang được đo bằng đầu đọc tấm huỳnh quang (Bộ đếm đa nhãn Wallac Victor 1420; Perkin Elmer, Waltham, MA) ở bước sóng kích thích ˜480 nm và bước sóng phát xạ ˜520 nm. Giá trị huỳnh quang của mẫu trắng thuốc thử được trừ đi khỏi giá trị của từng mẫu và phần trăm RNA biến đổi tự do được xác định bằng cách chia cường độ huỳnh quang của mẫu nguyên vẹn (không bổ sung Triton X-100) cho giá trị huỳnh quang của mẫu bị phá vỡ. mẫu (do bổ sung Triton X-100).
D. Ủ trong ống nghiệm
Tế bào biểu mô thận phôi người (HEK293) và tế bào biểu mô ung thư biểu mô tế bào gan (HepG2) (LGC tiêu chuẩn GmbH, Wesel, Đức) đã được gieo hạt trên các đĩa 96 giếng (Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen, Đức) và các đĩa cho tế bào HEK293 được phủ trước bằng collagen loại 1. HEK293 được gieo hạt với mật độ 30.000 và HepG2 được gieo hạt với mật độ 35.000 tế bào mỗi giếng trong môi trường nuôi cấy tế bào 100 μl. Đối với HEK293, môi trường nuôi cấy tế bào là DMEM, 10% FCS, thêm 2 mM L-Glutamine, 1 mM Natripyruvate và 1× axit amin không thiết yếu (Biochrom AG, Berlin, Đức) và 1,2 mg/ml Natribicarbonate (Sigma-Aldrich, Munich, Đức) và đối với HepG2, môi trường nuôi cấy là MEM (Gibco Life Technologies, Darmstadt, Đức), 10% FCS thêm 2 mM L-Glutamine, 1 mM Natripyruvate và 1× axit amin không thiết yếu (Biochrom AG, Berlin, Đức Các công thức chứa mCherry mRNA (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1) được thêm vào thành bốn lần ngay sau khi gieo hạt vào tế bào và ủ cDNA mCherry. Trình khởi động T7, vùng 5′không được dịch mã (UTR) và 3′ UTR được sử dụng trong phiên mã in vitro (IVT) được nêu trong SEQ ID NO: 31909. MRNA mCherry đã được biến đổi với 5meC ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine tại mỗi vị trí uridine.
Các tế bào được thu hoạch bằng cách chuyển chất nổi trên bề mặt của môi trường nuôi cấy sang đĩa đáy chữ U Pro-Bind 96 giếng (Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg, Đức). Các tế bào đã được cố gắng cố định với 1/2 thể tích Trypsin/EDTA (Biochrom AG, Berlin, Đức), gộp với các chất nổi phía trên tương ứng và cố định bằng cách thêm một thể tích PBS/2% FCS (cả Biochrom AG, Berlin, Đức)/0,5% formaldehyde (Merck , Darmstadt, Đức). Sau đó, các mẫu được gửi đến máy đo tế bào dòng chảy bằng laser kích thích 532nm và bộ lọc 610/20 cho PE-Texas Red trong máy đo tế bào LSRII (Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg, Đức). Cường độ huỳnh quang trung bình (MFI) của tất cả các sự kiện và độ lệch chuẩn của bốn giếng độc lập được trình bày cho các mẫu được phân tích.
Ví dụ 11. Tinh chế công thức hạt nano
Các công thức hạt nano của DLin-KC2-DMA và 98N12-5 trong HEK293 và HepG2 đã được thử nghiệm để xác định xem cường độ huỳnh quang trung bình (MFI) có phụ thuộc vào tỷ lệ lipid và RNA biến đổi và/hoặc quá trình tinh chế hay không. Ba công thức Dlin-KC2-DMA và hai công thức 98N12-5 được sản xuất bằng cách sử dụng bơm tiêm theo các thông số kỹ thuật được mô tả trong Bảng 12. Các mẫu đã tinh chế được tinh chế bằng loại DNA SEPHADEX™ G-25 (GE Healthcare, Thụy Điển). Mỗi công thức trước và sau khi tinh chế (aP) đều được thử nghiệm ở nồng độ 250 ng RNA biến đổi trên mỗi giếng trong đĩa 24 giếng. Tỷ lệ tế bào dương tính với chất đánh dấu cho kênh FL4 (% FL4 dương tính) khi được phân tích bằng máy đếm tế bào dòng chảy cho mỗi công thức và mẫu nền, cũng như MFI của chất đánh dấu cho kênh FL4 cho mỗi công thức và mẫu nền được thể hiện trong Bảng 13. Các công thức đã được tinh chế có MFI cao hơn một chút so với các công thức được thử nghiệm trước khi tinh chế.
Ví dụ 12. Đường cong đáp ứng nồng độ
Các công thức hạt nano 98N12-5 (NPA-005) và DLin-KC2-DMA (NPA-003) đã được thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau để xác định MFI của FL4 hoặc mCherry (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có kích thước xấp xỉ 160 nucleotide không được trình bày theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và pseudouridine) trong một khoảng liều lượng. Các công thức được thử nghiệm được nêu trong Bảng 14. Để xác định nồng độ tối ưu của các công thức hạt nano 98N12-5, các nồng độ khác nhau của RNA biến đổi được tạo thành (100 ng, 10 ng, 1,0 ng, 0,1 ng và 0,01 ng mỗi giếng) đã được thử nghiệm trong một giếng Đĩa 24 giếng HEK293 và kết quả FL4 MFI của mỗi liều được trình bày trong Bảng 15. Tương tự, để xác định nồng độ tối ưu của các công thức hạt nano của Dlin-KC2-DMA, các nồng độ khác nhau của RNA biến đổi được tạo thành (250 ng 100 ng, 10 ng, 1,0 ng, 0,1 ng và 0,01 ng mỗi giếng) đã được thử nghiệm trên đĩa 24 giếng HEK293 và kết quả FL4 MFI của mỗi liều được thể hiện trong Bảng 16. Công thức hạt nano của Dlin-KC2- DMA cũng đã được thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau của RNA biến đổi theo công thức (250 ng, 100 ng và 30 ng mỗi giếng) trong đĩa HEK293 24 giếng và kết quả FL4 MFI của mỗi liều được trình bày trong Bảng 17. Một liều 1 ng/giếng đối với 98N12-5 và liều 10 ng/giếng đối với Dlin-KC2-DMA được cho là giống với FL4 MFI của nền.
Để xác định mức độ giống của nồng độ với nền, chúng tôi đã sử dụng máy đo dòng chảy với bộ lọc được tối ưu hóa để phát hiện biểu hiện mCherry và có thể thu được kết quả với độ nhạy tăng lên so với mức nền. Các liều 25 ng/giếng, 0,25 ng/giếng, 0,025 ng/giếng và 0,0025 ng/giếng được phân tích cho 98N12-5 (NPA-005) và DLin-KC2-DMA (NPA-003) để xác định MFI của mCherry. Như được trình bày trong Bảng 18, nồng độ 0,025 ng/giếng và nồng độ thấp hơn tương tự với mức MFI nền của mCherry là khoảng 386,125.
Ví dụ 13. Công thức tiêm thủ công và bơm tiêm
Hai công thức Dlin-KC2-DMA và 98N12-5 được điều chế bằng cách tiêm thủ công (MI) và tiêm bơm ống tiêm (SP) và được phân tích cùng với mẫu nền để so sánh MFI của mCherry (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31908 ; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) có các công thức khác nhau. Bảng 19 cho thấy các công thức bơm tiêm có MFI cao hơn so với các công thức tiêm thủ công có cùng tỷ lệ lipid và lipid/RNA.
Ví dụ 14. Công thức hạt nano lipid
Các công thức Dlin-DMA, Dlin-K-DMA, Dlin-KC2-DMA, 98N12-5, C12-200 và DLin-MC3-DMA được ủ ở nồng độ 60 ng/giếng hoặc 62,5 ng/giếng trong đĩa chứa HEK293 và 62,5 ng/giếng trong đĩa tế bào HepG2 trong 24 giờ để xác định MFI của mCherry (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1; đầy đủ được biến đổi bằng 5-methylcytosine và pseudouridine) cho mỗi công thức. Các công thức được thử nghiệm được nêu trong Bảng 20 dưới đây. Như được hiển thị trong Bảng 21 cho 60 ng/giếng và Bảng 22, 23, 24 và 25 cho 62,5 ng/giếng, công thức của NPA-003 và NPA-018 có MFI mCherry cao nhất và các công thức của NPA-008, NPA-010 và NPA-013 gần giống với giá trị mCherry MFI của mẫu nền.
Ví dụ 15. Nghiên cứu công thức in Vivo
Loài gặm nhấm (n=5) được tiêm tĩnh mạch, tiêm dưới da hoặc tiêm bắp một liều duy nhất của công thức chứa mARN biến đổi và lipid. MRNA biến đổi được sử dụng cho loài gặm nhấm được chọn từ G-CSF (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1), erythropoietin (EPO) (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1), Yếu tố IX (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5 ′cap, Cap1) hoặc mCherry (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1). cDNA erythropoietin với trình tự khởi đầu T7, vùng 5′chưa được dịch mã (UTR) và 3′ UTR được sử dụng trong phiên mã in vitro (IVT) được nêu trong SEQ ID NO: 31912 và SEQ ID NO: 31913.
Mỗi công thức cũng chứa một lipid được chọn từ một trong các DLin-DMA, Dlin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, reLNP, ATUPLEX®, DACC và DBTC . Các loài gặm nhấm được tiêm 100 ug, 10 ug hoặc 1 ug mRNA đã biến đổi trong công thức và các mẫu được thu thập trong khoảng thời gian xác định.
Huyết thanh từ các công thức dành cho loài gặm nhấm được sử dụng có chứa mARN biến đổi G-CSF của con người được đo bằng ELISA G-CSF cụ thể và huyết thanh từ chuột được sử dụng ARN biến đổi yếu tố IX của con người được phân tích bằng xét nghiệm ELISA yếu tố IX đặc hiệu hoặc xét nghiệm tạo màu. Gan và lá lách của những con chuột được tiêm mRNA biến đổi mCherry được phân tích bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC) hoặc phân loại tế bào được kích hoạt bằng huỳnh quang (FACS). Để kiểm soát, một nhóm chuột không được tiêm bất kỳ công thức nào và huyết thanh và mô của chúng được thu thập để phân tích bằng ELISA, FACS và/hoặc IHC.
A. Khóa học về thời gian
Loài gặm nhấm được sử dụng các công thức chứa ít nhất một mARN biến đổi để nghiên cứu diễn biến biểu hiện protein theo thời gian đối với công thức được sử dụng. Các loài gặm nhấm được cắt máu theo các khoảng thời gian xác định trước và sau khi sử dụng các công thức mARN biến đổi để xác định biểu hiện protein và tổng lượng máu. Các mẫu cũng được thu thập từ vị trí cho loài gặm nhấm sử dụng công thức mARN biến đổi dưới da và tiêm bắp để xác định sự biểu hiện protein trong mô.
B. Đáp ứng liều lượng
Loài gặm nhấm được sử dụng các công thức chứa ít nhất một mARN biến đổi để xác định phản ứng liều lượng của mỗi công thức. Các loài gặm nhấm được cắt máu theo các khoảng thời gian xác định trước và sau khi sử dụng các công thức mARN biến đổi để xác định biểu hiện protein và tổng lượng máu. Các loài gặm nhấm cũng được hiến tế để phân tích tác động của công thức mRNA biến đổi lên mô bên trong. Các mẫu cũng được thu thập từ vị trí cho loài gặm nhấm sử dụng công thức mARN biến đổi dưới da và tiêm bắp để xác định sự biểu hiện protein trong mô.
C. Độc tính
Loài gặm nhấm được sử dụng các công thức có chứa ít nhất một mARN biến đổi để nghiên cứu độc tính của mỗi công thức. Các loài gặm nhấm được cắt máu theo các khoảng thời gian xác định trước và sau khi sử dụng các công thức mARN biến đổi để xác định biểu hiện protein và tổng lượng máu. Các loài gặm nhấm cũng được dùng để phân tích tác động của công thức mRNA biến đổi lên mô bên trong. Các mẫu cũng được thu thập từ vị trí cho loài gặm nhấm sử dụng công thức mARN biến đổi dưới da và tiêm bắp để xác định sự biểu hiện protein trong mô.
Ví dụ 16. Công thức kính hiển vi PLGA
Việc tối ưu hóa các tham số được sử dụng trong quá trình hình thành các vi cầu PLGA có thể cho phép tốc độ giải phóng có thể điều chỉnh được và hiệu quả bao bọc cao trong khi vẫn duy trì tính toàn vẹn của RNA biến đổi được bao bọc trong các vi cầu. Các thông số như, nhưng không giới hạn, kích thước hạt, tốc độ thu hồi và hiệu quả đóng gói có thể được tối ưu hóa để đạt được công thức tối ưu.
A. Tổng hợp vi cầu PLGA
Các vi cầu axit polylacticglycolic (PLGA) được tổng hợp bằng phương pháp nhũ tương kép nước/dầu/nước đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này bằng cách sử dụng PLGA (Lactel, Cat #B6010-2, độ nhớt vốn có 0,55-0,75, 50:50 LA:GA), polyvinylalcohol (PVA) ) (Sigma, Cat #348406-25G, MW 13-23 k) diclometan và nước. Tóm lại, 0,1 ml nước (W1) được thêm vào 2 ml PLGA hòa tan trong dichloromethane (DCM) (01) ở nồng độ từ 50-200 mg/ml PLGA. Nhũ tương W1/O1 được đồng nhất hóa (IKA Ultra-Turrax hom*ogenizer, T18) trong 30 giây ở tốc độ 4 (˜15.000 vòng/phút). Nhũ tương W1/01 sau đó được thêm vào 100 đến 200 ml PVA (W2) từ 0,3 đến 1% và được đồng nhất hóa trong 1 phút ở các tốc độ khác nhau. Các công thức được khuấy trong 3 giờ và sau đó được rửa bằng cách ly tâm (20-25 phút, 4.000 vòng/phút, 4° C.). Phần nổi phía trên được loại bỏ và các viên PLGA được hòa lại trong 5-10 ml nước, được lặp lại 2×. Kích thước hạt trung bình (đại diện cho 20-30 hạt) cho mỗi công thức được xác định bằng kính hiển vi sau khi rửa. Bảng 26 cho thấy sự gia tăng nồng độ PLGA dẫn đến các vi cầu có kích thước lớn hơn. Nồng độ PLGA 200 mg/mL cho kích thước hạt trung bình là 14,8 μm, 100 mg/mL là 8,7 μm và 50 mg/mL PLGA cho kích thước hạt trung bình là 4,0 μm.
Bảng 27 cho thấy việc giảm tốc độ đồng nhất từ 5 (˜20.000 vòng/phút) xuống tốc độ 4 (˜15.000 vòng/phút) dẫn đến tăng kích thước hạt từ 14,8 μm lên 29,7 μm.
Bảng 28 cho thấy rằng việc tăng thể tích W2 (tức là tăng tỷ lệ W2:O1 từ 50:1 lên 100:1), kích thước hạt trung bình sẽ giảm một chút. Việc thay đổi nồng độ PVA từ 0,3 đến 1% trọng lượng ít ảnh hưởng đến kích thước kính hiển vi PLGA.
B. Đóng gói mRNA biến tính
MRNA G-CSF đã sửa đổi (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được hòa tan trong nước ở nồng độ bằng 2 mg/ml (W3). Ba lô công thức kính hiển vi PLGA đã được thực hiện như mô tả ở trên với các thông số sau: 0,1 ml W3 ở mức 2 mg/ml, 1,6 ml O1 ở mức 200 mg/ml, 160 ml W2 ở mức 1% và được đồng nhất hóa ở tốc độ 200 mg/ml. 4 cho nhũ tương thứ nhất (W3/01) và đồng nhất ở tốc độ 5 cho nhũ tương thứ hai (W3/01/W2). Sau khi rửa bằng cách ly tâm, các công thức được đông lạnh trong nitơ lỏng và sau đó đông khô trong 3 ngày. Để kiểm tra hiệu quả bao nang của các công thức, vật liệu đông khô được biến dạng trong DCM trong 6 giờ, sau đó được chiết qua đêm trong nước. Nồng độ RNA biến đổi trong các mẫu sau đó được xác định bằng OD260. Hiệu suất đóng gói được tính bằng cách lấy lượng RNA biến đổi thực tế và chia cho lượng RNA biến đổi ban đầu. Trong ba lô được thử nghiệm, hiệu suất đóng gói là 59,2, 49,8 và 61,3.
C. Tính toàn vẹn của mRNA đã biến đổi được gói gọn trong kính hiển vi PLGA
MRNA của Yếu tố IX được Sửa đổi (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được hòa tan trong nước ở các nồng độ khác nhau (W4 ) để thay đổi phần trăm trọng lượng trong công thức (mg RNA biến đổi/mg PLGA*100) và để xác định hiệu quả đóng gói. Các thông số trong Bảng 29 được sử dụng để tạo ra bốn lô công thức vi cầu PLGA khác nhau với tốc độ đồng nhất là 4 cho nhũ tương thứ nhất (W4/01) và tốc độ đồng nhất là 5 cho nhũ tương thứ hai (W4/O1/W2).
Sau khi đông khô, các vi cầu PLGA được cân trong các ống eppendorf 2 ml để tương ứng với ˜10 ug RNA biến tính. Quá trình đông khô được phát hiện là không phá hủy cấu trúc tổng thể của các vi cầu PLGA. Để tăng tải phần trăm trọng lượng (wt%) cho các vi cầu PLGA, lượng RNA biến đổi ngày càng tăng đã được thêm vào các mẫu. Các kính hiển vi PLGA được làm biến dạng bằng cách thêm 1,0 ml DCM vào mỗi ống và sau đó lắc mẫu trong 6 giờ. Để chiết RNA biến tính, 0,5 ml nước được thêm vào mỗi mẫu và mẫu được lắc qua đêm trước khi nồng độ RNA biến đổi trong mẫu được xác định bằng OD260. Để xác định khả năng thu hồi của quá trình chiết, RNA biến đổi Yếu tố IX chưa được tạo thành công thức (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine ) (điều khiển biến dạng) được đưa vào DCM và chịu quá trình biến dạng. Bảng 30 cho thấy hiệu suất nạp và đóng gói của các mẫu. Tất cả các mẫu hiệu quả đóng gói đã được chuẩn hóa thành điều khiển biến dạng.
D. Nghiên cứu phát hành mRNA biến đổi được đóng gói trong kính hiển vi PLGA
Các vi cầu PLGA được tạo ra với RNA biến đổi Yếu tố IX (trình tự mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) đã bị biến dạng như mô tả ở trên và tính toàn vẹn của RNA biến đổi được chiết xuất được xác định bằng phương pháp điện di tự động (Bio-Rad Experion). MARN biến đổi được chiết xuất được so sánh với mARN biến đổi chưa được tạo thành công thức và biện pháp kiểm soát sự biến dạng để kiểm tra tính toàn vẹn của mARN biến đổi được bao nang. Như thể hiện trong
E. Biểu hiện protein của mRNA biến đổi được bao bọc trong kính hiển vi PLGA
Các vi cầu PLGA được tạo ra với RNA biến đổi Yếu tố IX (trình tự mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) đã bị biến dạng như mô tả ở trên và sự biểu hiện protein của RNA biến đổi được chiết xuất được xác định bằng xét nghiệm chuyển nhiễm trong ống nghiệm. Các tế bào HEK293 được thay thế ngược với 250 ng RNA biến đổi Yếu tố IX được tạo phức với RNAiMAX (Invitrogen) ba lần.
RNA biến đổi yếu tố IX được pha loãng trong nước không có nuclease đến nồng độ 25 ng/μl và RNAiMAX được pha loãng 13,3 × trong EMEM không có huyết thanh. Các thể tích bằng nhau của RNA biến đổi đã pha loãng và RNAiMAX pha loãng được trộn với nhau và để yên trong 20 đến 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, 20 µl hỗn hợp chuyển nhiễm chứa 250 ng RNA biến đổi Yếu tố IX đã được thêm vào 80 µl huyền phù tế bào chứa 30.000 tế bào. Sau đó, các tế bào được ủ trong 16 giờ trong tủ ấm nuôi cấy tế bào có độ ẩm 37° C./5% CO2 trước khi thu hoạch dịch nổi nuôi cấy tế bào. Sự biểu hiện protein yếu tố IX trong phần nổi phía trên tế bào được phân tích bằng bộ ELISA đặc hiệu cho Yếu tố IX (Đổi mới phân tử, Cat #HFIXKT-TOT) và sự biểu hiện protein được thể hiện trong Bảng 31 và
F. Nghiên cứu phát hành mRNA biến đổi được đóng gói trong kính hiển vi PLGA
Các vi hạt PLGA được tạo ra với RNA biến đổi Yếu tố IX (trình tự mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được hòa lại trong nước để nồng độ vi cầu PLGA là 24 mg/ml. Sau khi huyền phù lại, 150 ul huyền phù vi cầu PLGA được chia thành các ống eppendorf. Các mẫu được ủ và lắc ở nhiệt độ 37°C trong suốt quá trình nghiên cứu. Mẫu ba lần được lấy vào lúc 0,2, 1, 2, 8, 14 và 21 ngày. Để xác định lượng RNA biến đổi được giải phóng từ các vi cầu PLGA, các mẫu được ly tâm, phần nổi phía trên được loại bỏ và nồng độ RNA biến đổi trong phần nổi phía trên được xác định bằng OD 260. Phần trăm giải phóng, thể hiện trong Bảng 32, được tính toán dựa trên công thức tổng lượng RNA biến đổi trong mỗi mẫu. Sau 31 ngày, 96% RNA biến đổi Yếu tố IX đã được giải phóng khỏi công thức vi cầu PLGA.
G. Khả năng tái tạo kích thước hạt của kính hiển vi PLGA
Ba lô RNA được biến đổi Yếu tố IX (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) các vi cầu PLGA được tạo ra bằng cách sử dụng các điều kiện tương tự được mô tả cho Mẻ D, được thể hiện trong Bảng 29, (0,4 ml W4 ở mức 4 mg/ml, 2,0 ml O1 ở mức 200 mg/ml, 200 ml W2 ở mức 1% và đồng nhất hóa ở tốc độ 5 cho nhũ tương W4/O1/W2). Để cải thiện tính đồng nhất của huyền phù vi cầu PLGA, quá trình lọc được kết hợp trước khi ly tâm. Sau khi khuấy trong 3 giờ và trước khi ly tâm, tất cả vật liệu được tạo thành được đưa qua lưới lọc nylon 100 μm (Bộ lọc tế bào Fisherbrand, Cat #22-363-549) để loại bỏ các cốt liệu lớn hơn. Sau khi rửa và hòa lại bằng nước, 100-200 µl mẫu vi cầu PLGA được sử dụng để đo kích thước hạt của các công thức bằng nhiễu xạ laser (Malvern Mastersizer2000). Cỡ hạt của các mẫu được thể hiện trong Bảng 33.
Kết quả của 3 lô vi cầu PLGA sử dụng phương pháp lọc được so sánh với một lô vi cầu PLGA được tạo ra trong cùng điều kiện mà không lọc. Việc đưa vào bước lọc trước khi rửa làm giảm kích thước hạt trung bình và thể hiện sự phân bổ kích thước hạt nhất quán giữa 3 lô vi cầu PLGA.
H. Độ ổn định trong huyết thanh của vi cầu PLGA yếu tố IX
Yếu tố IX mRNA RNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) trong dung dịch đệm (TE) hoặc 90% huyết thanh (Se), hoặc mRNA Yếu tố IX trong PLGA trong đệm, 90% huyết thanh hoặc 1% huyết thanh được ủ trong đệm, 90% huyết thanh hoặc 1% huyết thanh ở nồng độ mRNA là 50 ng/ul trong tổng thể tích 70 ul. Các mẫu được lấy ra sau 0, 30, 60 hoặc 120 phút. RNase bị bất hoạt khi phân hủy proteinase K trong 20 phút ở 55° C. bằng cách thêm 25 ul dung dịch đệm proteinase K 4× (0,4 ml 1M TRIS-HCl pH 7,5, 0,1 ml EDTA 0,5M, 0,12 ml 5M NaCl và 0,4 ml 10 % SDS) và 8 ul proteinase K ở nồng độ 20 mg/ml. Yếu tố IX mRNA đã được kết tủa (thêm 250 ul 95% etanol trong 1 giờ, ly tâm trong 10 phút với tốc độ 13 k vòng/phút và loại bỏ phần nổi phía trên, thêm 200 ul 70% etanol vào viên, ly tâm lại trong 5 phút ở tốc độ 13 k vòng/phút và loại bỏ nổi phía trên và hòa lại cặn trong 70 ul nước) hoặc chiết từ các vi cầu PLGA (ly tâm 5 phút ở tốc độ 13 k vòng/phút và loại bỏ phần nổi phía trên, rửa viên bằng 1 ml nước, ly tâm 5 phút ở tốc độ 13 k vòng/phút và loại bỏ phần nổi phía trên, thêm 280 ul dichloromethane vào viên và lắc trong 15 phút, thêm 70 ul nước sau đó lắc trong 2 giờ và loại bỏ pha nước) trước khi phân tích bằng máy phân tích sinh học. Các vi cầu PLGA bảo vệ mRNA đã biến đổi Yếu tố IX khỏi bị thoái hóa ở 90% và 1% huyết thanh trong hơn 2 giờ. MRNA biến đổi yếu tố IX phân hủy hoàn toàn trong huyết thanh 90% tại thời điểm ban đầu.
Ví dụ 17. Hạt nano lipid trong nghiên cứu Vivo
G-CSF (cDNA với trình tự khởi đầu T7, 5′ Vùng chưa được dịch mã (UTR) và 3′UTR được sử dụng trong phiên mã in vitro được nêu trong SEQ ID NO: 31906. trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA khoảng 160 các nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap 1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) và Yếu tố IX (cDNA với trình tự khởi đầu T7, 5′ UTR và 3′UTR được sử dụng trong phiên mã in vitro được nêu trong SEQ ID NO : 31914. trình tự mARN thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap 1; được biến đổi hoàn toàn với mARN biến đổi 5-methylcytosine và pseudouridine) được tạo thành dưới dạng hạt nano lipid (LNP) bằng phương pháp bơm ống tiêm. Các LNP được tạo thành theo tỷ lệ trọng lượng 20:1 của tổng lipid so với mRNA biến đổi với tỷ lệ mol lipid cuối cùng là 50:10:38,5:1,5 (DLin-KC2-DMA: DSPC: Cholesterol: PEG-c-DOMG). Các công thức, được liệt kê trong Bảng 34, được đặc trưng bởi kích thước hạt, thế zeta, và khả năng đóng gói.
Các công thức LNP được tiêm tĩnh mạch cho chuột (n=5) với liều mRNA đã được sửa đổi là 100, 10 hoặc 1 ug. Chuột đã hy sinh vào lúc 8 giờ sau khi dùng thuốc. Huyết thanh được thu thập bằng cách chọc thủng tim từ những con chuột được sử dụng công thức mRNA được biến đổi G-CSF hoặc Yếu tố IX. Biểu hiện protein được xác định bằng ELISA.
Không có sự giảm trọng lượng cơ thể đáng kể (<5%) ở nhóm dùng liều G-CSF hoặc Yếu tố IX. Biểu hiện protein đối với nhóm liều G-CSF hoặc Yếu tố IX được xác định bằng ELISA từ đường cong chuẩn. Các mẫu huyết thanh được pha loãng (khoảng 20-2500× đối với G-CSF và khoảng 10-250× đối với Yếu tố IX) để đảm bảo các mẫu nằm trong phạm vi tuyến tính của đường cong chuẩn. Như được thể hiện trong Bảng 35, sự biểu hiện protein G-CSF được xác định bằng ELISA lần lượt là khoảng 17, 1200 và 4700 ng/ml đối với các nhóm liều 1, 10 và 100 xấu. Như được thể hiện trong Bảng 36, sự biểu hiện protein Yếu tố IX được xác định bằng ELISA lần lượt là khoảng 36, 380 và 3000-11000 ng/ml đối với các nhóm liều 1, 10 và 100 xấu.
Như được thể hiện trong Bảng 37, các công thức LNP được mô tả ở trên có khả năng sản xuất protein tăng khoảng 10.000-100.000 lần so với việc sử dụng công thức-lipoplex tiêm tĩnh mạch (IV) với cùng một liều lượng mRNA biến đổi và tiêm bắp (IM) hoặc tiêm dưới da. (SC) sử dụng cùng một liều mRNA biến đổi trong nước muối. Như được sử dụng trong Bảng 37, ký hiệu “˜” có nghĩa là khoảng.
Vật liệu và phương pháp cho ví dụ 18-23
G-CSF (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap 1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) và EPO (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap 1; được biến đổi hoàn toàn bằng mRNA biến đổi 5-methylcytosine và pseudouridine được tạo thành dưới dạng hạt nano lipid (LNP) bằng phương pháp bơm ống tiêm. Các LNP được tạo thành theo tỷ lệ trọng lượng 20:1 của tổng lipid so với mRNA biến đổi với tỷ lệ mol lipid cuối cùng là 50:10:38,5:1,5 (DLin-KC2-DMA: DSPC: Cholesterol: PEG-c-DOMG). Các công thức, được liệt kê trong Bảng 38, được đặc trưng bởi kích thước hạt, thế zeta, và khả năng đóng gói.
Ví dụ 18. Hạt nano lipid trong nghiên cứu Vivo với mRNA biến tính
Các công thức LNP, được thể hiện trong Bảng 38 (ở trên), được sử dụng cho chuột (n=5) qua đường tiêm tĩnh mạch (IV), tiêm bắp (IM) hoặc tiêm dưới da (SC) với một liều mRNA biến đổi duy nhất là 0,05 mg/kg. Một nhóm chuột đối chứng (n=4) không được điều trị. Chuột bị chảy máu lúc 2 giờ, 8 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 96 giờ và sau khi chúng được dùng công thức mRNA biến đổi G-CSF hoặc EPO để xác định biểu hiện protein bằng ELISA. Những con chuột được tiêm tĩnh mạch mRNA biến đổi EPO cũng bị chảy máu sau 7 ngày.
Như được thể hiện trong Bảng 39, có thể phát hiện được sự biểu hiện protein EPO ở chuột được tiêm tĩnh mạch mARN EPO biến đổi đã biến đổi trong vòng 5 ngày. G-CSF ở chuột được tiêm tĩnh mạch G-CSF mRNA biến đổi có thể được phát hiện sau 7 ngày. Có thể phát hiện được mARN biến đổi EPO khi tiêm dưới da và tiêm bắp trong ít nhất 24 giờ và có thể phát hiện mARN biến đổi G-CSF trong ít nhất 8 giờ. Trong Bảng 39, “OSC” đề cập đến các giá trị nằm ngoài đường cong tiêu chuẩn và “NT” có nghĩa là không được kiểm tra.
Ví dụ 19. Time Course In Vivo Study
Các công thức LNP, được thể hiện trong Bảng 38 (ở trên), được sử dụng qua đường tiêm tĩnh mạch cho chuột (n=5) (IV) với một liều mRNA biến đổi duy nhất là 0,5, 0,05 hoặc 0,005 mg/kg. Những con chuột bị chảy máu vào lúc 8 giờ, 24 giờ, 72 giờ và 6 ngày sau khi chúng được dùng công thức mRNA biến đổi G-CSF hoặc EPO để xác định biểu hiện protein bằng ELISA.
Như được thể hiện trong Bảng 40, có thể phát hiện sự biểu hiện protein EPO và G-CSF ở chuột được tiêm tĩnh mạch với mARN biến đổi trong vòng 72 giờ đối với chuột được tiêm liều 0,005 mg/kg và 0,05 mg/kg mARN biến đổi và trong 6 ngày. đối với những con chuột được sử dụng mRNA đã được sửa đổi EPO. Trong Bảng 40, “>” có nghĩa là lớn hơn và “ND” có nghĩa là không được phát hiện.
Ví dụ 20. Công thức LNP trong nghiên cứu Vivo ở loài gặm nhấm
A. Công thức LNP ở chuột
Các công thức LNP, được thể hiện trong Bảng 38 (ở trên), được sử dụng qua đường tiêm tĩnh mạch cho chuột (n=4) (IV) với một liều mRNA biến đổi duy nhất là 0,05 mg/kg hoặc 0,005 mg/kg. Ngoài ra còn có 3 nhóm chuột đối chứng (n=4) không được điều trị. Những con chuột bị chảy máu vào lúc 2 giờ, 8 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi chúng được dùng công thức mRNA biến đổi G-CSF hoặc EPO để xác định biểu hiện protein. Biểu hiện protein của G-CSF và EPO được xác định bằng ELISA.
Như được trình bày trong Bảng 41, có thể phát hiện sự biểu hiện protein EPO và G-CSF ở chuột ít nhất trong vòng 48 giờ đối với những con chuột nhận được liều 0,005 mg/kg RNA biến đổi và 72 giờ đối với những con chuột nhận được liều 0,05 mg/kg RNA biến tính. Trong Bảng 41, “OSC” đề cập đến các giá trị nằm ngoài đường chuẩn và “NT” có nghĩa là không được kiểm tra.
B. Công thức LNP ở loài gặm nhấm
Các công thức LNP, được thể hiện trong Bảng 38 (ở trên), được sử dụng qua đường tiêm tĩnh mạch cho chuột (n=4) (IV) với một liều mRNA biến đổi duy nhất là 0,05 mg/kg. Ngoài ra còn có một nhóm chuột đối chứng (n=4) không được điều trị. Chuột bị chảy máu vào lúc 2 giờ, 8 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 7 ngày và 14 ngày sau khi chúng được dùng công thức mRNA biến đổi G-CSF hoặc EPO để xác định biểu hiện protein. Sự biểu hiện protein của G-CSF và EPO được xác định bằng ELISA.
Ví dụ 21. Nghiên cứu khóa học sớm về LNP
Các công thức LNP, được thể hiện trong Bảng 38 (ở trên), được sử dụng cho động vật có vú qua đường tiêm tĩnh mạch (IV), tiêm bắp (IM) hoặc tiêm dưới da (SC) với một liều mRNA biến đổi duy nhất là 0,5 mg/kg, 0,05 mg/kg hoặc 0,005 mg/kg . Một nhóm động vật có vú đối chứng không được điều trị. Động vật có vú bị chảy máu sau 5 phút, 10 phút, 20 phút, 30 phút, 45 phút, 1 giờ, 1,5 giờ và/hoặc 2 giờ sau khi chúng được sử dụng công thức mRNA LNP cải tiến để xác định biểu hiện protein bằng ELISA. Động vật có vú cũng được lấy máu để xác định số lượng máu tổng thể như số lượng bạch cầu hạt và số lượng hồng cầu.
Ví dụ 22. Nghiên cứu linh trưởng không phải con người trong cơ thể sống
Các công thức LNP, được thể hiện trong Bảng 38 (ở trên), được sử dụng cho các loài linh trưởng không phải người (NHP) (khỉ cynomolgus) (n=2) dưới dạng tiêm nhanh vào tĩnh mạch (IV) trong khoảng 30 giây bằng cách sử dụng kim tiêm dưới da, có thể là gắn vào ống tiêm/abbocath hoặc bướm nếu cần. NHP được sử dụng một liều mRNA IV cải tiến duy nhất 0,05 mg/kg EPO hoặc G-CSF hoặc 0,005 mg/kg EPO với thể tích liều 0,5 mL/kg. NHP được lấy máu 5-6 ngày trước khi dùng công thức mRNA LNP đã được sửa đổi để xác định biểu hiện protein trong huyết thanh và công thức máu toàn phần cơ bản. Sau khi sử dụng công thức mRNA đã biến đổi, NHP được tách máu vào lúc 8, 24, 48 và 72 giờ để xác định biểu hiện protein. Vào lúc 24 và 72 giờ sau khi dùng, công thức máu toàn phần của NHP cũng được xác định. Biểu hiện protein của G-CSF và EPO được xác định bằng ELISA. Nước tiểu từ NHP được thu thập trong toàn bộ thí nghiệm và được phân tích để đánh giá độ an toàn lâm sàng. Các mẫu được thu thập từ NHP sau khi chúng được sử dụng công thức mRNA đã được sửa đổi G-CSF hoặc EPO để xác định biểu hiện protein bằng ELISA. Hóa học lâm sàng, huyết học, phân tích nước tiểu và cytokine của các loài linh trưởng không phải con người cũng được phân tích.
Như được thể hiện trong Bảng 42, sự biểu hiện protein EPO trong NHP được sử dụng 0,05 mg/kg có thể được phát hiện trong vòng 72 giờ và liều lượng 0,005 mg/kg của công thức EPO có thể được phát hiện trong vòng 48 giờ. Trong Bảng 42, “<” có nghĩa là nhỏ hơn một giá trị nhất định. Sự biểu hiện protein G-CSF được thấy rõ đến 24 giờ sau khi dùng với công thức mARN biến đổi. Sơ bộ, có sự gia tăng nồng độ bạch cầu hạt và hồng cầu lưới trong NHP sau khi sử dụng công thức mARN biến đổi.
Ví dụ 23. Nghiên cứu in vivo về loài linh trưởng không phải người để tìm G-CSF và EPO
Các chế phẩm LNP, được thể hiện trong Bảng 38 (ở trên), được sử dụng cho các loài linh trưởng không phải người (NHP) (khỉ cynomolgus) (n=2) dưới dạng tiêm vào tĩnh mạch (IV). NHP được sử dụng một liều mRNA IV cải tiến duy nhất 0,5 mg/kg, 0,05 mg/kg hoặc 0,005 mg/kg G-CSF hoặc EPO với thể tích liều 0,5 mL/kg. NHP được lọc máu trước khi dùng công thức mRNA LNP đã được sửa đổi để xác định biểu hiện protein trong huyết thanh và công thức máu toàn phần cơ bản. Sau khi sử dụng công thức mRNA biến đổi G-CSF, NHP được tách máu vào lúc 8, 24, 48 và 72 giờ để xác định biểu hiện protein. Sau khi sử dụng công thức mRNA đã được sửa đổi EPO, NP được tách ra vào lúc 8, 24, 48, 72 giờ và 7 ngày để xác định biểu hiện protein.
Các mẫu được thu thập từ NHP sau khi chúng được sử dụng với công thức mRNA biến đổi G-CSF hoặc EPO đã được phân tích bằng ELISA để xác định biểu hiện protein. Số lượng bạch cầu trung tính và hồng cầu lưới cũng được xác định trước liều, 24 giờ, 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày và 18 ngày sau khi dùng công thức G-CSF hoặc EPO đã sửa đổi.
Như được thể hiện trong Bảng 43, sự biểu hiện protein G-CSF không được phát hiện sau 72 giờ. Trong Bảng 43, “<39” dùng để chỉ giá trị dưới giới hạn phát hiện dưới là 39 μg/ml.
Như được thể hiện trong Bảng 44, biểu hiện protein EPO không được phát hiện quá 7 ngày. Trong Bảng 44, “<7,8” dùng để chỉ giá trị dưới giới hạn phát hiện dưới là 7,8 μg/ml.
Như được trình bày trong Bảng 45, có sự gia tăng số lượng bạch cầu trung tính ở tất cả các nhóm G-CSF so với mức trước khi dùng liều.
Như được trình bày trong Bảng 46, có sự gia tăng số lượng hồng cầu lưới ở tất cả các nhóm EPO từ 3 ngày đến 14/18 ngày sau khi dùng thuốc so với mức hồng cầu lưới 24 giờ sau khi dùng thuốc.
Như được trình bày trong Bảng 47-49, việc sử dụng RNA biến đổi EPO có ảnh hưởng đến các thông số tạo hồng cầu khác bao gồm huyết sắc tố (HGB), hematocrit (HCT) và số lượng hồng cầu (RBC).
Như được trình bày trong Bảng 50 và 51, việc sử dụng RNA biến đổi có ảnh hưởng đến các thông số hóa học trong huyết thanh bao gồm alanine transaminase (ALT) và aspartate transaminase
Như được trình bày trong Bảng 52, việc sử dụng RNA biến đổi có công thức hạt nano lipid ở liều cao (0,5 mg/kg) đã gây ra sự gia tăng các cytokine, interferon-alpha (IFN-alpha) sau khi sử dụng mRNA biến đổi.
Ví dụ 24. Nghiên cứu về tiêm bắp và/hoặc tiêm dưới da ở động vật linh trưởng không phải người
Các chế phẩm chứa mARN EPO đã biến đổi (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) hoặc G-CSF mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và pseudouridine) trong nước muối được sử dụng cho các loài linh trưởng không phải người (khỉ Cynomolgus) (NHP) tiêm bắp (IM) hoặc tiêm dưới da (SC). Liều mRNA biến đổi duy nhất 0,05 mg/kg hoặc 0,005 mg/kg ở thể tích liều 0,5 mL/kg. Các loài linh trưởng không phải người được lấy máu 5-6 ngày trước khi dùng thuốc để xác định nồng độ protein huyết thanh và công thức máu toàn phần cơ bản. Sau khi sử dụng công thức mRNA đã biến đổi, NHP được tách máu vào lúc 8 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 7 ngày và 14 ngày để xác định biểu hiện protein. Biểu hiện protein của G-CSF và EPO được xác định bằng ELISA. Vào lúc 24 giờ, 72 giờ, 7 ngày và 14 ngày sau khi dùng thuốc, công thức máu toàn phần của NHP cũng được xác định. Nước tiểu từ NHP được thu thập trong toàn bộ thí nghiệm và được phân tích để đánh giá độ an toàn lâm sàng. Mô gần vị trí tiêm cũng được thu thập và phân tích để xác định biểu hiện protein.
Ví dụ 25. Buôn bán mRNA đã sửa đổi
Để xác định sự định vị và/hoặc buôn bán mARN biến đổi, các nghiên cứu có thể được thực hiện như sau.
Các công thức LNP của siRNA và mARN biến đổi được bào chế theo các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc được mô tả ở đây. Các chế phẩm LNP có thể bao gồm ít nhất một mARN biến đổi mà có thể mã hóa protein như G-CSF, EPO, Yếu tố VII, và/hoặc protein bất kỳ được mô tả ở đây. Các chế phẩm này có thể được sử dụng cục bộ vào cơ của động vật có vú bằng cách tiêm trong cơ hoặc dưới da. Liều lượng của mRNA biến đổi và kích thước của LNP có thể thay đổi để xác định tác động lên việc buôn bán trong cơ thể động vật có vú và/hoặc để đánh giá tác động lên phản ứng sinh học, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở tình trạng viêm. Động vật có vú có thể bị chảy máu ở các thời điểm khác nhau để xác định sự biểu hiện của protein được mã hóa bởi mARN biến đổi được sử dụng có trong huyết thanh và/hoặc để xác định tổng lượng máu ở động vật có vú.
Ví dụ, yếu tố VII mã hóa mARN cải biến, biểu hiện ở gan và tiết vào huyết thanh, có thể được sử dụng trong cơ và/hoặc tiêm dưới da. Trùng hợp hoặc trước khi sử dụng mRNA được sửa đổi, siRNA được sử dụng để loại bỏ Yếu tố VII nội sinh. Yếu tố VII phát sinh từ việc tiêm bắp và/hoặc tiêm dưới da mRNA biến đổi được sử dụng sẽ được đo trong máu. Ngoài ra, nồng độ Yếu tố VII được đo trong các mô gần vị trí tiêm. Nếu Yếu tố VII được biểu hiện trong máu thì có sự buôn bán mRNA đã được sửa đổi. Nếu Yếu tố VII được biểu hiện ở mô chứ không phải trong máu thì chỉ có biểu hiện cục bộ của Yếu tố VII.
Ví dụ 26. Công thức của nhiều mARN biến đổi
Các chế phẩm LNP của mARN biến đổi được bào chế theo các phương pháp đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này và/hoặc được mô tả ở đây hoặc đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này. Các công thức LNP có thể bao gồm ít nhất một mARN biến đổi mà có thể mã hóa protein như G-CSF, EPO, Thrombopoietin và/hoặc protein bất kỳ được mô tả ở đây. Ít nhất một mARN biến đổi có thể bao gồm 1, 2, 3, 4 hoặc 5 phân tử mARN biến đổi. Các chế phẩm chứa ít nhất một mARN biến đổi có thể được sử dụng trong tĩnh mạch, tiêm bắp hoặc tiêm dưới da theo một phác đồ dùng một hoặc nhiều liều. Các mẫu sinh học như, nhưng không giới hạn ở, máu và/hoặc huyết thanh có thể được thu thập và phân tích tại các thời điểm khác nhau trước và/hoặc sau khi sử dụng ít nhất một công thức mARN biến đổi. Sự biểu hiện của protein trong mẫu sinh học ở mức 50-200 pg/ml sau khi động vật có vú được sử dụng chế phẩm chứa ít nhất một mã hóa mARN biến đổi cho biết protein sẽ được coi là có hiệu quả về mặt sinh học.
Ví dụ 27. Nghiên cứu tỷ lệ Polyethylene Glycol
A. Công thức và đặc tính của PEG LNP
Các hạt nano lipid (LNP) được chế tạo bằng phương pháp bơm ống tiêm. Các LNP được tạo ra ở tỷ lệ trọng lượng 20:1 của lipid tổng số và mARN G-CSF biến đổi (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine). Phạm vi tỷ lệ mol của các công thức được thể hiện trong Bảng 53.
Hai loại lipid PEG, 1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene Glycol (PEG-DMG, NOF Cat #SUNBRIGHT® GM-020) và 1,2-Distearoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene Glycol (PEG-DSG, NOF Cat #SUNBRIGHT® GS-020), đã được thử nghiệm ở mức 1,5 hoặc 3,0 mol %. Sau khi hình thành các LNP và đóng gói G-CSF mARN biến đổi, các công thức LNP được đặc trưng bởi kích thước hạt, thế zeta và phần trăm đóng gói và kết quả được thể hiện trong Bảng 54.
B. Sàng lọc PEG LNP trên Vivo
Các chế phẩm chứa PEG LNP được mô tả trong Bảng 55 được tiêm vào tĩnh mạch cho chuột (n=5) với liều 0,5 mg/kg. Huyết thanh được thu thập từ chuột vào lúc 2 giờ, 8 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 8 ngày sau khi dùng công thức. Huyết thanh được phân tích bằng ELISA để xác định sự biểu hiện protein của G-CSF và mức biểu hiện được thể hiện trong Bảng 55. Công thức LNP sử dụng PEG-DMG cho mức độ biểu hiện protein cao hơn đáng kể so với công thức LNP có PEG-DSA.
Ví dụ 28. Nghiên cứu công thức hóa chất cation lipid
A. Công thức và đặc tính của hạt nano lipid cation
Các hạt nano lipid (LNP) được chế tạo bằng phương pháp bơm ống tiêm. Các LNP được tạo thành theo tỷ lệ trọng lượng 20:1 của tổng lipid so với mRNA biến đổi. Phạm vi tỷ lệ mol lipid cuối cùng của lipid cation, DSPC, cholesterol và PEG-c-DOMG được nêu trong Bảng 56.
Dung dịch lipid 25 mM trong ethanol và RNA biến tính trong 50 mM citrate ở độ pH bằng 3 được trộn lẫn để tạo ra sự hình thành mụn nước tự phát. Các túi được ổn định trong ethanol trước khi loại bỏ ethanol và có sự trao đổi chất đệm bằng quá trình lọc máu. Các LNP sau đó được đặc trưng bởi kích thước hạt, thế zeta và tỷ lệ đóng gói. Bảng 57 mô tả đặc tính của các LNP bao bọc mRNA đã biến đổi EPO (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910 đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) hoặc G- MRNA được biến đổi CSF (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) sử dụng DLin-MC3-DMA, DLin-DMA hoặc C12-200 là lipid cation.
B. Sàng lọc các công thức LNP cation trong Vivo
Các chế phẩm chứa công thức lipid cation được mô tả trong Bảng 57 được tiêm vào tĩnh mạch cho chuột (n=5) với liều 0,5 mg/kg. Huyết thanh được thu thập từ chuột vào lúc 2 giờ, 24 giờ, 72 giờ và/hoặc 7 ngày sau khi dùng công thức. Huyết thanh được phân tích bằng ELISA để xác định sự biểu hiện protein của EPO hoặc G-CSF và mức độ biểu hiện được thể hiện trong Bảng 58.
Độc tính đã được nhìn thấy ở những con chuột được sử dụng công thức LNP với lipid cation C12-200 (NPA-075-1 và NPA-076-1) và chúng đã bị tiêu diệt sau 24 giờ vì chúng có các triệu chứng như lông xù, hành vi thu mình lại và cân nặng. lỗ trên 10%. C12-200 được cho là độc hại hơn nhưng cũng có mức độ biểu hiện cao trong thời gian ngắn. Lipid cation DLin-DMA (NPA-073-1 và NPA-074-1) có biểu hiện thấp nhất trong số ba loại lipit cation được thử nghiệm. DLin-MC3-DMA (NPA-071-1 và NPA-072-1) thể hiện biểu hiện tốt cho đến ngày thứ ba và cao hơn mẫu nền cho đến ngày thứ 7 đối với các công thức EPO.
Ví dụ 29. Phương pháp sàng lọc biểu hiện protein
A. Ion hóa phun điện
Một mẫu sinh học có thể chứa các protein được mã hóa bằng RNA biến đổi được sử dụng cho đối tượng được chuẩn bị và phân tích theo quy trình ion hóa phun điện tử (ESI) của nhà sản xuất bằng cách sử dụng 1, 2, 3 hoặc 4 máy phân tích khối lượng. Mẫu sinh học cũng có thể được phân tích bằng hệ thống khối phổ ESI song song.
Mẫu của các đoạn protein hoặc toàn bộ protein được so sánh với các mẫu đối chứng đã biết đối với một loại protein nhất định và việc nhận dạng được xác định bằng cách so sánh.
B. Giải hấp/ion hóa bằng laser được hỗ trợ bằng ma trận
Một mẫu sinh học có thể chứa các protein được mã hóa bằng RNA biến đổi được sử dụng cho đối tượng sẽ được chuẩn bị và phân tích theo quy trình của nhà sản xuất đối với quá trình giải hấp/ion hóa bằng laser được hỗ trợ bằng ma trận (MALDI).
Mẫu của các đoạn protein hoặc toàn bộ protein được so sánh với các mẫu đối chứng đã biết đối với một loại protein nhất định và việc nhận dạng được xác định bằng cách so sánh.
C. Sắc ký lỏng-Khối phổ-Khối phổ
Một mẫu sinh học có thể chứa các protein được mã hóa bởi RNA biến đổi, có thể được xử lý bằng enzyme trypsin để tiêu hóa các protein có trong đó. Các peptit thu được được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng-khối phổ-khối phổ (LC/MS/MS). Các peptide được phân mảnh trong máy quang phổ khối để tạo ra các mẫu chẩn đoán có thể khớp với cơ sở dữ liệu trình tự protein thông qua thuật toán máy tính. Mẫu đã phân hủy có thể được pha loãng để đạt được 1 ng hoặc ít hơn nguyên liệu ban đầu đối với một loại protein nhất định. Các mẫu sinh học chứa nền đệm đơn giản (ví dụ: nước hoặc muối dễ bay hơi) có thể được phân hủy trực tiếp trong dung dịch; các nền phức tạp hơn (ví dụ: chất tẩy rửa, muối không bay hơi, glycerol) yêu cầu bước làm sạch bổ sung để tạo thuận lợi cho việc phân tích mẫu.
Mẫu của các đoạn protein hoặc toàn bộ protein được so sánh với các mẫu đối chứng đã biết đối với một loại protein nhất định và việc nhận dạng được xác định bằng cách so sánh.
Ví dụ 30. Hạt nano lipid trong nghiên cứu Vivo
mCherry mARN (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31915; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được tạo ra dưới dạng hạt nano lipid (LNP) bằng cách sử dụng phương pháp bơm kim tiêm. LNP được tạo thành theo tỷ lệ trọng lượng 20:1 của tổng lipid và mRNA biến đổi với tỷ lệ mol lipid cuối cùng là 50:10:38,5:1,5 (DLin-KC2-DMA: DSPC: Cholesterol: PEG-c-DOMG). Công thức mCherry, được liệt kê trong Bảng 59, được đặc trưng bởi kích thước hạt, thế zeta và khả năng đóng gói.
Công thức LNP được tiêm tĩnh mạch cho chuột (n=5) với liều mRNA đã được sửa đổi là 100 ug. Chuột đã hy sinh vào 24 giờ sau khi dùng thuốc. Gan và lá lách của những con chuột được sử dụng công thức mRNA biến đổi mCherry được phân tích bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC), Western blot hoặc phân loại tế bào được kích hoạt bằng huỳnh quang (FACS).
Mô học của gan cho thấy biểu hiện mCherry đồng đều trong suốt phần cắt, trong khi động vật không được điều trị không biểu hiện mCherry. Western blots cũng được sử dụng để xác nhận biểu hiện mCherry ở động vật được điều trị, trong khi mCherry không được phát hiện ở động vật không được điều trị. Tubulin được sử dụng làm chất đánh dấu đối chứng và được phát hiện ở cả chuột được điều trị và không được điều trị, cho thấy biểu hiện protein bình thường trong tế bào gan không bị ảnh hưởng.
FACS và IHC cũng được thực hiện trên lá lách của mCherry và những con chuột không được điều trị. Tất cả các quần thể tế bào bạch cầu đều âm tính với biểu hiện mCherry bằng phân tích FACS. Theo IHC, cũng không có sự khác biệt có thể quan sát được về lá lách ở lá lách giữa những con chuột được điều trị bằng mCherry và những con chuột không được điều trị bằng mCherry.
Ví dụ 31. Bơm tiêm trong nghiên cứu Vivo
MRNA đã biến đổi mCherry (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1) được tạo ra dưới dạng hạt nano lipid (LNP) bằng phương pháp bơm ống tiêm. LNP được bào chế theo tỷ lệ trọng lượng 20:1 của tổng lipid và mRNA biến đổi với tỷ lệ mol lipid cuối cùng là 50:10:38,5:1,5 (DLin-KC2-DMA: DSPC: Cholesterol: PEG-c-DOMG). Công thức mCherry được đặc trưng bởi kích thước hạt, thế zeta và khả năng đóng gói.
Công thức LNP được tiêm tĩnh mạch cho chuột (n=5) với liều mRNA đã được sửa đổi là 10 hoặc 100 ug. Chuột chết vào 24 giờ sau khi dùng thuốc. Gan và lá lách của những con chuột được sử dụng công thức mRNA biến đổi mCherry được phân tích bằng hóa mô miễn dịch (IHC), Western blot và/hoặc phân loại tế bào được kích hoạt bằng huỳnh quang (FACS).
Ví dụ 32. Biểu hiện In vitro và In Vivo
A. Biểu hiện in vitro ở tế bào người bằng công thức lipidoid
Tỷ lệ mmRNA so với lipidoid được sử dụng để kiểm tra sự biến đổi trong ống nghiệm được kiểm tra thực nghiệm ở các tỷ lệ lipidoid:mmRNA khác nhau. Công việc trước đây sử dụng siRNA và lipidoid đã sử dụng tỷ lệ 2,5:1, 5:1, 10:1 và 15:1 lipidoid:siRNA wt:wt. Do chiều dài của mmRNA dài hơn so với siRNA, tỷ lệ trọng lượng: trọng lượng của lipidoid so với mmRNA thấp hơn có thể có hiệu quả. Ngoài ra, để so sánh, mmRNA cũng được tạo ra bằng cách sử dụng phương tiện vận chuyển lipid cation RNAIMAX™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) hoặc TRANSIT-mRNA (Mirus Bio, Madison, WI).
Khả năng của Luciferase được tạo ra từ lipidoid (trình tự IVT cDNA như được thể hiện trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi chất thay thế cytosine và pseudouridine ở mỗi vị trí uridine), protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP) (trình tự IVT cDNA như được thể hiện trong SEQ ID NO: 31918; trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31919, đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine tại mỗi vị trí uridine), G-CSF mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) và EPO mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) để biểu hiện sản phẩm protein mong muốn có thể được xác nhận bằng phương pháp phát quang để phát hiện biểu hiện luciferase, đo tế bào theo dòng chảy để phát hiện biểu hiện GFP và bằng ELISA để phát hiện sự bài tiết G-CSF và Erythropoietin (EPO).
B. Biểu hiện ở cơ thể sống sau khi tiêm tĩnh mạch
Việc sử dụng các chế phẩm theo đường tĩnh mạch toàn thân được tạo ra bằng cách sử dụng nhiều loại lipid khác nhau, bao gồm nhưng không giới hạn ở 98N12-5, C12-200 và MD1.
Các công thức lipid chứa mmRNA được tiêm tĩnh mạch vào động vật. Sự biểu hiện của protein mã hóa mRNA (mmRNA) biến đổi được đánh giá trong các mẫu máu và/hoặc các cơ quan khác, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, gan và lá lách được thu thập từ động vật. Tiến hành các nghiên cứu tiêm tĩnh mạch liều đơn cũng sẽ cho phép đánh giá mức độ, khả năng đáp ứng liều lượng và thời gian biểu hiện của sản phẩm mong muốn.
Theo một phương án, chế phẩm dựa trên lipidoid 98N12-5, C12-200, MD1 và lipidoid khác, được sử dụng để phân phối luciferaza, protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP), protein huỳnh quang mCherry, phosphataza kiềm được tiết ra (sAP), G-CSF của người, Yếu tố IX của con người, hoặc mmRNA Erythropoietin (EPO) của con người vào động vật. Sau khi tạo công thức mmRNA với lipid, như đã mô tả trước đây, động vật được chia thành các nhóm để nhận công thức nước muối hoặc công thức lipidoid chứa một trong các mmRNA khác nhau được chọn từ luciferase, GFP, mCherry, sAP, G-CSF của người, Yếu tố con người IX và EPO của con người. Trước khi tiêm vào động vật, các công thức lipidoid chứa mmRNA được pha loãng trong PBS. Sau đó, động vật được sử dụng một liều duy nhất mmRNA có công thức từ liều 10 mg/kg đến liều thấp tới 1 ng/kg, với phạm vi ưu tiên là 10 mg/kg đến 100 ng/kg, trong đó liều mmRNA phụ thuộc vào trọng lượng cơ thể động vật, chẳng hạn như một con chuột nặng 20 gram nhận được công thức tối đa là 0,2 ml (liều lượng không dựa trên mmRNA trên mỗi kg trọng lượng cơ thể). Sau khi sử dụng công thức mmRNA-lipidoid, huyết thanh, mô và/hoặc dịch ly giải mô sẽ thu được và mức sản phẩm được mã hóa mmRNA được xác định tại một khoảng thời gian duy nhất và/hoặc một khoảng thời gian. Khả năng của Luciferase, GFP, mCherry, sAP, G-CSF, Factor IX và EPO mmRNA có công thức lipidoid để biểu hiện sản phẩm protein mong muốn được xác nhận bằng phương pháp phát quang để biểu hiện Luciferase, phương pháp đo tế bào dòng chảy để biểu hiện GFP và biểu hiện mCherry , bằng hoạt tính enzyme đối với sAP hoặc bằng ELISA đối với phần G-CSF, Yếu tố IX và/hoặc EPO.
Các nghiên cứu sâu hơn về chế độ điều trị đa liều cũng được thực hiện để xác định mức biểu hiện tối đa của mmRNA, để đánh giá độ bão hòa của biểu hiện do mmRNA điều khiển (bằng cách đưa ra công thức mmRNA đối chứng và hoạt động song song hoặc theo trình tự) và để xác định tính khả thi. sử dụng thuốc lặp lại (bằng cách cung cấp mmRNA theo liều cách nhau hàng tuần hoặc hàng tháng và sau đó xác định xem mức độ biểu hiện có bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như khả năng miễn dịch hay không). Việc đánh giá chức năng sinh lý của các protein như G-CSF và EPO cũng được xác định thông qua việc phân tích các mẫu từ động vật được thử nghiệm và phát hiện sự gia tăng số lượng bạch cầu hạt và hồng cầu tương ứng. Hoạt tính của sản phẩm protein được biểu hiện như Yếu tố IX, ở động vật cũng có thể được đánh giá thông qua phân tích hoạt tính enzym của Yếu tố IX (chẳng hạn như xét nghiệm thời gian Thromboplastin từng phần được hoạt hóa) và ảnh hưởng của thời gian đông máu.
C. Biểu hiện in vitro sau khi tiêm bắp và/hoặc tiêm dưới da
Việc sử dụng các công thức lipidoid để cung cấp oligonucleotide, bao gồm mRNA, qua đường tiêm bắp hoặc đường tiêm dưới da cần phải được đánh giá vì điều này chưa được báo cáo trước đây. Việc tiêm mmRNA trong cơ và/hoặc dưới da được đánh giá để xác định xem liệu công thức lipidoid chứa mmRNA có khả năng tạo ra cả biểu hiện cục bộ và toàn thân của phần mong muốn hay không.
Công thức lipid 98N12-5, C12-200 và MD1 chứa mmRNA được chọn từ luciferase, protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP), protein huỳnh quang mCherry, phosphatase kiềm được tiết ra (sAP), G-CSF của con người, yếu tố IX của con người hoặc Erythropoietin của con người ( EPO) mmRNA được tiêm bắp và/hoặc tiêm dưới da vào động vật. Sự biểu hiện của protein mã hóa mmRNA được đánh giá cả trong cơ hoặc mô dưới da và một cách có hệ thống trong máu và các cơ quan khác như gan và lá lách. Các nghiên cứu liều đơn cho phép đánh giá mức độ, khả năng đáp ứng liều và thời gian biểu hiện của sản phẩm mong muốn.
Động vật được chia thành các nhóm để nhận công thức nước muối hoặc công thức chứa mARN biến đổi. Trước khi tiêm, các công thức lipidoid chứa mmRNA được pha loãng trong PBS. Động vật được tiêm bắp một liều duy nhất của mmRNA có công thức nằm trong khoảng từ 50 mg/kg đến các liều thấp tới 1 ng/kg với khoảng liều ưu tiên là 10 mg/kg đến 100 ng/kg. Liều tối đa để tiêm bắp đối với chuột là khoảng 1 mg mmRNA hoặc thấp tới 0,02 ng mmRNA khi tiêm bắp vào chi sau của chuột. Để tiêm dưới da, động vật được tiêm một liều tiêm dưới da duy nhất của mmRNA được bào chế trong khoảng từ 400 mg/kg đến các liều thấp tới 1 ng/kg với phạm vi ưu tiên là từ 80 mg/kg đến 100 ng/kg. Liều tối đa khi tiêm dưới da đối với chuột là khoảng 8 mg mmRNA hoặc thấp tới 0,02 ng mmRNA.
Đối với chuột nặng 20 gram, thể tích của một lần tiêm bắp tối đa là 0,025 ml và một lần tiêm dưới da tối đa là 0,2 ml. Liều mmRNA tối ưu được sử dụng được tính từ trọng lượng cơ thể của động vật. Tại các thời điểm khác nhau sau khi sử dụng mmRNA-lipidoid, người ta thu được dịch ly giải huyết thanh, mô và mô và mức độ của sản phẩm được mã hóa mmRNA được xác định. Khả năng của luciferase được tạo thành từ lipidoid, protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP), protein huỳnh quang mCherry, phosphatase kiềm được tiết ra (sAP), G-CSF của con người, yếu tố IX của con người hoặc mmRNA Erythropoietin (EPO) của con người để biểu hiện sản phẩm protein mong muốn đã được xác nhận bằng phương pháp phát quang để biểu hiện luciferase, đo tế bào theo dòng chảy để biểu hiện GFP và mCherry, bằng hoạt động enzyme đối với sAP và bằng ELISA để phát hiện sự bài tiết G-CSF, Yếu tố IX và Erythropoietin (EPO).
Các nghiên cứu bổ sung cho phác đồ đa liều cũng được thực hiện để xác định biểu hiện tối đa sử dụng mmRNA, để đánh giá độ bão hòa của biểu hiện do mmRNA điều khiển (đạt được bằng cách đưa ra công thức mmRNA đối chứng và hoạt động song song hoặc theo trình tự) và để xác định tính khả thi của việc sử dụng thuốc lặp lại (bằng cách cung cấp mmRNA theo liều cách nhau vài tuần hoặc vài tháng và sau đó xác định xem mức độ biểu hiện có bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như khả năng sinh miễn dịch hay không). Các nghiên cứu sử dụng nhiều vị trí tiêm dưới da hoặc tiêm bắp tại một thời điểm cũng được sử dụng để tăng thêm mức tiếp xúc với thuốc mmRNA và cải thiện quá trình sản xuất protein. Việc đánh giá chức năng sinh lý của các protein, chẳng hạn như GFP, mCherry, sAP, G-CSF ở người, yếu tố IX của con người và EPO của con người, được xác định thông qua việc phân tích các mẫu từ động vật được thử nghiệm và phát hiện sự thay đổi trong bạch cầu hạt và/hoặc hồng cầu số lượng tế bào. Hoạt tính của sản phẩm protein được biểu hiện như Yếu tố IX, ở động vật cũng có thể được đánh giá thông qua phân tích hoạt tính enzym của Yếu tố IX (chẳng hạn như xét nghiệm thời gian Thromboplastin từng phần được hoạt hóa) và ảnh hưởng của thời gian đông máu.
Ví dụ 33. MmRNA nhị chức năng
Bằng cách sử dụng các hướng dẫn và phương pháp tổng hợp được mô tả ở đây, các ARN biến đổi được thiết kế và tổng hợp thành hai chức năng, nhờ đó mã hóa một hoặc nhiều phân tử protein gây độc tế bào cũng như được tổng hợp bằng cách sử dụng nucleoside gây độc tế bào.
Việc quản lý các mRNA biến đổi chức năng được thực hiện bằng cách sử dụng nước muối hoặc chất mang lipid. Sau khi được sử dụng, mRNA biến đổi hai chức năng sẽ được dịch mã để tạo ra peptit gây độc tế bào được mã hóa. Khi phân hủy mARN biến đổi được phân phối, các nucleoside gây độc tế bào được giải phóng cũng mang lại lợi ích điều trị cho đối tượng.
Ví dụ 34. Biến đổi mRNA đã được sửa đổi
A. Chuyển số ngược
Đối với các thí nghiệm được thực hiện trên đĩa nuôi cấy mô được phủ collagen 24 giếng, Keratinocytes được gieo hạt với mật độ tế bào là 1×105. Đối với các thí nghiệm được thực hiện trên đĩa nuôi cấy mô phủ collagen 96 giếng, Keratinocytes được gieo hạt ở mật độ tế bào 0,5 × 105. Đối với mỗi mRNA đã sửa đổi (mmRNA) được chuyển nhiễm, mRNA đã sửa đổi: RNAIMAX™ được chuẩn bị như mô tả và trộn với các tế bào trong đĩa nhiều giếng trong một khoảng thời gian, ví dụ: 6 giờ, kể từ khi tế bào được gieo mầm trước khi các tế bào bám vào đĩa nuôi cấy mô.
B. Chuyển tiếp
Trong đĩa nuôi cấy mô phủ collagen 24 giếng, Keratinocytes được gieo hạt với mật độ tế bào 0,7 × 105. Đối với các thí nghiệm được thực hiện trên đĩa nuôi cấy mô phủ collagen 96 giếng, Keratinocytes được gieo hạt ở mật độ tế bào 0,3 × 105. Keratinocytes được phát triển đến mức hợp lưu> 70% trong hơn 24 giờ. Để mỗi mRNA biến đổi (mmRNA) được chuyển nhiễm, mRNA biến đổi: RNAIMAX™ được điều chế như mô tả và chuyển vào các tế bào trong đĩa nhiều giếng trong vòng 24 giờ sau khi gieo mầm tế bào và bám vào đĩa nuôi cấy mô.
C. Màn hình dịch mRNA đã sửa đổi: ELISA G-CSF
Keratinocytes được phát triển trong môi trường EPILIFE với chất bổ sung S7 từ Invitrogen (Carlsbad, CA) với tỷ lệ hợp lưu >70%. Một bộ tế bào sừng được chuyển nhiễm ngược với 300 ng mRNA đã biến đổi hóa học (mmRNA) được tạo phức với RNAIMAX™ từ Invitrogen. Một nhóm tế bào keratinocytes khác được chuyển tiếp với mRNA biến đổi 300 ng được tạo phức với RNAIMAX™ từ Invitrogen. Phức hợp mRNA: RNAIMAX™ cải tiến được hình thành bằng cách ủ RNA trước tiên với môi trường EPILIFE® không bổ sung ở độ pha loãng thể tích 5× trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Trong lọ thứ hai, thuốc thử RNAIMAX™ được ủ với EPILIFE® Media không bổ sung ở độ pha loãng thể tích 10× trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, lọ RNA được trộn với lọ RNAIMAX™ và ủ trong 20-30 phút ở nhiệt độ phòng trước khi thêm từng giọt vào tế bào. Nồng độ Yếu tố kích thích cụm bạch cầu hạt (G-CSF) được tiết ra ở người trong môi trường nuôi cấy được đo ở thời điểm 18 giờ sau khi truyền nhiễm đối với mỗi mRNA đã biến đổi về mặt hóa học trong ba lần.
Sự tiết G-CSF ở người từ các tế bào keratinocytes ở người được truyền máu được định lượng bằng cách sử dụng bộ ELISA từ Invitrogen hoặc Hệ thống R&D (Minneapolis, MN) theo hướng dẫn khuyến nghị của nhà sản xuất.
D. Liều lượng và thời gian của mRNA đã được sửa đổi: ELISA G-CSF
Keratinocytes được phát triển trong môi trường EPILIFE® với chất bổ sung S7 từ Invitrogen với nồng độ >70%. Tế bào sừng được chuyển nhiễm ngược với 0 ng, 46,875 ng, 93,75 ng, 187,5 ng, 375 ng, 750 ng hoặc 1500 ng mRNA biến đổi được tạo phức với RNAIMAX™ từ Invitrogen (Carlsbad, CA). Phức hợp mRNA:RNAIMAX™ biến đổi được hình thành như mô tả. Nồng độ G-CSF do con người tiết ra trong môi trường nuôi cấy được đo ở thời điểm 0, 6, 12, 24 và 48 giờ sau khi truyền cho mỗi nồng độ của từng mRNA biến đổi trong ba lần. Sự tiết G-CSF ở người từ các tế bào keratinocytes ở người được truyền nhiễm được định lượng bằng cách sử dụng bộ ELISA từ Invitrogen hoặc Hệ thống R&D theo hướng dẫn khuyến nghị của nhà sản xuất.
Ví dụ 35. Nghiên cứu chia liều
Các nghiên cứu sử dụng nhiều vị trí tiêm dưới da hoặc tiêm bắp tại một thời điểm đã được thiết kế và thực hiện để nghiên cứu các cách tăng phơi nhiễm thuốc mmRNA và cải thiện sản xuất protein. Ngoài việc phát hiện sản phẩm protein biểu hiện, việc đánh giá chức năng sinh lý của protein cũng được xác định thông qua việc phân tích các mẫu từ động vật được thử nghiệm.
Điều đáng ngạc nhiên là người ta đã xác định được rằng việc phân chia liều mmRNA tạo ra sản lượng protein và phản ứng kiểu hình lớn hơn so với những phản ứng được tạo ra bởi các chế độ dùng một đơn vị hoặc đa liều.
Thiết kế của thử nghiệm đơn liều, đa liều và chia liều liên quan đến việc sử dụng mmRNA erythropoietin (EPO) của người (mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) chỉ dùng trong đệm. Phương tiện định lượng (F. đệm) bao gồm 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2), 2 mM Na+-phosphate (natri photphat đơn 1,4 mM; natri photphat hai bazơ 0,6 mM) và EDTA 0,5 mM, pH 6,5. Độ pH được điều chỉnh bằng natri hydroxit và dung dịch cuối cùng được lọc khử trùng. MmRNA đã được sửa đổi với 5meC ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine tại mỗi vị trí uridine.
Động vật (n=5) được tiêm IM (tiêm bắp) với liều đơn vị 100 ug. Để dùng đa liều, hai phác đồ được sử dụng, 3 liều 100 ug và 6 liều 100 ug. Đối với sơ đồ chia liều, hai lịch trình đã được sử dụng, 3 liều ở mức 33,3 ug và 6 liều ở mức 16,5 ug mmRNA. Kiểm soát liều lượng liên quan đến việc sử dụng đệm chỉ ở mức 6 liều. mmRNA đối chứng liên quan đến việc sử dụng luciferase mmRNA (trình tự IVT cDNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine ở mỗi vị trí uridine) liều 6 lần ở mức 100 ug. Máu và mô cơ được đánh giá sau 13 giờ tiêm.
Protein EPO ở người được đo trong huyết thanh chuột sau 13 giờ tiêm bắp với liều đơn, đa hoặc chia nhỏ EPO mmRNA trong dung dịch đệm. Bảy nhóm chuột (n=5 con chuột mỗi nhóm) đã được xử lý và đánh giá. Kết quả được thể hiện ở Bảng 60.
Hệ số phân tách được định nghĩa là sản phẩm trên một đơn vị thuốc chia cho sản phẩm liều đơn trên một đơn vị thuốc (PUD). Ví dụ: đối với nhóm điều trị 2, giá trị 0,28 hoặc sản phẩm (EPO) trên một đơn vị thuốc (mmRNA) được chia cho sản phẩm liều đơn trên một đơn vị thuốc là 0,14. Kết quả là 2. Tương tự, đối với nhóm điều trị 4, giá trị 1,1 hoặc sản phẩm (EPO) trên một đơn vị thuốc (mmRNA) được chia cho sản phẩm liều đơn trên một đơn vị thuốc là 0,14. Kết quả là 7,9. Do đó, hệ số phân chia liều (DSF) có thể được sử dụng như một chỉ số về hiệu quả của chế độ chia liều. Đối với bất kỳ liều dùng đơn lẻ nào với tổng liều hàng ngày, DSF phải bằng 1. Do đó, bất kỳ DSF nào lớn hơn giá trị này trong chế độ chia liều là dấu hiệu cho thấy hiệu quả tăng lên.
Để xác định xu hướng đáp ứng liều, tác động của vị trí tiêm và tác động của thời điểm tiêm, các nghiên cứu được thực hiện. Trong những nghiên cứu này, các liều khác nhau 1 ug, 5 ug, 10 ug, 25 ug, 50 ug và các giá trị ở giữa được sử dụng để xác định kết quả đáp ứng liều. Việc chia liều cho tổng liều 100 ug bao gồm ba hoặc sáu liều 1,6 ug, 4,2 ug, 8,3 ug, 16,6 ug hoặc các giá trị và tổng liều bằng với việc sử dụng tổng liều đã chọn.
Vị trí tiêm được chọn từ các chi hoặc bất kỳ bề mặt cơ thể nào có đủ diện tích phù hợp để tiêm. Điều này cũng có thể bao gồm việc lựa chọn độ sâu tiêm để nhắm vào lớp hạ bì (Trong da), lớp biểu bì (Biểu bì), mô dưới da (SC) hoặc cơ (IM). Góc tiêm sẽ thay đổi tùy theo vị trí phân phối được nhắm mục tiêu với các mũi tiêm nhắm vào vị trí trong da là góc 10-15 độ so với mặt phẳng bề mặt da, từ 20-45 độ so với mặt phẳng bề mặt da đối với tiêm dưới da và góc từ 60-90 độ để tiêm đáng kể vào cơ.
Ví dụ 36. Định lượng trong Exosome
Số lượng và vị trí của mmRNA theo sáng chế có thể được xác định bằng cách đo lượng (cơ sở ban đầu, thời gian hoặc dư lượng) trong các exosome phân lập. Trong nghiên cứu này, do mmRNA thường được tối ưu hóa bằng codon và khác biệt theo trình tự với mRNA nội sinh, nên mức mmRNA được định lượng so với mức nội sinh của mRNA loại tự nhiên hoặc hoang dã bằng cách sử dụng các phương pháp Gibbings, PCT/IB2009/005878, toàn bộ nội dung của chúng được đưa vào đây bằng cách viện dẫn.
Trong các nghiên cứu này, phương pháp này được thực hiện trước tiên bằng cách phân lập exosome hoặc túi, tốt nhất là từ dịch cơ thể của bệnh nhân trước đây đã được điều trị bằng polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN theo sáng chế, sau đó đo, trong exosome này, polynucleotit, cấu trúc bậc một hoặc mmARN mức bằng một trong các microarray mARN, qRT-PCR, hoặc phương tiện khác để đo ARN trong lĩnh vực kỹ thuật này bao gồm bằng phương pháp kháng thể hoặc hóa mô miễn dịch thích hợp.
Ví dụ 37. Ảnh hưởng của mRNA biến đổi đến khả năng sống của tế bào, độc tính tế bào và quá trình tự hủy của tế bào
Thí nghiệm này chứng minh khả năng sống sót của tế bào, khả năng gây độc tế bào và quá trình tự hủy của các tế bào Keratinocyte ở người được chuyển hóa mRNA trong ống nghiệm được biến đổi rõ rệt. Keratinocytes được phát triển trong môi trường EPILIFE® có bổ sung tăng trưởng tế bào Keratinocyte ở người khi không có hydrocortisone từ Invitrogen (Carlsbad, CA) với nồng độ >70%. Các tế bào sừng được chuyển nhiễm ngược với 0 ng, 46,875 ng, 93,75 ng, 187,5 ng, 375 ng, 750 ng, 1500 ng, 3000 ng hoặc 6000 ng mRNA biến đổi được tạo phức với RNAIMAX™ từ Invitrogen. Phức hợp mRNA:RNAIMAX™ biến đổi được hình thành. Nồng độ G-CSF do con người tiết ra trong môi trường nuôi cấy được đo ở thời điểm 0, 6, 12, 24 và 48 giờ sau khi truyền cho mỗi nồng độ của từng m RNA biến đổi trong ba lần. Sự tiết G-CSF ở người từ các tế bào keratinocytes ở người được truyền nhiễm được định lượng bằng cách sử dụng bộ ELISA từ Invitrogen hoặc Hệ thống R&D theo hướng dẫn khuyến nghị của nhà sản xuất.
Khả năng sống sót của tế bào, độc tính tế bào và quá trình chết theo chương trình được đo ở 0, 12, 48, 96 và 192 giờ sau khi truyền máu bằng bộ APOTOX-GLO™ của Promega (Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Ví dụ 38. Phát hiện đáp ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào đối với mRNA biến đổi bằng xét nghiệm ELISA
Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) đối với Yếu tố hoại tử khối u ở người-α (TNF-α), Interferon-β (IFN-β) ở người và Yếu tố kích thích cụm bạch cầu hạt ở người (G-CSF) được tiết ra từ con người được truyền nhiễm in vitro Tế bào Keratinocyte được kiểm tra để phát hiện phản ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào. Keratinocytes được phát triển trong môi trường EPILIFE® có bổ sung tăng trưởng tế bào Keratinocyte ở người khi không có hydrocortisone từ Invitrogen (Carlsbad, CA) với nồng độ >70%. Các tế bào keratinocytes TNF-α được tiết ra được chuyển hóa ngược với 0 ng, 93,75 ng, 1 87,5 ng, 375 ng, 750 ng, 1500 ng hoặc 3000 ng của mRNA đã biến đổi hóa học (mmRNA) được tạo phức với RNAIMAX™ từ Invitrogen như được mô tả trong ba bản. TNF-α được tiết ra trong môi trường nuôi cấy được đo sau 24 giờ truyền nhiễm đối với từng mRNA đã được biến đổi về mặt hóa học bằng cách sử dụng bộ ELISA của Invitrogen theo quy trình của nhà sản xuất.
IFN-β được tiết ra trong cùng môi trường nuôi cấy được đo sau 24 giờ truyền nhiễm đối với từng mRNA đã được biến đổi về mặt hóa học bằng cách sử dụng bộ ELISA của Invitrogen theo quy trình của nhà sản xuất. Nồng độ G-CSF được tiết ra ở người trong cùng môi trường nuôi cấy được đo sau 24 giờ sau khi truyền đối với từng mRNA đã biến đổi về mặt hóa học. Sự tiết G-CSF của con người từ các tế bào keratinocytes của con người được truyền máu được định lượng bằng cách sử dụng bộ ELISA từ Invitrogen hoặc Hệ thống R&D (Minneapolis, MN) theo hướng dẫn khuyến nghị của nhà sản xuất. Những dữ liệu này chỉ ra mARN biến đổi (mmRNA) nào có khả năng gây ra phản ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào bị suy giảm so với các polynucleotit tự nhiên và biến đổi hóa học khác hoặc các hợp chất tham chiếu bằng cách đo các cytokine typ 1 được lấy làm ví dụ TNF-α và IFN-β.
Ví dụ 39. Xét nghiệm tăng sinh tế bào do mRNA gây ra bởi yếu tố kích thích bạch cầu hạt ở người (G-CSF)
Tế bào keratinocytes ở người được nuôi cấy trong môi trường EPILIFE® có bổ sung S7 từ Invitrogen với nồng độ >70% trong đĩa nuôi cấy mô đồng thời TRANSWELL® (Coming, Lowell, MA) 24 giếng được phủ collagen. Các tế bào Keratinocytes được chuyển hóa ngược với 750 ng mRNA (mmRNA) đã biến đổi về mặt hóa học được chỉ định được tạo phức với RNAIMAX từ Invitrogen như được mô tả trong ba lần. Phức hợp mRNA:RNAIMAX sửa đổi được hình thành như mô tả. Môi trường Keratinocyte được trao đổi sau 6-8 giờ sau khi truyền máu. 42 giờ sau khi truyền máu, tấm TRANSWELL® 24 giếng với màng polyester bán thấm lỗ 0,4 μm được đặt vào đĩa nuôi cấy chứa tế bào sừng được chuyển hóa mRNA đã được biến đổi G-CSF của con người
Tế bào nguyên bào tủy người, tế bào Kasumi-1 hoặc KG-1 (0,2×105tế bào), được gieo vào giếng chèn và sự tăng sinh của tế bào được định lượng sau 42 giờ bắt đầu sau khi đồng nuôi cấy bằng cách sử dụng Xét nghiệm tăng sinh tế bào trực tiếp CyQuant (Invitrogen, Carlsbad, CA) trong thể tích 100-120 μl trong đĩa 96 giếng. Sự tăng sinh tế bào nguyên bào tủy do G-CSF gây ra bởi G-CSF được mã hóa mRNA đã được sửa đổi được biểu thị bằng phần trăm tăng sinh tế bào được chuẩn hóa thành các giếng kiểm soát đồng nuôi cấy tế bào sừng/nguyên bào tủy không được truyền nhiễm. Nồng độ G-CSF được tiết ra ở người trong cả giếng đồng nuôi cấy tế bào keratinocyte và nguyên bào tủy được đo sau 42 giờ bắt đầu sau khi đồng nuôi cấy đối với mỗi mRNA biến đổi được nhân đôi. Sự tiết G-CSF ở người được định lượng bằng cách sử dụng bộ ELISA của Invitrogen theo hướng dẫn do nhà sản xuất khuyến nghị.
MRNA được biến đổi G-CSF của con người được truyền vào các tế bào trung chuyển tế bào sừng ở người và các tế bào nguyên bào tủy ở người chưa được truyền được phát hiện bằng RT-PCR. Tổng số RNA từ các tế bào mẫu được chiết xuất và ly giải bằng bộ RNEASY® (Qiagen, Valencia, CA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA tổng số đã chiết xuất được gửi đến RT-PCR để khuếch đại đặc hiệu mRNA-G-CSF đã biến đổi bằng cách sử dụng bộ PROTOSCRIPT® M-MuLV Taq RT-PCR (New England BioLabs, Ipswich, MA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với G-CSF- của con người mồi đặc hiệu. Sản phẩm RT-PCR được hiển thị bằng điện di trên gel agarose 1,2%.
Ví dụ 40: Xét nghiệm đồng văn hóa
MRNA biến đổi bao gồm các nucleotide biến đổi khác biệt về mặt hóa học mã hóa Yếu tố kích thích cụm bạch cầu hạt ở người (G-CSF) có thể kích thích sự tăng sinh tế bào của một tế bào không đủ năng lực chuyển hóa trong môi trường đồng nuôi cấy. Đồng nuôi cấy bao gồm một loại tế bào có khả năng truyền nhiễm cao như tế bào keratinocyte ở người và một loại tế bào không có khả năng truyền máu như bạch cầu (WBC). G-CSF mã hóa mRNA đã sửa đổi được chuyển vào tế bào có khả năng chuyển hóa cao cho phép sản xuất và bài tiết protein G-CSF vào môi trường ngoại bào nơi G-CSF hoạt động theo cách giống như cận tiết để kích thích tế bào bạch cầu biểu hiện G- Thụ thể CSF tăng sinh. Quần thể WBC mở rộng có thể được sử dụng để điều trị cho những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch hoặc phục hồi một phần quần thể WBC của bệnh nhân bị ức chế miễn dịch và do đó làm giảm nguy cơ nhiễm trùng cơ hội. Trong một ví dụ khác, tế bào có khả năng truyền nhiễm cao như nguyên bào sợi được truyền nhiễm với các yếu tố tăng trưởng nhất định hỗ trợ và mô phỏng sự phát triển, duy trì hoặc biệt hóa của các tế bào gốc phôi có khả năng truyền nhiễm kém hoặc tế bào gốc đa năng cảm ứng.
Ví dụ 41: Xét nghiệm phát hiện kháng thể IgG ở người
A. Phát hiện kháng thể IgG ở người bằng ELISA
Ví dụ này mô tả ELISA đối với IgG ở người từ 293 tế bào Buồng trứng chuột đồng Trung Quốc (CHO) và Thận phôi người (HEK, HER-2 âm tính) được truyền mRNA (mmRNA) biến đổi IgG ở người. Thận phôi thai người (HEK) 293 được nuôi cấy trong môi trường CD 293 có bổ sung L-Glutamine từ Invitrogen cho đến khi chúng đạt đến mức hợp lưu 80-90%. Các tế bào CHO được nuôi cấy trong môi trường CD CHO có bổ sung L-Glutamine, Hypoxanthine và Thymidine. Theo một khía cạnh, các tế bào 2×106 được truyền nhiễm 24 μg mRNA biến đổi được tạo phức với RNAIMAX™ từ Invitrogen trong bình nuôi cấy 75 cm2 của Corning trong 7 ml môi trường. Ở một khía cạnh khác, 80.000 tế bào được truyền 1 μg mRNA biến đổi được tạo phức với RNAIMAX™ từ Invitrogen trong một đĩa 24 giếng. Phức hợp mRNA:RNAIMAX™ biến đổi được hình thành bằng cách ủ mmRNA trong lọ với môi trường CD 293 hoặc CD CHO ở độ pha loãng thể tích 5× trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Trong lọ thứ hai, thuốc thử RNAIMAX™ được ủ với môi trường CD 293 hoặc môi trường CD CHO ở độ pha loãng thể tích 10× trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, lọ mmRNA được trộn với lọ RNAIMAX™ và ủ trong 20-30 phút ở nhiệt độ phòng trước khi thêm từng giọt vào tế bào CHO hoặc HEK. Dịch nổi phía trên được bảo quản ở nhiệt độ 4 độ C. Nồng độ của IgG ở người được tiết ra trong môi trường nuôi cấy trong các lần truyền 24 μg mmRNA được đo ở thời điểm 12, 24, 36 giờ sau khi truyền và mức truyền 1 μg mmRNA được đo sau 36 giờ. Sự tiết Trastuzumab từ các tế bào HEK 293 được truyền nhiễm được định lượng bằng cách sử dụng bộ ELISA của Abcam (Cambridge, MA) theo hướng dẫn do nhà sản xuất khuyến nghị. Dữ liệu cho thấy mmRNA của kháng thể IgG được nhân hóa (như Trastuzumab) có khả năng được dịch mã trong Tế bào HEK và Trastuzumab được tiết ra khỏi tế bào và giải phóng vào môi trường ngoại bào. Hơn nữa, dữ liệu chứng minh rằng việc chuyển đổi các tế bào có Trastuzumab mã hóa mmRNA để sản xuất protein được tiết ra có thể được mở rộng quy mô thành lò phản ứng sinh học hoặc điều kiện nuôi cấy tế bào lớn.
B. Phương pháp phát hiện của phương Tây về kháng thể IgG ở người được tạo ra từ mRNA biến đổi
Một Western Blot gồm các tế bào CHO-K1 được đồng thay thế với 1 μg mỗi chuỗi mRNA biến đổi Trastuzumab (mmRNA) nặng và nhẹ. Tế bào CHO được nuôi cấy bằng các quy trình chuẩn trong đĩa 24 giếng. Các chất nổi trên bề mặt tế bào hoặc các chất ly giải tế bào được thu thập sau 24 giờ truyền máu, được phân tách trên gel SDS-Page 12% và được chuyển vào màng nitrocellulose bằng IBOT® của Invitrogen (Carlsbad, CA). Các tế bào được ủ với liên hợp thứ nhất của kháng thể đa dòng của thỏ với IgG của người được liên hợp với DYLIGHT594 (ab96904, abcam, Cambridge, MA) và liên hợp thứ hai của kháng thể đa dòng của dê với Rb IgG được liên hợp với phosphatase kiềm. Sau khi ủ, kháng thể được phát hiện bằng cách sử dụng chất nền tạo màu kiềm phosphatase Novex® của Invitrogen (Carlsbad, CA).
C. Nhuộm miễn dịch tế bào của mRNA biến đổi được sản xuất bởi Trastuzumab và Rituximab
Các tế bào CHO-K1 được đồng thay thế với 500 ng mỗi Chuỗi nặng và Chuỗi nhẹ của Trastuzumab hoặc Rituximab. Tế bào được nuôi cấy trong môi trường F-12K từ GIBCO® (Grand Island, NY) và 10% FBS. Các tế bào được cố định bằng 4% paraformaldehyde trong PBS, được thấm bằng Triton X-100 0,1% trong PBS trong 5-10 phút ở nhiệt độ phòng và rửa tế bào 3 lần bằng PBS ở nhiệt độ phòng. Nhuộm trastuzumab và Rituximab được thực hiện bằng cách sử dụng kháng thể đa dòng của thỏ kháng IgG người kết hợp với DYLIGHT®594 (ab96904, abcam, Cambridge, MA) theo độ pha loãng được khuyến nghị của nhà sản xuất. Nhuộm DNA hạt nhân được thực hiện bằng thuốc nhuộm DAPI của Invitrogen (Carlsbad, CA). Protein của Trastuzumab và Rituximab được dịch mã và định vị vào tế bào chất sau khi chuyển đổi mRNA đã được sửa đổi. Hình ảnh được chụp 13 giờ sau khi truyền máu.
D. Xét nghiệm miễn dịch liên kết đối với mRNA biến đổi được sản xuất ra Trastuzumab và Rituximab
Trastuzumab và Rituximab được phát hiện bằng xét nghiệm phát hiện immunoblot liên kết. Các nồng độ khác nhau (100 ng/ul đến 0 ng/ul) của peptide ErB2 (ab40048, abeam, Cambridge, MA), kháng nguyên Trastuzumab và peptide CD20 (ab97360, abeam, Cambridge, MA), kháng nguyên Rituximab được chạy trên gel 12% SDS-Page và chuyển lên màng bằng iBlot của Invitrogen. Các màng này được ủ trong 1 giờ với các chất nổi trên bề mặt tế bào tương ứng của chúng từ các tế bào CHO-K1 được đồng nhiễm với 500 ng mỗi Chuỗi nặng và Chuỗi nhẹ của Trastuzumab hoặc Rituximab. Các màng này bị chặn bằng 1% BSA và một kháng thể IgG kháng người thứ cấp kết hợp với phosphatase kiềm (abcam, Cambridge, MA) được thêm vào. Việc phát hiện kháng thể được tiến hành bằng cách sử dụng chất nền tạo màu kiềm phosphatase NOVEX của Invitrogen (Carlsbad, CA). Dữ liệu cho thấy kháng thể IgG được nhân bản hóa được tạo ra từ mRNA biến đổi có khả năng nhận biết và liên kết với các kháng nguyên tương ứng của chúng.
E. Xét nghiệm tăng sinh tế bào
Dòng tế bào SK-BR-3, một dòng tế bào bám dính có nguồn gốc từ ung thư biểu mô tuyến vú ở người, biểu hiện quá mức thụ thể HER2/neu có thể được sử dụng để so sánh các đặc tính chống tăng sinh của mRNA biến đổi (mmRNA) do Trastuzumab tạo ra. Các nồng độ khác nhau của Trastuzumab tinh khiết được tạo ra từ mRNA biến đổi và trastuzumab được thêm vào nuôi cấy tế bào và ảnh hưởng của chúng lên sự phát triển của tế bào được đánh giá bằng các thử nghiệm về khả năng sống sót và độc tính tế bào ba lần.
Ví dụ 42: Chuyển khối lượng lớn mRNA đã biến đổi vào nuôi cấy tế bào
A. Phương tiện phân phối lipid cation
Việc chuyển RNA được thực hiện bằng cách sử dụng phương tiện vận chuyển lipid cation RNAIMAX™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) hoặc TRANSIT-mRNA (Mirus Bio, Madison, WI). RNA và thuốc thử lần đầu tiên được pha loãng trong môi trường cơ bản Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA). 100 ng/uL RNA được pha loãng 5× và 5 μL RNAIMax trên mỗi g RNA được pha loãng 10×. Các thành phần đã pha loãng được gộp lại và ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng trước khi chúng được phân phối vào môi trường nuôi cấy. Đối với việc chuyển đổi TRANSIT-mRNA, 100 ng/uL RNA được pha loãng 10× trong thuốc thử Opti-MEM và BOOST được thêm vào (ở nồng độ 2 μL mỗi g RNA), TRANSIT-mRNA được thêm vào (ở nồng độ 2 μL mỗi g RNA). g RNA), và sau đó phức hợp RNA-lipid được đưa vào môi trường nuôi cấy sau khi ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng. Quá trình chuyển đổi RNA được thực hiện trong môi trường Nutristem xenofree hES (Stemgent, Cambridge, MA) cho các dẫn xuất RiPS, Dermal Cell Basal Medium plus Keratinocyte Growth Kit (ATCC) cho các thí nghiệm tế bào sừng và Opti-MEM cộng với 2% FBS cho tất cả các thí nghiệm khác. Việc đưa thành công mRNA đã biến đổi (mmRNA) vào tế bào chủ có thể được theo dõi bằng nhiều phương pháp đã biết khác nhau, chẳng hạn như chất đánh dấu huỳnh quang, chẳng hạn như Protein huỳnh quang xanh (GFP). Sự chuyển nạp thành công mARN biến đổi cũng có thể được xác định bằng cách đo mức biểu hiện protein của polypeptit đích bằng phương pháp Western Blotting hoặc hóa học tế bào miễn dịch. Các phương pháp tương tự có thể được áp dụng đối với định dạng nuôi cấy tăng quy mô thể tích lớn lên nhiều lít (5-10.000 L) theo các tỷ lệ phức hợp RNA-lipid tương tự.
B. Cung cấp bản phiên mã mRNA tổng hợp ngoại sinh bằng phương pháp điện di
Các thông số điện di được tối ưu hóa bằng cách truyền các nguyên bào sợi MRC-5 bằng bản phiên mã mRNA (mmRNA) tổng hợp biến đổi trong ống nghiệm và đo hiệu suất truyền bằng RT-PCR định lượng với các đoạn mồi được thiết kế để phát hiện cụ thể các bản phiên mã ngoại sinh. Xả một tụ điện 150 uF được tích điện vào F thành 2,5 × 106các tế bào lơ lửng trong 50 μl Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) trong cuvet điện di tiêu chuẩn có khoảng cách 2 mm là đủ để phân phối lặp lại vượt quá 10.000 bản sao của bản phiên mã mRNA đã sửa đổi trên mỗi ô, như được xác định bằng phương pháp đường cong tiêu chuẩn , đồng thời duy trì khả năng tồn tại cao (>70%). Các thí nghiệm tiếp theo có thể tiết lộ rằng điện áp cần thiết để truyền các tế bào có bản phiên mã mmRNA một cách hiệu quả có thể phụ thuộc vào mật độ tế bào trong quá trình điện di. Mật độ tế bào có thể thay đổi từ 1×106tế bào/50 μl đến mật độ 2,5×106tế bào/50 µl và cần điện áp từ 110V đến 145V để truyền tải tế bào với hiệu suất tương tự được đo bằng bản sao phiên mã trên mỗi tế bào. Quá trình điện di lớn nhiều lít (5-10.000 L) có thể được thực hiện tương tự như chiến lược điện di dòng thể tích lớn tương tự như các phương pháp được mô tả với các hạn chế được mô tả ở trên (Li và cộng sự, 2002; Geng và cộng sự, 2010).
Ví dụ 43: Giao hàng tận nơi bằng cách sử dụng Lipoplexes
A. Lipoplex RNA biến đổi EPO của con người
Chế phẩm chứa 100 μg mRNA erythropoietin của người đã biến đổi (mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) (EPO; 5-methylcytosine được biến đổi hoàn toàn; N1-metyl- pseudouridine) được lipoplexed với 30% thể tích RNAIMAX™ (Lipoplex-h-Epo-46; Thế hệ 2 hoặc Gen2) trong 50-70 uL được tiêm bắp cho bốn con chuột C57/BL6. Các nhóm khác bao gồm những con chuột được tiêm mRNA luciferase biến đổi lipoplexed (Lipoplex-luc) (trình tự IVT cDNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện trong trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine tại mỗi vị trí uridine) đóng vai trò như đối chứng chứa 100 μg mRNA luciferase biến đổi được lipoplexed với 30% thể tích RNAiMAX™ hoặc chuột nhận tiêm dung dịch đệm công thức làm đối chứng âm tính ở thể tích liều 65 ul. 13 giờ sau khi tiêm bắp, huyết thanh được thu thập từ mỗi con chuột để đo lượng protein EPO của con người trong huyết thanh chuột bằng ELISA EPO của con người và kết quả được thể hiện trong Bảng 61.
B. Lipoplex RNA biến đổi G-CSF của con người
Chế phẩm chứa 100 μg của một trong hai phiên bản của mRNA G-CSF biến đổi ở người (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) (G-CSF đầy đủ được biến đổi bằng 5-methylcytosine và pseudouridine (G-CSF) hoặc G-CSF được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine (G-CSF-N1) được lipoplex hóa với 30% thể tích RNAIMAX™ và được phân phối trong 150 uL tiêm bắp (IM), trong 150 uL tiêm dưới da (S.C) và trong 225 uL tiêm tĩnh mạch (IV) cho chuột C57/BL6.
Ba nhóm đối chứng được sử dụng 100 μg mRNA luciferase biến đổi (trình tự IVT cDNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự, 5′cap, Cap1 , được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine ở mỗi chất thay thế cytosine và pseudouridine tại mỗi vị trí uridine) tiêm bắp (Luc-unsp I.M.) hoặc 150 μg luciferase mRNA biến đổi tiêm tĩnh mạch (Luc-unsp I.V.) hoặc 150 uL dung dịch đệm công thức tiêm bắp (Bộ đệm I.M. ). 6 giờ sau khi sử dụng công thức, huyết thanh được thu thập từ mỗi con chuột để đo lượng protein G-CSF của con người trong huyết thanh chuột bằng phương pháp ELISA G-CSF của con người và kết quả được thể hiện trong Bảng 62.
Những kết quả này chứng minh rằng cả mRNA G-CSF của người được biến đổi 5-methylcytosine/pseudouridine và 5-methylcytosine/N1-methyl-pseudouridine đều có thể dẫn đến biểu hiện protein G-CSF cụ thể ở người trong huyết thanh khi được truyền qua đường tiêm tĩnh mạch. hoặc đường dùng IM trong công thức lipoplex.
C. So sánh Lipoplex RNA biến đổi G-CSF của con người
Công thức chứa 100 μg mRNA G-CSF biến đổi của người được lipoplex hóa với 30% thể tích RNAIMAX™ với 5-methylcytosine (5mc) và biến đổi pseudouridine (ψ) (G-CSF-Gen1-Lipoplex), G của người đã biến đổi -CSF mRNA với biến đổi 5mc và W trong nước muối (G-CSF-Gen1-Saline), mRNA G-CSF biến đổi của con người với N1-5-methylcytosine (N1-5mc) và biến đổi ψ lipoplexed với 30% theo thể tích RNAIMAX™ (G-CSF-Gen2-Lipoplex), mRNA G-CSF biến đổi của con người với biến đổi N1-5mc và W trong nước muối (G-CSF-Gen2-Saline), luciferase biến đổi với biến đổi 5mc và W lipoplexed với 30% theo thể tích RNAIMAX™ (Luc-Lipoplex) hoặc mRNA luciferase biến đổi với mức biến đổi 5mc và ψ trong nước muối (Luc-Saline) được truyền qua đường tiêm bắp (I.M.) hoặc tiêm dưới da (S.C.) và một nhóm đối chứng cho từng phương pháp sử dụng được đưa ra một liều 80 uL dung dịch đệm công thức (F. Buffer) cho chuột C57/BL6. Huyết thanh và mô sau 13 giờ tiêm từ vị trí tiêm được thu thập từ mỗi con chuột và được phân tích bằng ELISA G-CSF để so sánh mức protein G-CSF ở người. Kết quả của protein G-CSF của người trong huyết thanh chuột từ đường tiêm bắp và kết quả tiêm dưới da được thể hiện trong Bảng 63.
Những kết quả này chứng minh rằng mRNA G-CSF đã biến đổi 5-methylcytosine/pseudouridine và 5-methylcytosine/N1-methyl-pseudouridine của con người có thể dẫn đến biểu hiện protein G-CSF cụ thể ở người trong huyết thanh khi được truyền qua đường tiêm bắp hoặc SC dù ở trong nước muối công thức hoặc trong công thức lipoplex. Như được thể hiện trong Bảng 63, mARN G-CSF của người được biến đổi 5-methylcytosine/N1-methyl-pseudouridine thường thể hiện sự sản xuất protein G-CSF của người tăng lên so với mARN G-CSF của người được biến đổi bằng 5-methylcytosine/pseudouridine.
D. So sánh Lipoplex RNA biến đổi mCherry
Tiêm bắp và tiêm dưới da
Công thức chứa 100 μg mRNA mCherry đã biến đổi (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được lipoplex hóa với 30% thể tích RNAIMAX™ hoặc mCherry biến đổi mRNA trong nước muối được tiêm bắp và tiêm dưới da cho chuột. Dung dịch đệm công thức cũng được sử dụng cho nhóm chuột đối chứng theo đường tiêm bắp hoặc tiêm dưới da. Vị trí tiêm trên chuột có thể được thu thập sau 17 giờ tiêm để phân chia nhằm xác định (các) loại tế bào chịu trách nhiệm sản xuất protein.
Quản trị nội nhãn
Công thức chứa 10 μg mCherry mRNA biến đổi lipoplexed với RNAIMAX™, mCherry mRNA biến đổi trong đệm công thức, luciferase mRNA biến đổi lipoplexed với RNAMAX™, luciferase mRNA biến đổi trong đệm công thức có thể được sử dụng bằng cách tiêm trong dịch kính (IVT) ở chuột ở thể tích liều 5µl/mắt. Dung dịch đệm công thức cũng được IVT sử dụng cho nhóm chuột đối chứng với thể tích liều 5 μl/mắt. Mắt của chuột đã được điều trị có thể được thu thập sau 18 giờ sau khi tiêm để phân chia và ly giải nhằm xác định xem mmRNA có thể được vận chuyển in vivo đến mắt một cách hiệu quả và dẫn đến sản xuất protein hay không, đồng thời xác định (các) loại tế bào chịu trách nhiệm sản xuất protein trong vivo.
Quản lý nội sọ
Một công thức chứa 100 μg mCherry mRNA biến đổi lipoplexed với 30% thể tích RNAIMAX™, mCherry mRNA biến đổi trong nước muối, luciferase mRNA biến đổi lipoplexed với 30% thể tích RNAIMAX™ hoặc luciferase mRNA biến đổi trong nước muối được phân phối qua đường mũi. Dung dịch đệm công thức cũng được cấp cho nhóm đối chứng qua đường mũi. Phổi có thể được thu thập khoảng 13 giờ sau khi nhỏ thuốc để phân chia (đối với những người nhận mCherry mRNA) hoặc đồng nhất hóa (đối với những người nhận luciferase mRNA). Những mẫu này sẽ được sử dụng để xác định xem liệu mmRNA có thể được vận chuyển một cách hiệu quả trong cơ thể đến phổi và tạo ra protein hay không, đồng thời để xác định (các) loại tế bào chịu trách nhiệm sản xuất protein trong cơ thể.
Ví dụ 44: Giao hàng tại Vivo sử dụng các tỷ lệ lipid khác nhau
MRNA đã biến đổi được chuyển đến chuột C57/BL6 để đánh giá các tỷ lệ lipid khác nhau và sự biểu hiện protein thu được. Công thức chứa 100 μg mRNA EPO của người đã biến đổi (mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được lipoplex hóa với 10%, 30 % hoặc 50% RNAIMAX™, 100 μg mRNA luciferase biến đổi (trình tự IVT cDNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự, 5′cap, Cap1 , được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine ở mỗi vị trí uridine) được lipoplexed với 10%, 30% hoặc 50% RNAIMAX™ hoặc một chất đệm công thức được tiêm bắp cho chuột với một liều duy nhất 70 μl. Huyết thanh được thu thập sau 13 giờ tiêm để trải qua ELISA EPO ở người để xác định mức protein EPO của con người ở mỗi con chuột. Kết quả ELISA EPO ở người, được trình bày trong Bảng 64, cho thấy EPO biến đổi ở người biểu hiện trong cơ được tiết vào huyết thanh theo từng tỷ lệ RNAIMAX™ khác nhau
Ví dụ 45: Giao hàng qua đường tiêm bắp và tiêm dưới da trong cơ thể sống ở động vật có vú
MRNA EPO đã được sửa đổi của con người (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được bào chế trong dung dịch đệm công thức đã được chuyển đến C57 /BL6 hoặc chuột Sprague-Dawley để đánh giá sự phụ thuộc liều lượng vào việc sản xuất EPO ở người. Chuột được tiêm bắp 50 µl mRNA EPO biến đổi của người (h-EPO), mRNA luciferase biến đổi (Luc) (trình tự IVT cDNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA của khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine tại mỗi vị trí uridine) hoặc dung dịch đệm công thức (F.Buffer) như được mô tả trong biểu đồ định lượng Bảng 65.
Chuột được tiêm bắp hoặc tiêm dưới da 50 µl mRNA EPO biến đổi của người (h-EPO), mRNA luciferase biến đổi (Luc) hoặc dung dịch đệm công thức (F.Buffer) như được mô tả trong biểu đồ liều lượng Bảng 66. Máu sau 13 giờ tiêm được thu thập và huyết thanh được phân tích để xác định lượng EPO ở người cho mỗi con chuột. Giá trị trung bình và trung bình nhân tính bằng pg/ml đối với nghiên cứu trên chuột cũng được trình bày trong Bảng 65.
Ví dụ 46: Thời gian hoạt động sau khi tiêm bắp In Vivo
MRNA EPO đã được sửa đổi của con người (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được bào chế trong dung dịch đệm công thức đã được chuyển đến Sprague- Chuột Dawley để xác định thời gian đáp ứng liều. Chuột được tiêm bắp 50 µl mRNA EPO biến đổi của người (h-EPO), mRNA luciferase biến đổi(trình tự IVT cDNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi chất thay thế cytosine và pseudouridine tại mỗi vị trí uridine) (Luc) hoặc dung dịch đệm công thức (F.Buffer) như được mô tả trong biểu đồ định lượng Bảng 67. The chuột bị chảy máu 2, 6, 12, 24, 48 và 72 giờ sau khi tiêm bắp để xác định nồng độ EPO ở người trong huyết thanh tại một thời điểm nhất định. Giá trị trung bình trung bình và hình học tính bằng pg/ml trong nghiên cứu này cũng được trình bày trong Bảng 67.
Ví dụ 47: Đường quản trị
Các nghiên cứu sâu hơn đã được thực hiện để điều tra việc dùng thuốc bằng các đường dùng khác nhau. Theo quy trình được nêu trong Ví dụ 35, 4 con chuột trong mỗi nhóm được tiêm bắp (I.M.), tiêm tĩnh mạch (IV) hoặc tiêm dưới da (S.C.) theo biểu đồ liều lượng được nêu trong Bảng 68. Huyết thanh được thu thập sau 13 giờ tiêm từ tất cả các con chuột, mô được thu thập được thu thập từ vị trí tiêm từ nhóm tiêm bắp và dưới da và lá lách, gan và thận được thu thập từ nhóm tiêm tĩnh mạch. Kết quả của nhóm tiêm bắp và kết quả của nhóm tiêm dưới da được thể hiện trong Bảng 69.
Ví dụ 48. Nghiên cứu về hạt nano lipid được loại bỏ nhanh chóng (reLNP)
A. Công thức của reLNP RNA biến đổi
Dung dịch lipid tổng hợp, 1,2-dstearoyl-3-phosphatidylcholine (DSPC) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), cholesterol (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Đức) và α-[3′-(1,2- dimyristoyl-3-propanoxy)-carboxamide-propyl]-ω-methoxy-polyoxyethylene (PEG-c-DOMG) (NOF, Bouwelven, Bỉ) được điều chế và bảo quản ở −20° C. Lipid tổng hợp được chọn từ DLin-DMA với este nội, DLin-DMA với este cuối, Dlin-MC3-DMA-ester nội, và DLin-MC3-DMA với este cuối. Các reLNP được kết hợp để tạo ra tỷ lệ mol 50:10:38,5:1,5 (reLNP: DSPC: Cholesterol: PEG-c-DOMG). Các công thức của reLNP và mARN biến đổi được điều chế bằng cách kết hợp dung dịch lipid với dung dịch mARN biến đổi với tỷ lệ trọng lượng tổng lipid và mARN biến đổi là 10:1, 15:1, 20:1 và 30:1.
B. Đặc tính của công thức
Máy Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, UK) được sử dụng để xác định kích thước hạt, chỉ số đa phân tán (PDI) và thế zeta của các hạt nano mRNA biến tính trong 1×PBS trong việc xác định kích thước hạt và 15 mM PBS trong việc xác định thế zeta.
Quang phổ tia cực tím nhìn thấy được sử dụng để xác định nồng độ của công thức hạt nano mRNA đã biến đổi. Sau khi trộn, phổ hấp thụ của dung dịch được ghi lại trong khoảng từ 230 nm đến 330 nm trên máy quang phổ DU 800 (Beckman Coulter, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Nồng độ RNA biến đổi trong công thức hạt nano được tính toán dựa trên hệ số tuyệt chủng của RNA biến đổi được sử dụng trong công thức và sự khác biệt giữa độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và giá trị cơ bản ở bước sóng 330 nm.
Xét nghiệm QUANT-IT™ RIBOGREEN® RNA (Invitrogen Corporation Carlsbad, CA) được sử dụng để đánh giá khả năng đóng gói RNA biến đổi bằng hạt nano. Các mẫu được pha loãng, chuyển sang đĩa polystyrene 96 giếng, sau đó thêm dung dịch đệm TE hoặc dung dịch Triton X-100 2%. Đĩa được ủ và thuốc thử RIBOGREEN® được pha loãng trong đệm TE, sau đó thêm dung dịch này vào từng giếng. Cường độ huỳnh quang được đo bằng cách sử dụng đầu đọc đĩa huỳnh quang (Bộ đếm đa nhãn Wallac Victor 1420; Perkin Elmer, Waltham, MA) Các giá trị huỳnh quang của mẫu trắng thuốc thử được trừ khỏi mỗi mẫu và phần trăm RNA biến đổi tự do được xác định bằng cách chia cường độ huỳnh quang của mẫu nguyên vẹn bằng giá trị huỳnh quang của mẫu bị phá vỡ.
C. Ủ trong ống nghiệm
Tế bào biểu mô thận phôi người (HEK293) và tế bào biểu mô ung thư biểu mô tế bào gan (HepG2) (LGC tiêu chuẩn GmbH, Wesel, Đức) được gieo hạt trên các đĩa 96 giếng (Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen, Đức) và các đĩa dành cho tế bào HEK293 được phủ trước bằng collagen typ. HEK293 được gieo hạt với mật độ khoảng 30.000 và HepG2 được gieo hạt với mật độ khoảng 35.000 tế bào mỗi giếng trong môi trường nuôi cấy tế bào 100 μl. Các chế phẩm chứa mCherry mARN (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được thêm trực tiếp sau khi gieo hạt vào tế bào và được ủ. cDNA mCherry với trình tự khởi đầu T7, vùng 5′chưa được dịch mã (UTR) và 3′ UTR được sử dụng trong phiên mã in vitro (IVT) được nêu trong SEQ ID NO: 31909.
Tế bào được thu hoạch bằng cách chuyển chất nổi trên bề mặt của môi trường nuôi cấy sang đĩa đáy chữ U Pro-Bind 96 giếng (Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg, Đức). Các tế bào được cố gắng cố định với 1/2 thể tích Trypsin/EDTA (Biochrom AG, Berlin, Đức), gộp với các chất nổi phía trên tương ứng và cố định bằng cách thêm một thể tích PBS/2% FCS (cả Biochrom AG, Berlin, Đức)/0,5% formaldehyde (Merck , Darmstadt, Đức). Sau đó, các mẫu được gửi đến máy đo tế bào dòng chảy bằng laser kích thích và bộ lọc PE-Texas Red trong máy đo tế bào LSRII (Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg, Đức). Cường độ huỳnh quang trung bình (MFI) của tất cả các sự kiện và độ lệch chuẩn của bốn giếng độc lập được trình bày cho các mẫu được phân tích.
D. Nghiên cứu công thức trong Vivo
Chuột được tiêm tĩnh mạch một liều duy nhất của công thức có chứa mRNA biến đổi và reLNP. MRNA biến đổi được sử dụng cho chuột được chọn từ G-CSF (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1), Yếu tố IX (mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) hoặc mCherry (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO:31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1 ).
Những con chuột được tiêm 100 ug, 10 ug hoặc 1 ug mRNA biến đổi theo công thức và bị giết 8 giờ sau khi chúng được sử dụng công thức này. Huyết thanh từ chuột được sử dụng công thức chứa mARN biến đổi G-CSF của người được đo bằng ELISA G-CSF cụ thể và huyết thanh từ chuột được sử dụng RNA biến đổi Yếu tố IX của người được phân tích bằng ELISA yếu tố IX đặc hiệu hoặc xét nghiệm tạo màu. Gan và lá lách của những con chuột được tiêm mRNA biến đổi mCherry được phân tích bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC) hoặc phân loại tế bào được kích hoạt bằng huỳnh quang (FACS). Để kiểm soát, một nhóm chuột không được tiêm bất kỳ công thức nào và huyết thanh và mô của chúng được thu thập để phân tích bằng ELISA, FACS và/hoặc IHC.
Ví dụ 49. Chuyển gen VEGF-A in vitro
MRNA được biến đổi yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu-đồng phân A (VEGF-A) ở người (trình tự mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31920; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) đã được chuyển nạp thông qua quá trình chuyển nạp ngược ở Người Tế bào Keratinocyte trong 24 đĩa nhiều giếng. Tế bào Keratinocytes ở người được nuôi cấy trong môi trường EPILIFE® có bổ sung S7 từ Invitrogen (Carlsbad, CA) cho đến khi chúng đạt đến mức hợp lưu 50-70%. Các tế bào được chuyển nhiễm 0, 46,875, 93,75, 187,5, 375, 750 và 1500 ng mRNA (mmRNA) mã hóa VEGF-A đã được sửa đổi đã được tạo phức với RNAIMAX™ từ Invitrogen (Carlsbad, CA). Phức hợp RNA:RNAIMAX™ được hình thành bằng cách ủ RNA đầu tiên với môi trường EPILIFE® không bổ sung ở độ pha loãng thể tích 5× trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Trong lọ thứ hai, thuốc thử RNAIMAX™ được ủ với EPILIFE® Media không bổ sung ở độ pha loãng thể tích 10× trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, lọ RNA được trộn với lọ RNAIMAX™ và ủ trong 20-30 phút ở nhiệt độ phòng trước khi thêm từng giọt vào tế bào.
VEGF-A mã hóa mRNA được tối ưu hóa hoàn toàn (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ TD NO: 31920; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; nắp 5’, Capil) được chuyển nhiễm các tế bào Keratinocyte ở người bao gồm các biến đổi trong quá trình dịch mã như nucleoside tự nhiên triphosphate (NTP), pseudouridine ở mỗi vị trí uridine và 5-methylcytosine ở mỗi vị trí cytosine (pseudo-U/5 mC), và N1-methyl-pseudouridine ở mỗi vị trí uridine và 5-methylcytosine ở mỗi vị trí cytosine (N1-methyl- Giả-U/5 mC). Các tế bào được chuyển nhiễm VEGF-A mã hóa mmRNA và nồng độ VEGF-A được tiết ra (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy được đo ở thời điểm 6, 12, 24 và 48 giờ sau khi truyền cho mỗi nồng độ bằng cách sử dụng bộ ELISA từ Invitrogen (Carlsbad, CA) theo hướng dẫn khuyến nghị của nhà sản xuất. Những dữ liệu này, được thể hiện trong Bảng 70 và
Ví dụ 50. Nghiên cứu in vivo về yếu tố IX
Yếu tố con người IX mmRNA (Gen1; 5-methycytosine và pseudouridine đã được biến đổi hoàn toàn) được bào chế trong dung dịch đệm công thức được chuyển đến chuột bằng cách tiêm bắp. Kết quả chứng minh rằng protein Yếu tố IX tăng cao trong huyết thanh khi đo được 13 giờ sau khi dùng.
Trong nghiên cứu này, chuột (N=5 đối với Yếu tố IX, N=3 đối với các biện pháp kiểm soát Luciferase hoặc Bộ đệm) được tiêm bắp 50 μl Yếu tố IX mmRNA (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1), Luciferase (trình tự IVT cDNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine tại mỗi vị trí uridine) hoặc dung dịch đệm công thức (F.Buffer) ở mức 2 × 100 ug/con chuột. Chuột bị chảy máu lúc 13 giờ sau khi tiêm bắp để xác định nồng độ polypeptide ở người trong huyết thanh tính bằng pg/mL. Kết quả cho thấy rằng việc sử dụng Yếu tố IX mmRNA dẫn đến mức 1600 pg/mL sau 13 giờ so với mức dưới 100 pg/mL của Yếu tố IX đối với việc sử dụng Luciferase hoặc kiểm soát đệm.
Ví dụ 51. Quản lý nhiều vị trí: Tiêm bắp và tiêm dưới da
MRNA được biến đổi G-CSF của người (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi thành Gen1 hoặc Gen2 (5-methylcytosine (5mc) và pseudouridine (ψ) biến đổi, G-CSF-Gen1; hoặc N1-5-methylcytosine (N1-5mc) và biến đổi ψ, G-CSF-Gen2) và được bào chế trong dung dịch đệm công thức được chuyển đến chuột qua đường tiêm bắp (IM) hoặc tiêm dưới da ( SC) tiêm. Việc tiêm bốn liều hoặc 2 × 50 ug (hai vị trí) mỗi ngày trong ba ngày (khoảng thời gian 24 giờ) đã được thực hiện. Liều thứ tư được tiêm 6 giờ trước khi lấy máu và phân tích CBC. Các biện pháp kiểm soát bao gồm Luciferase (trình tự IVT cDNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi thay thế cytosine và pseudouridine tại mỗi vị trí uridine) hoặc dung dịch đệm công thức (F.Buffer). Những con chuột bị chảy máu lúc 72 giờ sau lần tiêm mRNA đầu tiên (6 giờ sau liều mRNA sửa đổi cuối cùng) để xác định ảnh hưởng của G-CSF ở người được mã hóa mRNA đối với số lượng bạch cầu trung tính. Phác đồ dùng thuốc được thể hiện trong Bảng 71 cũng như số lượng bạch cầu trung tính thu được (nghìn/uL). Trong Bảng 71, dấu hoa thị(*) biểu thị ý nghĩa thống kê ở mức p<0,05.
Đối với việc tiêm bắp, dữ liệu cho thấy số lượng bạch cầu trung tính tăng gấp bốn lần so với mức kiểm soát vào ngày thứ 3 đối với gen1 G-CSF mRNA và tăng hai lần đối với gen2 G-CSF mmRNA. Đối với đường tiêm dưới da, dữ liệu cho thấy số lượng bạch cầu trung tính tăng gấp hai lần so với mức kiểm soát vào ngày thứ 3 đối với gen2 G-CSF mRNA.
Những dữ liệu này chứng minh rằng cả mRNA được biến đổi 5-methylcytidine/pseudouridine và 5-methylcytidine/N1-methyl-pseudouridine đều có thể hoạt động về mặt sinh học, bằng chứng là sự gia tăng cụ thể về số lượng bạch cầu trung tính trong máu.
Ví dụ 52. Tiêm tĩnh mạch
MRNA được biến đổi G-CSF của người (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi bằng 5-methylcytosine (5mc) và biến đổi pseudouridine (ψ) ( Thế hệ 1); hoặc không có sửa đổi và được bào chế ở dạng lipoplex 10% (RNAiMax) được chuyển đến chuột với liều 50 RNA xấu xí và với thể tích 100 ul qua đường tiêm tĩnh mạch (IV) vào các ngày 0, 2 và 4. Bạch cầu trung tính được đo vào các ngày 1, 5 và 8. Các biện pháp kiểm soát chỉ bao gồm RNA của động vật có vú không đặc hiệu hoặc chỉ riêng dung dịch đệm công thức (F.Buffer). Những con chuột được gây chảy máu vào ngày thứ 1, 5 và 8 để xác định tác động của G-CSF ở người được mã hóa mRNA đã biến đổi nhằm tăng số lượng bạch cầu trung tính. Phác đồ dùng thuốc được trình bày trong Bảng 72 cũng như số lượng bạch cầu trung tính thu được (nghìn/uL; K/uL).
Đối với tiêm tĩnh mạch, dữ liệu cho thấy số lượng bạch cầu trung tính tăng gấp 4 đến 5 lần so với mức kiểm soát vào ngày thứ 5 với mRNA được biến đổi G-CSF nhưng không tăng với mRNA G-CSF không biến đổi hoặc các biện pháp kiểm soát không đặc hiệu. Công thức máu trở lại mức cơ bản bốn ngày sau lần tiêm cuối cùng. Không có thay đổi nào khác về quần thể bạch cầu được quan sát thấy.
Trong Bảng 72, dấu hoa thị(*) biểu thị ý nghĩa thống kê ở mức p<0,001 so với bộ đệm.
Những dữ liệu này chứng minh rằng mRNA được biến đổi 5-methylcytidine/pseudouridine được điều chế bằng lipoplex có thể có hoạt tính sinh học khi được truyền qua đường tiêm tĩnh mạch. đường dùng được chứng minh bằng sự gia tăng cụ thể về số lượng bạch cầu trung tính trong máu. Không có tập hợp con tế bào nào khác bị thay đổi đáng kể. MRNA G-CSF chưa biến đổi được sử dụng tương tự cho thấy không có tác dụng dược lý đối với số lượng bạch cầu trung tính.
Ví dụ 53. Công thức nước muối: Tiêm bắp
A. Biểu hiện protein
MRNA được biến đổi G-CSF của người (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) và EPO mmRNA của người (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; polyA đuôi có khoảng 160 nucleotide không được trình bày theo trình tự; MRNA biến đổi G-CSF (được biến đổi bằng 5-methylcytosine (5mc) và pseudouridine (ψ)) và mRNA biến đổi EPO (được biến đổi bằng N1-5-methylcytosine (N1-5mc) và biến đổi W), được bào chế trong dung dịch đệm công thức (150 mM natri clorua, 2 mM canxi clorua, 2 mM photphat, 0,5 mM EDTA ở độ pH 6,5) và được đưa đến chuột qua đường tiêm bắp (IM) với liều 100 ug.
Các biện pháp kiểm soát bao gồm Luciferase (trình tự IVT cDNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi thay thế cytosine và pseudouridine tại mỗi vị trí uridine) hoặc dung dịch đệm công thức (F.Buffer). Những con chuột bị chảy máu vào lúc 13 giờ sau khi tiêm để xác định nồng độ polypeptide của người trong huyết thanh tính bằng pg/mL. (Nhóm G-CSF đo G-CSF của người trong huyết thanh chuột và nhóm EPO đo EPO của người trong huyết thanh chuột). Dữ liệu được thể hiện trong Bảng 73.
B. Đáp ứng liều lượng
MRNA được biến đổi EPO của người (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được tạo ra trong dung dịch đệm công thức và được chuyển cho chuột qua đường tiêm bắp (IM).
Các biện pháp kiểm soát bao gồm Luciferase (trình tự mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) hoặc dung dịch đệm công thức (F.Buffer). Những con chuột bị chảy máu vào lúc 13 giờ sau khi tiêm để xác định nồng độ polypeptide của người trong huyết thanh tính bằng pg/mL. Liều lượng và biểu hiện được thể hiện trong Bảng 74.
Ví dụ 54. EPO Đa liều/Quản lý nhiều lần
Các nghiên cứu sử dụng nhiều vị trí tiêm bắp tại một thời điểm đã được thiết kế và thực hiện.
Thiết kế của một thí nghiệm nhiều liều duy nhất liên quan đến việc sử dụng mmRNA erythropoietin (EPO) của người (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) hoặc G-CSF mmRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được sử dụng trong dung dịch đệm công thức. Phương tiện định lượng (F. đệm) được sử dụng làm phương tiện kiểm soát. MRNA biến đổi EPO và G-CSF đã được biến đổi bằng 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine tại mỗi vị trí uridine.
Động vật (n=5), chuột Sprague-Dawley, được tiêm IM (tiêm bắp) với liều đơn vị 100 ug (tiêm vào một đùi). Đối với sử dụng đa liều, 6 liều 100 ug (phân phối cho hai đùi) đã được sử dụng cho cả mmRNA EPO và G-CSF. Kiểm soát liều lượng liên quan đến việc sử dụng chất đệm ở một liều duy nhất. Nồng độ EPO trong máu người được đánh giá sau 13 giờ tiêm.
Protein EPO ở người được đo trong huyết thanh chuột 13 giờ sau khi tiêm bắp. Năm nhóm chuột đã được điều trị và đánh giá. Kết quả được thể hiện ở Bảng 75.
Ví dụ 55. Nghiên cứu trao đổi chuỗi tín hiệu
Một số biến thể của mmRNA mã hóa yếu tố kích thích tạo cụm bạch cầu hạt ở người (G-CSF) (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được tổng hợp bằng cách sử dụng các nucleotide biến đổi pseudouridine và 5-methylcytosine (giả-U/5 mC). Các biến thể này bao gồm các cấu trúc G-CSF mã hóa trình tự peptit tín hiệu bài tiết đầu cuối loại hoang dã N (MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEA; SEQ ID NO: 95), không có trình tự peptit tín hiệu bài tiết hoặc trình tự peptit tín hiệu bài tiết được lấy từ các mARN khác. Các trình tự này bao gồm các trình tự trong đó trình tự peptit tín hiệu G-CSF hoang dã được thay thế bằng trình tự peptit tín hiệu của: α-1-anti trypsin (AAT) của người (MMPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA; SEQ ID NO: 94), Yếu tố IX của con người (FIX) ( MQRVNMIMAESPSLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR; SEQ ID NO: 96), Prolactin của con người (Prolac) (MKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP; SEQ ID NO: 97) hoặc Albumin của con người (Alb) (MKWVTFISLLFSSAYSRGVFRR; SEQ ID NO: 98).
250 ng mã hóa mRNA đã sửa đổi, mỗi biến thể G-CSF đã được chuyển thành HEK293A (293A trong bảng), myoblast chuột (MM trong bảng) (C2C12, CRL-1772, ATCC) và myoblast chuột (RM trong bảng) (L6 dòng tế bào, CRL-1458, ATCC) trong đĩa 24 giếng sử dụng 1 ul Lipofectamine 2000 (Life Technologies), mỗi giếng chứa 300.000 tế bào. Chất nổi trên bề mặt được thu hoạch sau 24 giờ và protein G-CSF tiết ra được phân tích bằng ELISA bằng cách sử dụng bộ ELISA Human G-CSF (Life Technologies). Dữ liệu được trình bày trong Bảng 76 cho thấy rằng các tế bào được thay thế G-CSF mmRNA mã hóa peptit tín hiệu Albumin tiết ra protein G-CSF nhiều hơn ít nhất 12 lần so với loại tế bào hoang dã của nó.
Ví dụ 56. Nghiên cứu Cytokine: PBMC
A. Sự cô lập và văn hóa PBMC
50 mL máu người từ hai người hiến đã được nhận từ Thành phần Máu Nghiên cứu (lô KP30928 và KP30931) trong ống natri heparin. Đối với mỗi người hiến, máu được gộp lại và pha loãng thành 70 mL bằng DPBS (SAFC Bioscience 59331C, lô 071M8408) và chia đều cho hai ống hình nón 50 mL. 10 mL Ficoll Paque (GE Healthcare 17-5442-03, lô 10074400) được phân phối nhẹ nhàng bên dưới lớp máu. Các ống được ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 30 phút với khả năng tăng tốc và phanh chậm. Các ống được lấy ra và các lớp PBMC lớp đệm được nhẹ nhàng chuyển sang hình nón 50 mL mới và rửa bằng DPBS. Các ống được ly tâm ở tốc độ 1450 vòng/phút trong 10 phút.
Chất nổi phía trên được hút ra và các viên PBMC được hòa lại và rửa trong 50 mL DPBS. Các ống được ly tâm ở tốc độ 1250 vòng/phút trong 10 phút. Bước rửa này được lặp lại và các viên PBMC được hòa lại trong 19 mL Optimem I (Gibco 11058, lô 1072088) và được đếm. Huyền phù tế bào được điều chỉnh đến nồng độ 3,0×10{circumflex trên ( )}6 tế bào/mL tế bào sống.
Sau đó, những tế bào này được đặt trên năm đĩa đáy tròn được xử lý nuôi cấy mô 96 giếng (Costar 3799) cho mỗi người hiến ở mức 50 uL mỗi giếng. Trong vòng 30 phút, hỗn hợp chuyển nhiễm được thêm vào từng giếng với thể tích 50 uL mỗi giếng. Sau 4 giờ sau khi truyền máu, môi trường được bổ sung 10 uL Huyết thanh Bò bào thai (Gibco 10082, lô 1012368)
B. Chuẩn bị truyền máu
mmRNA mã hóa G-CSF của con người (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1) (chứa (1) NTP tự nhiên, (2) thay thế 100% bằng 5-metyl cytidine và pseudouridine, hoặc (3) thay thế 100% bằng 5-metyl cytidine và N1-metyl-pseudouridine; luciferaza mã hóa mmRNA (trình tự IVT cDNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917 , đuôi polyA gồm khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine ở mỗi vị trí uridine) (chứa (1) NTP tự nhiên hoặc (2) thay thế 100% với 5-methyl cytidine và pseudouridine) và chất chủ vận TLR R848 (Invivogen tlrl-r848) được pha loãng thành 38,4 ng/uL trong thể tích cuối cùng là 2500 uL Optimem I.
Riêng biệt, 432 uL Lipofectamine 2000 (Invitrogen 11668-027, lô 1070962) được pha loãng với 13,1 mL Optimem I. Trong đĩa 96 giếng, chín phần 135 uL của mỗi mmRNA, đối chứng dương (R-848) hoặc đối chứng âm (Optimem I) được thêm vào 135 uL Lipofectamine 2000 đã pha loãng. Đĩa chứa vật liệu cần chuyển nhiễm được ủ trong 20 phút. Sau đó, hỗn hợp chuyển nhiễm được chuyển sang từng đĩa PBMC của người ở mức 50 uL mỗi giếng. Sau đó, các đĩa được ủ ở 37 C. Vào lúc 2, 4, 8, 20 và 44 giờ, mỗi đĩa được lấy ra khỏi tủ ấm và phần nổi phía trên được đông lạnh.
Sau khi lấy đĩa cuối cùng ra, phần nổi phía trên được phân tích bằng bộ ELISA G-CSF của người (Invitrogen KHC2032) và bộ ELISA IFN-alpha của người (Thermo Scientific 41105-2). Mỗi điều kiện được thực hiện trùng lặp.
C. Kết quả
Khả năng tạo ra protein mã hóa (mmRNA) của mRNA không biến đổi và đã biến đổi đã được đánh giá (sản xuất G-CSF) theo thời gian cũng như khả năng mRNA kích hoạt khả năng nhận biết miễn dịch bẩm sinh được đo bằng quá trình sản xuất interferon-alpha. Sử dụng môi trường nuôi cấy PBMC in vitro là một cách được chấp nhận để đo khả năng kích thích miễn dịch của oligonucleotide (Robbins và cộng sự, Oligonucleotides 2009 19:89-102; được đưa toàn bộ vào đây bằng cách viện dẫn).
Các kết quả được nội suy theo đường cong chuẩn của từng tấm ELISA bằng cách sử dụng đường cong logistic bốn thông số phù hợp. Thể hiện trong Bảng 77 và 78 là giá trị trung bình từ 2 nhà tài trợ PBMC riêng biệt sản xuất G-CSF và IFN-alpha theo thời gian được đo bằng ELISA cụ thể.
Trong ELISA G-CSF, tín hiệu nền từ tình trạng Lipofectamine 2000 chưa được điều trị đã bị trừ ở mỗi mốc thời gian. Dữ liệu đã chứng minh khả năng sản xuất cụ thể protein G-CSF của con người bằng đơn nhân máu ngoại vi của con người được thấy bằng mRNA G-CSF chứa NTP tự nhiên, thay thế 100% bằng 5-methyl cytidine và pseudouridine, hoặc thay thế 100% bằng 5-methyl cytidine và N1- metyl-pseudouridin. Việc sản xuất G-CSF đã tăng lên đáng kể thông qua việc sử dụng mRNA đã biến đổi so với mRNA không biến đổi, với 5-methyl cytidine và N1-methyl-pseudouridine chứa G-CSF mmRNA cho thấy mức sản xuất G-CSF cao nhất. Liên quan đến khả năng nhận biết miễn dịch bẩm sinh, mRNA không biến đổi dẫn đến sản xuất IFN-alpha đáng kể, trong khi mRNA biến đổi phần lớn ngăn cản việc sản xuất interferon-alpha. MRNA G-CSF được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methyl cytidine và N1-methyl-pseudouridine không làm tăng đáng kể các cytokine trong khi G-CSF mRNA được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methyl cytidine và pseudouridine tạo ra IFN-alpha, TNF-alpha và IP10. Nhiều cytokine khác không bị ảnh hưởng bởi cả hai sửa đổi này.
Ví dụ 57. Phạm vi biến đổi hóa học của mRNA biến đổi
Các nucleotide được biến đổi, chẳng hạn như, nhưng không giới hạn ở, các biến đổi hóa học 5-methylcytosine và pseudouridine đã được chứng minh là làm giảm phản ứng miễn dịch bẩm sinh và tăng biểu hiện RNA trong tế bào động vật có vú. Điều đáng ngạc nhiên là chưa được biết đến trước đây, những tác động biểu hiện bằng các biến đổi hóa học có thể được chuẩn độ khi lượng biến đổi hóa học nhỏ hơn 100%. Trước đây, người ta tin rằng việc sửa đổi hoàn toàn là cần thiết và đủ để tạo ra những tác động có lợi của việc sửa đổi hóa học và việc sửa đổi ít hơn 100% mRNA sẽ ít có tác dụng. Tuy nhiên, hiện nay người ta đã chứng minh rằng lợi ích của việc biến đổi hóa học có thể đạt được bằng cách sử dụng ít biến đổi hoàn toàn hơn và các tác động này phụ thuộc vào mục tiêu, nồng độ và sự biến đổi.
A. RNA biến đổi được chuyển vào PBMC
960 ng mRNA G-CSF được biến đổi bằng 5-methylcytosine (5 mC) và pseudouridine (pseudoU) hoặc mRNA G-CSF không biến đổi đã được chuyển nhiễm 0,8 uL Lipofectamine 2000 vào các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) từ ba người hiến máu bình thường (D1 , D2, D3). MRNA G-CSF (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) đã được biến đổi hoàn toàn với 5 mC và pseudoU (sửa đổi 100%), không được biến đổi với 5 mC và pseudoU (sửa đổi 0%) hoặc được sửa đổi một phần với 5 mC và pseudoU nên mRNA sẽ chứa sửa đổi 50%, sửa đổi 25%, sửa đổi 10%, sửa đổi %5, sửa đổi 1% hoặc sửa đổi 0,1%. Mẫu đối chứng của Luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; 5meC và pseudoU được biến đổi hoàn toàn) cũng được phân tích để biểu hiện G-CSF. Đối với các mẫu kiểm soát TNF-alpha và IFN-alpha của Lipofectamine2000, LPS, R-848, Luciferase (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1; được sửa đổi hoàn toàn 5 mC và giả), và P(I)P(C) cũng được phân tích. Chất nổi phía trên được ELISA thu hoạch và chạy 22 giờ sau khi truyền để xác định biểu hiện protein. Sự biểu hiện của G-CSF được thể hiện trong Bảng 79 và sự biểu hiện của IFN-alpha và TNF-alpha được thể hiện trong Bảng 80. Sự biểu hiện của IFN-alpha và TNF-alpha có thể là tác động phụ từ sự chuyển gen của G- mARN CSF. Bảng 79 và 80 cho thấy mức độ biến đổi hóa học của G-CSF, IFN-alpha và TNF-alpha có thể chuẩn độ được khi mRNA không bị biến đổi hoàn toàn và xu hướng chuẩn độ không giống nhau đối với từng mục tiêu.
B. RNA biến đổi được chuyển vào HEK293
Các tế bào biểu mô thận phôi người (HEK293) được gieo vào các đĩa 96 giếng với mật độ 30.000 tế bào mỗi giếng trong môi trường nuôi cấy tế bào 100 ul. 250 ng mRNA G-CSF biến đổi (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1) được tạo công thức bằng RNAiMAX™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) đã được thêm vào một cái giếng. G-CSF đã được sửa đổi hoàn toàn với 5 mC và pseudoU (sửa đổi 100%), không được sửa đổi với 5 mC và pseudoU (sửa đổi 0%) hoặc được sửa đổi một phần với 5 mC và pseudoU để mRNA sẽ chứa 75% sửa đổi, 50% sửa đổi hoặc sửa đổi 25%. Các mẫu đối chứng (AK 5/2, mCherry mRNA (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1; được sửa đổi hoàn toàn 5 mC và pseudoU) và chưa được xử lý) đã phân tích. Thời gian bán hủy của G-CSF mRNA được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và pseudouridine là khoảng 8-10 giờ. Chất nổi phía trên được thu hoạch sau 16 giờ và protein G-CSF tiết ra được phân tích bằng ELISA. Bảng 81 cho thấy lượng biến đổi hóa học của G-CSF có thể chuẩn độ được khi mRNA không được biến đổi hoàn toàn.
Ví dụ 58: Phân phối mRNA đã sửa đổi (mmRNA) trong Vivo
RNA biến đổi được chuyển đến chuột C57/BL6 theo đường tiêm bắp, tiêm dưới da hoặc tiêm tĩnh mạch để đánh giá sự phân bố sinh học của RNA biến đổi bằng cách sử dụng luciferase. Dung dịch đệm công thức được sử dụng với tất cả các phương pháp phân phối chứa 150 mM natri clorua, 2 mM canxi clorua, 2 mM Na+-phosphate bao gồm 1,4 mM natri photphat đơn bazơ và 0,6 mM natri photphat dibasic và 0,5 mM axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA) được điều chỉnh bằng cách sử dụng natri hydroxit để đạt độ pH cuối cùng là 6,5 trước khi được lọc và khử trùng. Nồng độ 1× được sử dụng làm chất đệm phân phối. Để tạo ra dung dịch lipoplexed được cung cấp cho chuột, trong một lọ 50 μg RNA đã được cân bằng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng trong đệm phân phối và trong lọ thứ hai, 10 μl RNAiMAX™ đã được cân bằng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng trong đệm phân phối . Sau khi cân bằng, các lọ được kết hợp và dung dịch đệm phân phối được thêm vào để đạt thể tích cuối cùng là 100 µl, sau đó được ủ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Luciferin được sử dụng bằng cách tiêm trong màng bụng (IP) với liều 150 mg/kg cho mỗi con chuột trước khi chụp ảnh trong giai đoạn ổn định của đường cong tiếp xúc với luciferin trong khoảng từ 15 đến 30 phút. Để tạo ra luciferin, 1 g D-luciferin kali hoặc muối natri được hòa tan trong 66,6 ml dung dịch đệm phosphat chưng cất (DPBS), không chứa Mg2+ hoặc Ca2+, để tạo thành dung dịch 15 mg/ml. Dung dịch được trộn nhẹ nhàng và đi qua bộ lọc ống tiêm 0,2 μm, trước khi được làm sạch bằng nitơ, chia nhỏ và đông lạnh ở −80° C. trong khi được bảo vệ khỏi ánh sáng càng nhiều càng tốt. Dung dịch được làm tan băng bằng cách sử dụng nồi cách thủy nếu luciferin không được hòa tan, trộn nhẹ và giữ trên đá vào ngày dùng thuốc.
Hình ảnh toàn bộ cơ thể được chụp của mỗi con chuột 2, 8 và 24 giờ sau khi dùng thuốc. Hình ảnh mô và huyết thanh được thu thập từ mỗi con chuột 24 giờ sau khi dùng thuốc. Chuột được tiêm tĩnh mạch đã được chụp ảnh gan, lá lách, thận, phổi, tim, mô mỡ quanh thận và tuyến ức. Chuột được tiêm bắp hoặc tiêm dưới da có gan, lá lách, thận, phổi, mô mỡ quanh thận và cơ tại chỗ tiêm. Từ hình ảnh toàn bộ cơ thể, độ phát quang sinh học được đo bằng photon trên giây cho từng đường dùng và chế độ dùng thuốc.
A. Tiêm bắp
Chuột được tiêm bắp (I.M.) hoặc mRNA luciferase biến đổi được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (Naked-Luc), mRNA luciferase biến đổi lipoplexed được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và pseudouridine (Lipoplex-luc) (Trình tự IVT cDNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine tại mỗi vị trí uridine), lipoplexed mRNA của yếu tố kích thích tạo thành bạch cầu hạt biến đổi (G-CSF) (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) ( Lipoplex-Cytokine) hoặc chất đệm hình thành với một liều duy nhất 50 μg RNA biến đổi trong thể tích tiêm 50 μl cho mỗi công thức ở chi sau bên phải và một liều duy nhất 5 μg RNA biến đổi trong thể tích tiêm 50 μl ở chi sau bên trái. Mức phát quang sinh học trung bình của các tín hiệu biểu hiện luciferase cho mỗi nhóm vào lúc 2, 8 và 24 giờ sau khi dùng thuốc được thể hiện trong Bảng 82. Sự phát quang sinh học cho thấy tín hiệu dương tính tại vị trí tiêm của công thức RNA biến đổi 5 μg và 50 μg có chứa và không chứa lipoplex.
B. Tiêm dưới da
Chuột được tiêm dưới da (S.C.) hoặc mRNA luciferase biến đổi (Naked-Luc), mRNA luciferase biến đổi lipoplexed (Lipoplex-luc), mRNA G-CSF biến đổi lipoplexed (Lipoplex-G-CSF) hoặc chất đệm hình thành ở một liều duy nhất 50 μg mRNA biến đổi trong thể tích tiêm 100 μl cho mỗi công thức. Mức phát quang sinh học trung bình của các tín hiệu biểu hiện luciferase cho mỗi nhóm vào lúc 2, 8 và 24 giờ sau khi dùng liều được thể hiện trong Bảng 83. Sự phát quang sinh học cho thấy tín hiệu tích cực tại vị trí tiêm của công thức mRNA biến đổi 50 μg có chứa và không chứa lipoplex.
C. Tiêm tĩnh mạch
Chuột được tiêm tĩnh mạch (IV) hoặc mRNA luciferase biến đổi (Naked-Luc), mRNA luciferase biến đổi lipoplexed (Lipoplex-luc), mRNA G-CSF biến đổi lipoplexed (Lipoplex-G-CSF) hoặc chất đệm hình thành với một liều duy nhất 50 μg mRNA biến đổi trong thể tích tiêm 100 μl cho mỗi công thức. Mức phát quang sinh học trung bình của tín hiệu biểu hiện luciferase ở lá lách từ mỗi nhóm vào lúc 2 giờ sau khi dùng liều được thể hiện trong Bảng 84. Sự phát quang sinh học cho thấy tín hiệu tích cực ở lá lách của công thức mRNA biến đổi 50 μg có chứa lipoplex.
Ví dụ 59. Nghiên cứu công thức đệm
MRNA được biến đổi G-CSF (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với N1-pseudouridine và 5-methylcytosine) hoặc mRNA được biến đổi Yếu tố IX ( trình tự mARN thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn bằng N1-pseudouridine và 5-methylcytosine) trong dung dịch đệm được tiêm bắp cho chuột cống. thể tích 50 μl (n=5) với liều mRNA biến đổi là 200 ug trên mỗi con chuột như được mô tả trong Bảng 85. MRNA biến tính được đông khô trong nước trong 1-2 ngày. Sau đó nó được hoàn nguyên trong các dung dịch đệm được liệt kê dưới đây tới nồng độ mục tiêu là 6 mg/ml. Nồng độ được xác định bằng OD 260. Mẫu được pha loãng đến 4 mg/ml trong dung dịch đệm thích hợp trước khi dùng thuốc.
Để kết tủa mRNA biến tính, thêm natri axetat 3M, pH 5,5 và etanol nguyên chất vào tỷ lệ 1/10quần quètổng khối lượng và gấp 4 lần tổng khối lượng mRNA biến đổi tương ứng. Vật liệu được đặt ở -80C trong tối thiểu 1 giờ. Vật liệu sau đó được ly tâm trong 30 phút ở tốc độ 4000 vòng/phút, 4C. Phần nổi phía trên được loại bỏ và cặn được ly tâm và rửa 3 lần bằng etanol 75%. Cuối cùng, viên này được hoàn nguyên bằng dung dịch đệm đến nồng độ mục tiêu là 6 mg/ml. Nồng độ được xác định bằng OD 260. Mẫu được pha loãng đến 4 mg/ml trong dung dịch đệm thích hợp trước khi dùng thuốc. Tất cả các mẫu được chuẩn bị bằng phương pháp đông khô trừ khi có ghi chú dưới đây.
Các mẫu huyết thanh được thu thập từ chuột ở các khoảng thời gian khác nhau và được phân tích biểu hiện protein G-CSF hoặc Yếu tố IX bằng cách sử dụng ELISA G-CSF hoặc Yếu tố IX.
Ví dụ 60. Nghiên cứu đa liều
Chuột Sprague-Dawley (n=8) được tiêm tĩnh mạch tám lần (hai lần một tuần) trong 28 ngày. Chuột được tiêm 0,5 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,005 mg/kg hoặc 0,0005 mg/kg mRNA đã biến đổi G-CSF của con người của mRNA biến đổi luciferase được tạo thành trong hạt nano lipid, 0,5 mg/kg G-CSF của con người mRNA biến đổi trong nước muối, 0,2 mg/kg protein G-CSF Neupogen của con người hoặc mRNA biến đổi G-CSF của con người không thể dịch mã được tạo thành trong hạt nano lipid. Huyết thanh được thu thập trong khoảng thời gian xác định trước để đánh giá biểu hiện protein G-CSF (8, 24 và 72 giờ sau liều đầu tiên trong tuần), công thức máu toàn phần và số lượng bạch cầu (24 và 72 giờ sau liều đầu tiên của tuần). tuần) và hóa học lâm sàng (24 và 72 giờ sau liều đầu tiên trong tuần). Chuột được giết vào ngày thứ 29, 4 ngày sau liều cuối cùng, để xác định công thức máu toàn phần, số lượng bạch cầu, hóa học lâm sàng, biểu hiện protein và để đánh giá tác động lên các cơ quan chính bằng mô bệnh học và khám nghiệm tử thi. Hơn nữa, xét nghiệm kháng thể được thực hiện trên chuột vào ngày 29.
Ví dụ 61. Nghiên cứu LNP In Vivo
MRNA được biến đổi bởi Luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự, nắp 5′, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine được tạo ra dưới dạng hạt nano lipid (LNP) bằng cách sử dụng phương pháp bơm ống tiêm. LNP được bào chế theo tỷ lệ trọng lượng 20:1 của tổng lipid và mRNA đã biến đổi với tỷ lệ mol lipid cuối cùng là 50:10:38,5:1,5 (DLin-KC2-DMA: DSPC: Cholesterol: PEG-DMG) Như được thể hiện trong Bảng 86, công thức LNP luciferase được đặc trưng bởi kích thước hạt, thế zeta và khả năng đóng gói.
Như được nêu trong Bảng 87, công thức LNP luciferase được sử dụng cho chuột Balb-C (n=3) theo đường tiêm bắp, trong tĩnh mạch và dưới da và ARN biến đổi luciferase được tạo ra trong PBS được sử dụng cho chuột qua đường tĩnh mạch.
Những con chuột sử dụng công thức LNP luciferase theo đường tiêm tĩnh mạch và tiêm bắp được chụp ảnh vào lúc 2, 8, 24, 48, 120 và 192 giờ và những con chuột sử dụng công thức LNP luciferase dưới da được chụp ảnh vào lúc 2, 8, 24, 48 và 120 giờ để xác định luciferase như được thể hiện trong Bảng 88. Trong Bảng 88, “NT” có nghĩa là không được thử nghiệm. Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột.
Một con chuột được tiêm tĩnh mạch công thức LNP đã bị giết vào lúc 8 giờ để xác định biểu hiện luciferase ở gan và lá lách. Ngoài ra, một con chuột được tiêm bắp theo công thức LNP đã bị giết vào lúc 8 giờ để xác định biểu hiện luciferase của cơ xung quanh vị trí tiêm và ở gan và lá lách. Như được trình bày trong Bảng 89, biểu hiện được thấy ở cả gan và lá lách sau khi tiêm tĩnh mạch và tiêm bắp và ở cơ xung quanh vị trí tiêm bắp.
Ví dụ 62. Nghiên cứu Cytokine: PBMC
A. Sự cô lập và văn hóa PBMC
50 mL máu người từ hai người hiến đã được nhận từ Thành phần Máu Nghiên cứu (lô KP30928 và KP30931) trong ống natri heparin. Đối với mỗi người hiến, máu được gộp lại và pha loãng thành 70 mL bằng DPBS (SAFC Bioscience 59331C, lô 071M8408) và chia đều cho hai ống hình nón 50 mL. 10 mL Ficoll Paque (GE Healthcare 17-5442-03, lô 10074400) được phân phối nhẹ nhàng bên dưới lớp máu. Các ống được ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 30 phút với khả năng tăng tốc và phanh chậm. Các ống được lấy ra và các lớp PBMC lớp đệm được nhẹ nhàng chuyển sang hình nón 50 mL mới và rửa bằng DPBS. Các ống được ly tâm ở tốc độ 1450 vòng/phút trong 10 phút.
Chất nổi phía trên được hút ra và các viên PBMC được hòa lại và rửa trong 50 mL DPBS. Các ống được ly tâm ở tốc độ 1250 vòng/phút trong 10 phút. Bước rửa này được lặp lại và các viên PBMC được hòa lại trong 19 mL Optimem I (Gibco 11058, lô 1072088) và được đếm. Huyền phù tế bào được điều chỉnh đến nồng độ 3,0×10{circumflex trên ( )}6 tế bào/mL tế bào sống.
Sau đó, những tế bào này được đặt trên năm đĩa đáy tròn được xử lý nuôi cấy mô 96 giếng (Costar 3799) cho mỗi người hiến ở mức 50 uL mỗi giếng. Trong vòng 30 phút, hỗn hợp chuyển nhiễm được thêm vào từng giếng với thể tích 50 uL mỗi giếng. Sau 4 giờ sau khi truyền máu, môi trường được bổ sung 10 uL Huyết thanh Bò bào thai (Gibco 10082, lô 1012368).
B. Chuẩn bị truyền máu
G-CSF của con người mã hóa mRNA đã sửa đổi (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1) (chứa (1) NTP tự nhiên, (2) thay thế 100% với 5-metyl cytidine và pseudouridine, hoặc (3) thay thế 100% bằng 5-metyl cytidine và N1-metyl-pseudouridine; mARN mã hóa luciferaza (trình tự IVT cDNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31916; trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917, đuôi polyA gồm khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự, 5′cap, Cap1, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine ở mỗi lần thay thế cytosine và pseudouridine ở mỗi vị trí uridine) (chứa (1) NTP tự nhiên hoặc (2) 100% thay thế bằng 5-methyl cytidine và pseudouridine) và chất chủ vận TLR R848 (Invivogen tlrl-r848) được pha loãng thành 38,4 ng/uL trong thể tích cuối cùng là 2500 uL Optimem I.
Riêng biệt, 110 uL Lipofectamine 2000 (Invitrogen 11668-027, lô 1070962) được pha loãng với 6,76 mL Optimem I. Trong đĩa 96 giếng, chín phần 135 uL của mỗi mRNA, đối chứng dương (R-848) hoặc đối chứng âm (Optimem I) được thêm vào 135 uL Lipofectamine 2000 đã pha loãng. Đĩa chứa vật liệu cần chuyển nhiễm được ủ trong 20 phút. Sau đó, hỗn hợp chuyển nhiễm được chuyển sang từng đĩa PBMC của người ở mức 50 uL mỗi giếng. Sau đó, các đĩa được ủ ở 37° C. Vào lúc 2, 4, 8, 20 và 44 giờ, mỗi đĩa được lấy ra khỏi tủ ấm và phần nổi phía trên được đông lạnh.
Sau khi lấy đĩa cuối cùng ra, phần nổi phía trên được phân tích bằng bộ ELISA G-CSF của người (Invitrogen KHC2032) và bộ ELISA IFN-alpha của người (Thermo Scientific 41105-2). Mỗi điều kiện được thực hiện trùng lặp.
C. Phân tích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và protein
Khả năng của mRNA chưa biến đổi và đã biến đổi để tạo ra protein được mã hóa đã được đánh giá (sản xuất G-CSF) theo thời gian cũng như khả năng của mRNA kích hoạt sự nhận biết miễn dịch bẩm sinh được đo bằng quá trình sản xuất interferon-alpha. Sử dụng nuôi cấy PBMC in vitro là một cách được chấp nhận để đo khả năng kích thích miễn dịch của oligonucleotide (Robbins và cộng sự, Oligonucleotides 2009 19:89-102).
Các kết quả được nội suy theo đường cong chuẩn của từng tấm ELISA bằng cách sử dụng đường cong logistic bốn thông số phù hợp. Trong Bảng 90 và 91 là giá trị trung bình từ 3 nhà tài trợ PBMC riêng biệt của G-CSF, interferon-alpha (IFN-alpha) và sản xuất yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-alpha) theo thời gian được đo bằng ELISA cụ thể.
Trong ELISA G-CSF, tín hiệu nền từ tình trạng chưa được điều trị bằng Lipofectamine 2000 (LF2000) đã bị trừ tại mỗi thời điểm. Dữ liệu đã chứng minh khả năng sản xuất cụ thể protein G-CSF của con người bằng đơn nhân máu ngoại vi của con người được thấy bằng mRNA G-CSF chứa NTP tự nhiên, thay thế 100% bằng 5-methyl cytidine và pseudouridine, hoặc thay thế 100% bằng 5-methyl cytidine và N1- metyl-pseudouridin. Việc sản xuất G-CSF đã tăng lên đáng kể thông qua việc sử dụng mRNA biến đổi 5-methyl cytidine và N1-methyl-pseudouridine so với mRNA biến đổi 5-methyl cytidine và pseudouridine.
Liên quan đến khả năng nhận biết miễn dịch bẩm sinh, trong khi cả hai hóa chất mRNA biến đổi đều ngăn cản phần lớn việc sản xuất IFN-alpha và TNF-alpha so với các biện pháp kiểm soát dương tính (R848, p(I)p(C)), vẫn tồn tại sự khác biệt đáng kể giữa các hóa chất. MRNA biến đổi 5-methyl cytidine và pseudouridine dẫn đến mức sản xuất IFN-alpha và TNF-alpha thấp nhưng có thể phát hiện được, trong khi mRNA biến đổi 5-methyl cytidine và N1-methyl-pseudouridine dẫn đến không sản xuất IFN-alpha và TNF-alpha có thể phát hiện được.
Do đó, người ta đã xác định rằng, ngoài nhu cầu xem xét nhiều hơn một dấu hiệu cytokine về việc kích hoạt phản ứng miễn dịch bẩm sinh, người ta còn ngạc nhiên khi phát hiện ra rằng sự kết hợp của các sửa đổi mang lại các mức độ phản ứng tế bào khác nhau (sản xuất protein và kích hoạt miễn dịch). ). Sự biến đổi, N1-methyl-pseudouridine, trong nghiên cứu này đã được chứng minh là mang lại sự bảo vệ bổ sung đối với sự kết hợp tiêu chuẩn của 5-methylcytidine/pseudouridine được những người khác khám phá, dẫn đến lượng protein nhiều gấp đôi và giảm gần 150 lần hoạt động miễn dịch (TNF-alpha). ).
Cho rằng PBMC chứa một lượng lớn các cảm biến nhận dạng RNA miễn dịch bẩm sinh và cũng có khả năng dịch mã protein, nó cung cấp một hệ thống hữu ích để kiểm tra sự phụ thuộc lẫn nhau của hai con đường này. Người ta biết rằng quá trình dịch mã mRNA có thể bị ảnh hưởng tiêu cực khi kích hoạt các con đường miễn dịch bẩm sinh như vậy (Kariko và cộng sự. Immunity (2005) 23:165-175; Warren và cộng sự. Tế bào gốc tế bào (2010) 7:618-630). Sử dụng PBMC làm hệ thống xét nghiệm in vitro, có thể thiết lập mối tương quan giữa dịch mã (trong trường hợp này là sản xuất protein G-CSF) và sản xuất cytokine (trong trường hợp này được minh họa bằng sản xuất protein IFN-alpha và TNF-alpha). Sản xuất protein tốt hơn có tương quan với việc tạo ra con đường kích hoạt miễn dịch bẩm sinh thấp hơn và các hóa chất mới có thể được đánh giá thuận lợi dựa trên tỷ lệ này (Bảng 92).
Trong nghiên cứu này, Tỷ lệ PC cho hai biến đổi hóa học, pseudouridine và N1-methyl-pseudouridine, cả hai đều có 5-methy cytosine là 4742/141=34 so với 9944/1=9944 đối với cytokine IFN-alpha. Đối với cytokine, TNF-alpha, hai chất hóa học này có Tỷ lệ PC lần lượt là 153 và 1243, cho thấy rằng đối với cả hai cytokine, N1-methyl-pseudouridine là dạng biến đổi vượt trội. Trong Bảng 90 và 91, “NT” có nghĩa là chưa được kiểm tra.
Ví dụ 63. Nghiên cứu PBMC trong ống nghiệm: Phần trăm sửa đổi
480 ng mRNA G-CSF được biến đổi bằng 5-methylcytosine (5 mC) và pseudouridine (pseudoU) hoặc mRNA G-CSF chưa biến đổi đã được chuyển nhiễm 0,4 uL Lipofectamine 2000 vào các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) từ ba người hiến máu bình thường (D1 , D2 và D3). MRNA G-CSF (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) đã được biến đổi hoàn toàn với 5 mC và pseudoU (sửa đổi 100%), không được biến đổi với 5 mC và pseudoU (sửa đổi 0%) hoặc được sửa đổi một phần với 5 mC và pseudoU nên mRNA sẽ chứa 75% sửa đổi, 50% sửa đổi hoặc 25% sửa đổi. Mẫu đối chứng của Luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; 5meC và pseudoU được biến đổi hoàn toàn) cũng được phân tích để biểu hiện G-CSF. Đối với các mẫu kiểm soát TNF-alpha và IFN-alpha của Lipofectamine2000, LPS, R-848, Luciferase (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1; được sửa đổi hoàn toàn 5 mC và giả), và P(I)P(C) cũng được phân tích. Chất nổi phía trên được ELISA thu hoạch và chạy 22 giờ sau khi truyền để xác định biểu hiện protein. Sự biểu hiện của G-CSF được thể hiện trong Bảng 93 và sự biểu hiện của IFN-alpha và TNF-alpha được thể hiện trong Bảng 94. Sự biểu hiện của IFN-alpha và TNF-alpha có thể là hiệu ứng phụ từ sự chuyển gen của G- mARN CSF. Bảng 93 và 94 cho thấy mức độ biến đổi hóa học của G-CSF, interferon alpha (IFN-alpha) và yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-alpha) có thể chuẩn độ được khi mRNA không được biến đổi hoàn toàn và xu hướng chuẩn độ không phải là giống nhau cho từng mục tiêu.
Bằng cách sử dụng PBMC làm hệ thống xét nghiệm in vitro, có thể thiết lập mối tương quan giữa dịch mã (trong trường hợp này là sản xuất protein G-CSF) và sản xuất cytokine (trong trường hợp này được minh họa bằng sản xuất protein IFN-alpha). Sản xuất protein tốt hơn có tương quan với việc gây ra con đường kích hoạt miễn dịch bẩm sinh thấp hơn và phần trăm biến đổi hóa học có thể được đánh giá là thuận lợi dựa trên tỷ lệ này (Bảng 95). Như đã tính toán từ Bảng 93 và 94 và được thể hiện trong Bảng 95, sự biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytidine và pseudouridine cho thấy tỷ lệ sản xuất protein/cytokine tốt hơn nhiều so với khi không có bất kỳ sự biến đổi nào (mRNA G-CSF tự nhiên) (gấp 100 lần đối với IFN-alpha và 27 lần đối với TNF-alpha). Sửa đổi một phần cho thấy mối quan hệ tuyến tính với sự sửa đổi ngày càng ít hơn dẫn đến tỷ lệ protein/cytokine thấp hơn.
Ví dụ 64. RNA biến đổi được chuyển hóa trong PBMC
500 ng mRNA G-CSF được biến đổi bằng 5-methylcytosine (5 mC) và pseudouridine (pseudoU) hoặc mRNA G-CSF không biến đổi đã được chuyển nhiễm 0,4 uL Lipofectamine 2000 vào các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) từ ba người hiến máu bình thường (D1 , D2 và D3). MRNA G-CSF (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) đã được biến đổi hoàn toàn với 5 mC và pseudoU (sửa đổi 100%), không được biến đổi với 5 mC và pseudoU (sửa đổi 0%) hoặc được sửa đổi một phần với 5 mC và pseudoU nên mRNA sẽ chứa sửa đổi 50%, sửa đổi 25%, sửa đổi 10%, sửa đổi %5, sửa đổi 1% hoặc sửa đổi 0,1%. Mẫu đối chứng của mCherry (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; 5meC và pseudouridine được biến đổi hoàn toàn), G-CSF được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (G-CSF đối chứng) và đối chứng không được điều trị cũng được phân tích để tìm biểu hiện của G-CSF, yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-alpha) và interferon-alpha (IFN-alpha). Chất nổi phía trên được thu hoạch 6 giờ và 18 giờ sau khi truyền máu và chạy ELISA để xác định biểu hiện protein. Biểu hiện của G-CSF, IFN-alpha và TNF-alpha đối với Nhà tài trợ1được thể hiện trong Bảng 96, Nhà tài trợ 2 được thể hiện trong Bảng 97 và Nhà tài trợ3được thể hiện trong Bảng 98.
Sửa đổi hoàn toàn 100% với 5-methylcytidine và pseudouridine dẫn đến sự dịch mã protein (G-CSF) nhiều nhất và lượng cytokine được tạo ra ít nhất trên cả ba nhà tài trợ PBMC ở người. Việc giảm số lượng biến đổi dẫn đến sản xuất nhiều cytokine hơn (IFN-alpha và TNF-alpha), do đó nhấn mạnh thêm tầm quan trọng của việc biến đổi hoàn toàn để giảm các cytokine và cải thiện quá trình dịch mã protein (được chứng minh ở đây bằng việc sản xuất G-CSF).
Ví dụ 65. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch bẩm sinh ở nguyên bào sợi BJ
A. Truyền máu một lần
Nguyên bào sợi bao quy đầu nguyên phát ở người (nguyên bào sợi BJ) được lấy từ Bộ sưu tập Văn hóa Kiểu Mỹ (ATCC) (danh mục #CRL-2522) và được nuôi cấy trong Môi trường Thiết yếu Tối thiểu của Eagle (ATCC, danh mục số 30-2003) được bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai ở tuổi 37 ° C., dưới 5% CO2. Nguyên bào sợi BJ được gieo vào đĩa 24 giếng với mật độ 300.000 tế bào mỗi giếng trong 0,5 ml môi trường nuôi cấy. 250 ng mRNA G-CSF biến đổi (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (Gen1) hoặc được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine (Gen2) có Cap0, Cap1 hoặc không có nắp được chuyển nhiễm bằng cách sử dụng Lipofectamine 2000 (Invitrogen, danh mục số 11668-019), theo quy trình của nhà sản xuất. Các mẫu đối chứng của poly I:C (PIC), Lipofectamine 2000 (Lipo), mARN luciferase tự nhiên (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) và các mẫu tự nhiên MRNA G-CSF cũng được thay thế. Các tế bào được thu hoạch sau 18 giờ, RNA tổng số được phân lập và DNASE® được xử lý bằng bộ micro RNeasy (danh mục #74004) theo quy trình của nhà sản xuất. 100 ng tổng số RNA đã được sử dụng để tổng hợp cDNA bằng cách sử dụng bộ Phiên mã ngược cDNA công suất cao (danh mục số 4368814) theo giao thức của nhà sản xuất. Sau đó, cDNA được phân tích để biểu hiện các gen phản ứng miễn dịch bẩm sinh bằng PCR định lượng thời gian thực bằng SybrGreen trong thiết bị Biorad CFX 384 theo quy trình của nhà sản xuất. Bảng 99 thể hiện mức độ biểu hiện của các bản phiên mã đáp ứng miễn dịch bẩm sinh so với gen giữ nhà HPRT (hypoxanthinephosphoribosytransferase) và được biểu thị dưới dạng cảm ứng gấp so với HPRT. Trong bảng, bảng chỉ số tiêu chuẩn bao gồm: RIG-I là gen cảm ứng axit retinoic 1, IL6 là interleukin-6, OAS-1 là oligoadenylate synthetase 1, IFNb là interferon-beta, AIM2 không có trong khối u ác tính-2, IFIT -1 là protein do interferon gây ra với tetratricopeptide lặp lại 1, PKR là protein kinase R, TNFa là yếu tố hoại tử khối u alpha và IFNa là interferon alpha.
B. Lặp lại việc truyền máu
Nguyên bào sợi bao quy đầu nguyên phát ở người (nguyên bào sợi BJ) được lấy từ Bộ sưu tập Văn hóa Kiểu Mỹ (ATCC) (danh mục #CRL-2522) và được nuôi cấy trong Môi trường Thiết yếu Tối thiểu của Eagle (ATCC, danh mục số 30-2003) được bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai ở tuổi 37 ° C., dưới 5% CO2. Nguyên bào sợi BJ được gieo vào đĩa 24 giếng với mật độ 300.000 tế bào mỗi giếng trong 0,5 ml môi trường nuôi cấy. 250 ng mRNA G-CSF đã biến đổi (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) không được biến đổi, được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (Gen1) hoặc được sửa đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine (Gen2) đã được truyền máu hàng ngày trong 5 ngày theo quy trình của nhà sản xuất. Các mẫu đối chứng của Lipofectamine 2000 (L2000) và mCherry mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytidine và pseudouridine) cũng được đưa vào sử dụng. truyền máu hàng ngày trong 5 ngày. Kết quả được thể hiện ở Bảng 100.
MRNA không biến đổi cho thấy phản ứng cytokine ở interferon-beta (IFN-beta) và interleukin-6 (IL-6) sau một ngày. mRNA được biến đổi bằng ít nhất pseudouridine cho thấy phản ứng với cytokine sau 2-3 ngày trong khi mRNA được biến đổi bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine cho thấy phản ứng giảm sau 3-5 ngày.
Ví dụ 66. Phát hiện phản ứng miễn dịch bẩm sinh trong cơ thể sống
Trong nỗ lực phân biệt tầm quan trọng của việc biến đổi hóa học khác nhau của mRNA đối với quá trình sản xuất protein in vivo và phản ứng cytokine in vivo, chuột cái BALB/C (n=5) được tiêm bắp với G-CSF mRNA (G-CSF mRNA unmod) ( trình tự mARN thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự) với đầu 5′ của Cap1, G-CSF mARN được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (G-CSF mARN mc/pU) , G-CSF mRNA được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N5-methyl-pseudouridine với (G-CSF mRNA mc/N1pU) hoặc không có nắp 5′ (G-CSF mRNA 5mc/N1 pU không có nắp) hoặc loại kiểm soát một trong hai R848 hoặc 500 sucrose như được mô tả trong Bảng 101.
Máu được thu thập lúc 8 giờ sau khi dùng thuốc. Sử dụng ELISA, nồng độ protein của G-CSF, TNF-alpha và IFN-alpha được xác định bằng ELISA. 8 giờ sau khi dùng thuốc, cơ được thu thập từ vị trí tiêm và phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực định lượng (QPCR) được sử dụng để xác định nồng độ mRNA của RIG-I, PKR, AIM-2, IFIT-1, OAS-2, MDA- 5, IFN-beta, TNF-alpha, IL-6, G-CSF, CD45 trong cơ.
Ví dụ 67. Nghiên cứu phát hiện đáp ứng miễn dịch bẩm sinh trên cơ thể sống
Chuột cái BALB/C (n=5) được tiêm bắp G-CSF mRNA (G-CSF mRNA chưa sửa đổi) (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự) với số 5 ′nắp của Cap1, G-CSF mRNA được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và pseudouridine (G-CSF mRNA 5mc/pU), G-CSF mRNA được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine với (G-CSF mRNA 5mc /N1pU) hoặc không có nắp 5′ (G-CSF mRNA 5mc/N1 pU không có nắp) hoặc chất kiểm soát R848 hoặc 5% sucrose như mô tả trong Bảng 102. Máu được thu thập lúc 8 giờ sau khi định lượng và sử dụng protein ELISA mức G-CSF và interferon-alpha (IFN-alpha) được xác định bằng ELISA và được trình bày trong Bảng 102.
Như được thể hiện trong Bảng 102, mARN G-CSF biến đổi 5mc/pU và 5mc/N1pU không biến đổi đã dẫn đến sự biểu hiện G-CSF của người trong huyết thanh chuột. MRNA G-CSF biến đổi 5 mC/N1pU chưa được khai thác cho thấy không có biểu hiện G-CSF của con người trong huyết thanh, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc có cấu trúc nắp 5’ đối với quá trình dịch mã protein.
Đúng như dự đoán, không có protein G-CSF của con người nào được biểu hiện trong R848, chỉ có 5% sucrose và các nhóm không được điều trị. Điều quan trọng là có sự khác biệt đáng kể trong việc sản xuất cytokine khi được đo bằng IFN-alpha của chuột trong huyết thanh. Đúng như mong đợi, mRNA G-CSF chưa được sửa đổi đã thể hiện phản ứng cytokine mạnh mẽ trên cơ thể (lớn hơn đối chứng dương tính R848). MRNA G-CSF biến đổi 5mc/pU đã cho thấy phản ứng cytokine thấp nhưng có thể phát hiện được trong cơ thể, trong khi mRNA biến đổi 5mc/N1pU cho thấy không có IFN-alpha có thể phát hiện được trong huyết thanh (và giống như phương tiện hoặc động vật không được điều trị).
Ngoài ra, phản ứng của mRNA biến đổi 5mc/N1pU là như nhau bất kể nó có bị giới hạn hay không. Các kết quả in vivo này củng cố kết luận rằng 1) mRNA không biến đổi tạo ra phản ứng miễn dịch bẩm sinh mạnh mẽ, 2) phản ứng này bị giảm đi, nhưng không bị xóa bỏ, thông qua việc kết hợp 100% biến đổi 5mc/pU và 3) việc kết hợp 5mc/N1pU sửa đổi dẫn đến không có phản ứng cytokine có thể phát hiện được.
Cuối cùng, do những mũi tiêm này chứa 5% sucrose (bản thân nó không có tác dụng), kết quả này sẽ phản ánh chính xác tiềm năng kích thích miễn dịch của những sửa đổi này.
Từ dữ liệu, rõ ràng là các phân tử biến đổi N1pU tạo ra nhiều protein hơn đồng thời có ít hoặc không ảnh hưởng đến sự biểu hiện IFN-alpha. Rõ ràng là cần phải có giới hạn để sản xuất protein cho quá trình biến đổi hóa học này. Tỷ lệ Protein: Cytokine là 748 so với Tỷ lệ PC đối với mRNA chưa biến đổi (PC=9) có nghĩa là sự biến đổi hóa học này vượt trội hơn nhiều so với các tác động hoặc ý nghĩa sinh học liên quan đến IFN-alpha.
Ví dụ 68: Phân phối RNA biến đổi trong Vivo
Việc sản xuất protein của mRNA biến đổi được đánh giá bằng cách cung cấp mRNA G-CSF biến đổi hoặc mRNA Yếu tố IX biến đổi cho chuột cái Sprague Dawley ( n = 6). Chuột được tiêm 400 ug trong 100 ul mRNA G-CSF (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (G-CSF Gen1), mRNA của G-CSF được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine (G-CSF Gen2) hoặc Yếu tố IX mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được trình bày theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và pseudouridine (Yếu tố IX Gen1) được hoàn nguyên từ dạng đông khô trong 5% sucrose. Máu được thu thập 8 giờ sau khi tiêm và nồng độ protein G-CSF trong huyết thanh được đo bằng ELISA. Bảng 103 cho thấy nồng độ protein G-CSF trong huyết thanh sau 8 giờ.
Những kết quả này chứng minh rằng cả mRNA biến đổi G-CSF Gen 1 và G-CSF Gen 2 đều có thể tạo ra protein G-CSF của con người ở chuột sau một lần tiêm bắp và việc sản xuất protein G-CSF ở người được cải thiện khi sử dụng hóa học Gen 2 kết thúc. Hóa học thế hệ 1.
Ví dụ 69. Biến đổi hóa học: Nghiên cứu trong ống nghiệm
A. Sàng lọc in vitro ở PBMC
500 ng G-CSF (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) mRNA được biến đổi hoàn toàn bằng sự biến đổi hóa học được nêu trong Bảng 104 và 105 được chuyển nhiễm 0,4 uL Lipofectamine 2000 vào tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) từ ba người hiến máu bình thường. Các mẫu đối chứng của LPS, R848, P(I)P(C) và mCherry (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự, 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5- methylcytosine và pseudouridine) cũng được phân tích. Chất nổi phía trên được thu hoạch và bảo quản đông lạnh cho đến khi được ELISA phân tích để xác định biểu hiện protein G-CSF và sự tạo ra các cytokine interferon-alpha (IFN-α) và yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α). Sự biểu hiện protein của G-CSF được thể hiện trong Bảng 104, sự biểu hiện của IFN-α và TNF-α được thể hiện trong Bảng 105.
Dữ liệu trong Bảng 104 chứng minh rằng nhiều, nhưng không phải tất cả, các biến đổi hóa học có thể được sử dụng để sản xuất G-CSF của con người một cách hiệu quả trong PBMC. Đáng chú ý, sự thay thế 100% N1-methyl-pseudouridine cho thấy mức độ sản xuất G-CSF ở người cao nhất (cao hơn gần 10 lần so với pseudouridine). Khi sử dụng N1-methyl-pseudouridine kết hợp với 5-methylcytidine, lượng protein G-CSF ở người cao cũng được tạo ra (mức này cũng cao hơn so với khi sử dụng pseudouridine kết hợp với 5 methylcytidine).
Do mối quan hệ nghịch đảo giữa sản xuất protein và sản xuất cytokine trong PBMC, xu hướng tương tự cũng được thấy trong Bảng 105, trong đó việc thay thế 100% bằng N1-methyl-pseudouridine không tạo ra cảm ứng cytokine (tương tự như đối chứng chỉ chuyển nhiễm) và pseudouridine cho thấy sự cảm ứng cytokine có thể phát hiện được đó là trên nền.
Các sửa đổi khác như N6-methyladenosine và alpha-thiocytidine dường như làm tăng kích thích cytokine.
B. Sàng lọc in vitro trên tế bào HeLa
Một ngày trước khi truyền nhiễm, 20.000 tế bào HeLa (ATCC số CCL-2; Manassas, VA) đã được thu hoạch bằng cách xử lý bằng dung dịch Trypsin-EDTA (LifeTechnology, Grand Island, NY) và gieo hạt vào tổng thể tích 100 ul môi trường EMVIEM (được bổ sung với 100% FCS và 1× Glutamax) trên mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Corning, Manassas, VA). Tế bào được nuôi cấy ở 37oG trong 5% CO2bầu không khí qua đêm. Ngày hôm sau, 83 ng RNA biến đổi Luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap 1) với sự biến đổi hóa học được mô tả trong Bảng 106, được pha loãng trong Tập cuối cùng 10 ul của OPTI-MEM (LifeTechnology, Grand Island, NY).
Lipofectamine 2000 (LifeTechnology, Grand Island, NY) đã được sử dụng làm thuốc thử chuyển hóa và 0,2 ul được pha loãng trong thể tích cuối cùng của 10 ul OPTI-MEM. Sau 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng, cả hai dung dịch được kết hợp và ủ thêm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, dung dịch kết hợp 20 ul được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào 100 ul chứa tế bào HeLa và ủ ở nhiệt độ phòng.
Sau 18 đến 22 giờ ủ, các tế bào biểu hiện luciferase được ly giải bằng 100 ul Dung dịch đệm ly giải thụ động (Promega, Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phần dịch ly giải được chuyển sang các đĩa 96 giếng polystyrene trắng đục (Corning, Manassas, VA) và kết hợp với dung dịch xét nghiệm luciferase hoàn chỉnh 100 ul (Promega, Madison, WI). Thể tích lysate được điều chỉnh hoặc pha loãng cho đến khi phát hiện không quá 2 triệu đơn vị ánh sáng tương đối (RLU) trên mỗi giếng đối với các mẫu tạo tín hiệu mạnh nhất và RLU cho mỗi hóa chất được thử nghiệm được trình bày trong Bảng 106. Máy đọc đĩa là BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). Tín hiệu nền của các đĩa không có thuốc thử là khoảng 200 đơn vị ánh sáng tương đối trên mỗi giếng.
Những kết quả này chứng minh rằng nhiều, nhưng không phải tất cả, các biến đổi hóa học có thể được sử dụng để sản xuất G-CSF của con người trong tế bào HeLa một cách hiệu quả. Đáng chú ý, sự thay thế 100% N1-methyl-pseudouridine chứng tỏ mức độ sản xuất G-CSF ở người cao nhất.
C. Sàng lọc in vitro ở dịch ly giải hồng cầu lưới ở thỏ
Luciferase mARN (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được cải biến bằng cải biến hóa học được liệt kê trong Bảng 107 và được pha loãng trong nước vô trùng không có nuclease để số tiền cuối cùng là 250 ng trong 10 ul. luciferase pha loãng được thêm vào 40 ul Lysate hồng cầu lưới thỏ mới chuẩn bị và phản ứng dịch mã in vitro được thực hiện trong ống phản ứng polypropylen 1,5 mL tiêu chuẩn (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ở 30° C. trong khối gia nhiệt khô. Thử nghiệm dịch mã được thực hiện với bộ Kit Reticulocyte Lysate (được xử lý bằng nuclease) của Thỏ (Promega, Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch đệm phản ứng được bổ sung hỗn hợp một-một gồm các dung dịch gốc axit amin được cung cấp không có Leucine hoặc Methionine tạo thành hỗn hợp phản ứng chứa đủ lượng cả hai axit amin để cho phép dịch mã in vitro hiệu quả.
Sau 60 phút ủ, phản ứng được dừng lại bằng cách đặt các ống phản ứng lên đá. Các phần của phản ứng dịch mã in vitro chứa RNA biến đổi luciferase được chuyển sang các đĩa 96 giếng polystyrene trắng đục (Corning, Manassas, VA) và kết hợp với dung dịch xét nghiệm luciferase hoàn chỉnh 100 ul (Promega, Madison, WI). Thể tích của các phản ứng dịch mã trong ống nghiệm được điều chỉnh hoặc pha loãng cho đến khi phát hiện không quá 2 triệu đơn vị ánh sáng tương đối (RLU) trên mỗi giếng đối với các mẫu tạo tín hiệu mạnh nhất và RLU cho mỗi hóa chất được thử nghiệm được trình bày trong Bảng 107. Máy đọc đĩa là BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). Tín hiệu nền của các đĩa không có thuốc thử là khoảng 200 đơn vị ánh sáng tương đối trên mỗi giếng.
Các kết quả dịch mã không có tế bào này tương quan rất tốt với kết quả sản xuất protein trong HeLa, với các sửa đổi giống nhau thường hoạt động hoặc không hoạt động trong cả hai hệ thống. Một ngoại lệ đáng chú ý là mRNA luciferase được biến đổi 5-formylcytidine hoạt động trong hệ thống dịch mã không có tế bào, nhưng không hoạt động trong hệ thống chuyển đổi dựa trên tế bào HeLa. Sự khác biệt tương tự giữa hai xét nghiệm cũng được nhận thấy với mRNA G-CSF được biến đổi 5-formylcytidine.
Ví dụ 70. Biến đổi hóa học: Nghiên cứu trong Vivo
A. Sàng lọc in vivo mRNA đã biến đổi G-CSF
Chuột Balb-C (n=4) được tiêm bắp vào mỗi chân với mRNA G-CSF đã biến đổi (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; nắp 5′, Cap 1) , được sửa đổi hoàn toàn với các sửa đổi hóa học được nêu trong Bảng 108, được xây dựng trong 1xPBS. Đối chứng của mARN được biến đổi bằng luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với pseudouridine và 5-methylcytosine) và đối chứng của PBS cũng được sử dụng thử nghiệm. Sau 8 giờ, huyết thanh được thu thập để xác định nồng độ protein G-CSF và nồng độ cytokine bằng ELISA.
B. Sàng lọc in vivo mRNA biến đổi Luciferase
Chuột Balb-C (n=4) được tiêm dưới da 200 ul chứa 42 đến 103 mg mARN luciferase biến đổi (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1), được sửa đổi hoàn toàn bằng các sửa đổi hóa học được nêu trong Bảng 109, được tạo thành trong 1xPBS. Kiểm soát PBS cũng đã được thử nghiệm. Liều lượng của mRNA luciferase biến đổi cũng được nêu trong Bảng 109. 8 giờ sau khi dùng thuốc, chuột được chụp ảnh để xác định biểu hiện luciferase. Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột.
Như được thể hiện trong Bảng 109, tất cả các chất hóa học biến đổi mARN luciferase đều thể hiện hoạt tính in vivo, ngoại trừ 2′-fluorouridine. Ngoài ra, mRNA được biến đổi 1-methylpseudouridine thể hiện sự biểu hiện rất cao của luciferase (biểu hiện cao gấp 5 lần so với pseudouridine có chứa mRNA).
Ví dụ 71. Sàng lọc in vivo đối với mRNA biến đổi Luciferase kết hợp
Chuột Balb-C (n=4) được tiêm dưới da 200 ul trong số 100 xấu mRNA luciferase biến đổi (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1) , được biến đổi hoàn toàn bằng các biến đổi hóa học được nêu trong Bảng 110, được tạo thành trong 1× PBS. Kiểm soát PBS cũng đã được thử nghiệm. 8 giờ sau khi dùng thuốc, chuột được chụp ảnh để xác định biểu hiện luciferase. Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột.
Như được thể hiện trong Bảng 110, tất cả các chất hóa học biến đổi mARN luciferase (kết hợp) đều thể hiện hoạt tính in vivo. Ngoài ra, sự hiện diện của N1-methyl-pseudouridine trong mRNA đã biến đổi (với N4-acetylcytidine hoặc 5 methylcytidine) cho thấy biểu hiện cao hơn so với khi sử dụng cùng các kết hợp này khi được thử nghiệm bằng pseudouridine. Tổng hợp lại, những dữ liệu này chứng minh rằng N1-methyl-pseudouridine chứa luciferase mRNA dẫn đến cải thiện sự biểu hiện protein trong cơ thể dù được sử dụng đơn độc (Bảng 109) hay khi được sử dụng kết hợp với các nulceotide biến đổi khác (Bảng 110).
Ví dụ 72. Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh ở nguyên bào sợi BJ
Nguyên bào sợi bao quy đầu nguyên phát ở người (nguyên bào sợi BJ) được lấy từ Bộ sưu tập Văn hóa Kiểu Mỹ (ATCC) (danh mục #CRL-2522) và được nuôi cấy trong Môi trường Thiết yếu Tối thiểu của Eagle (ATCC, mèo #30-2003) được bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai ở tuổi 37 ° C., dưới 5% CO2. Nguyên bào sợi BJ được gieo vào đĩa 24 giếng với mật độ 130.000 tế bào mỗi giếng trong 0,5 ml môi trường nuôi cấy. 250 ng mRNA G-CSF biến đổi (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (Gen1) hoặc được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine (Gen2) được chuyển nhiễm bằng Lipofectamine 2000 (Invitrogen, cat #11668-019), theo quy trình của nhà sản xuất. Các mẫu đối chứng của Lipofectamine 2000 và G-CSF mRNA chưa biến tính (G-CSF tự nhiên) cũng được chuyển nhiễm. Các tế bào được truyền máu trong năm ngày liên tiếp. Các phức hợp truyền máu được loại bỏ bốn giờ sau mỗi đợt truyền máu.
Chất nổi trên bề mặt nuôi cấy được xét nghiệm để tìm G-CSF tiết ra (Hệ thống R&D, danh mục #DCS50), yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-alpha) và interferon alpha (IFN-alpha bởi ELISA mỗi ngày sau khi truyền máu theo quy trình của nhà sản xuất. Các tế bào được phân tích để đảm bảo khả năng sống sót bằng cách sử dụng CELL TITER GLO® (Promega, catalog #G7570) 6 giờ và 18 giờ sau đợt truyền nhiễm đầu tiên và cách ngày sau đó, từ các tế bào đã thu hoạch, RNA tổng số được phân lập và xử lý bằng DNASE®. sau đó sử dụng bộ micro RNAEASY (danh mục số 74004) theo giao thức của nhà sản xuất. 100 ng RNA tổng số được sử dụng để tổng hợp cDNA bằng cách sử dụng bộ Phiên mã ngược cDNA công suất cao (Hệ thống sinh học ứng dụng, cat #4368814) theo giao thức của nhà sản xuất. được phân tích biểu hiện các gen phản ứng miễn dịch bẩm sinh bằng phương pháp PCR thời gian thực định lượng bằng cách sử dụng SybrGreen trong thiết bị Biorad CFX 384 theo quy trình của nhà sản xuất.
Ví dụ 73. Phiên mã in vitro với T7 Polymerase kiểu hoang dã
Luciferase mARN (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) và G-CSF mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) đã được biến đổi hoàn toàn bằng các chất hóa học và kết hợp hóa học khác nhau được liệt kê trong các Bảng 111-114 bằng cách sử dụng T7 polymerase kiểu hoang dã như đã mô tả trước đây.
Hiệu suất của các phản ứng dịch mã được xác định bằng phép đo quang phổ (OD260) và hiệu suất của Luciferase được thể hiện trong Bảng 111 và G-CSF được thể hiện trong Bảng 113.
MARN biến đổi luciferase và G-CSF cũng phải chịu phản ứng đóng nắp bằng enzyme và mỗi phản ứng đóng nắp mARN biến đổi được đánh giá về hiệu suất bằng phép đo quang phổ (OD260) và đánh giá kích thước chính xác bằng máy phân tích sinh học. Hiệu suất từ phản ứng giới hạn đối với luciferase được thể hiện trong Bảng 112 và G-CSF được thể hiện trong Bảng 114.
Ví dụ 74. Phiên mã in vitro với Mutant T7 Polymerase
Luciferase mARN (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap 1) và G-CSF mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA của khoảng 160 nucleotide không được trình bày theo trình tự; 5′cap, Cap1) đã được biến đổi hoàn toàn bằng các chất hóa học và kết hợp hóa học khác nhau được liệt kê trong Bảng 115-118 bằng cách sử dụng T7 polymerase đột biến (Bộ phiên mã Durascribe® T7 (Mã số DS010925) (Epicenter® , Madison, WI).
Hiệu suất của các phản ứng dịch mã được xác định bằng phép đo quang phổ (OD260) và hiệu suất của Luciferase được thể hiện trong Bảng 115 và G-CSF được thể hiện trong Bảng 117.
MARN biến đổi luciferase và G-CSF cũng phải chịu phản ứng đóng nắp bằng enzyme và mỗi phản ứng đóng nắp mARN biến đổi được đánh giá về hiệu suất bằng phép đo quang phổ (OD260) và đánh giá kích thước chính xác bằng máy phân tích sinh học. Hiệu suất từ phản ứng giới hạn đối với luciferase được thể hiện trong Bảng 116 và G-CSF được thể hiện trong Bảng 118.
Ví dụ 75. Hợp chất 2′O-Metyl và 2′Fluoro
Luciferase mARN (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được tạo ra dưới dạng các phiên bản được sửa đổi hoàn toàn với các thành phần hóa học trong Bảng 119 và được phiên mã bằng cách sử dụng T7 polymerase đột biến (Durascribe) ® T7 Bộ phiên mã (Mã hàng DS010925) (Epicenter®, Madison, WI). 2′ mRNA chứa fluoro được tạo ra bằng Durascribe T7, tuy nhiên, mRNA chứa 2′Omethyl không thể được phiên mã bằng Durascribe T7.
Sự kết hợp của mRNA biến đổi 2′Omethyl có thể có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các polymerase T7 đột biến khác (Nat Biotechnol. (2004) 22:1155-1160; Nucleic Acids Res. (2002) 30:e138) hoặc US Pat. Số 7,309,570, toàn bộ nội dung của từng tài liệu được đưa vào đây bằng cách viện dẫn. Ngoài ra, các sửa đổi 2′OMe có thể được đưa vào sau phiên mã bằng phương tiện enzyme.
Việc đưa ra các cải tiến trên nhóm 2' của đường có nhiều ưu điểm tiềm năng. Các chất thay thế 2′OMe, giống như các chất thay thế 2′ fluoro được biết là có tác dụng bảo vệ chống lại các nuclease và cũng đã được chứng minh là có tác dụng loại bỏ khả năng nhận biết miễn dịch bẩm sinh khi được tích hợp vào các axit nucleic khác như siRNA và anti-sense (được kết hợp toàn bộ, Crooke, ed. Antisense Công nghệ dược phẩm, 2thứphiên bản; Boca Raton: Báo chí CRC).
MRNA được biến đổi 2′Fluoro sau đó được chuyển vào tế bào HeLa để đánh giá quá trình sản xuất protein trong bối cảnh tế bào và mARN tương tự cũng được đánh giá trong hệ thống hồng cầu lưới của thỏ không có tế bào. Một biện pháp kiểm soát luciferase không biến đổi (luciferase tự nhiên) đã được sử dụng cho cả hai thí nghiệm phiên mã, một biện pháp kiểm soát chưa được điều trị và được chuyển hóa giả (riêng Lipofectamine 2000) cũng được phân tích để chuyển nhiễm HeLa và phân tích biện pháp kiểm soát không có RNA đối với các chất phân giải dạng lưới của thỏ.
Đối với các thí nghiệm chuyển gen HeLa, một ngày trước khi truyền máu, 20.000 tế bào HeLa (ATCC số CCL-2; Manassas, VA) đã được thu hoạch bằng cách xử lý bằng dung dịch Trypsin-EDTA (LifeTechnology, Grand Island, NY) và gieo hạt vào tổng thể tích là Môi trường 100 ul EMEM (được bổ sung 10% FCS và 1× Glutamax) mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Corning, Manassas, VA). Tế bào được nuôi cấy ở 37oG trong 5% CO2bầu không khí qua đêm. Ngày hôm sau, 83 ng ARN biến đổi luciferase chứa 2′fluoro (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) với sự biến đổi hóa học được mô tả trong Bảng 119, được pha loãng trong thể tích cuối cùng 10 ul của OPTI-MEM (LifeTechnology, Grand Island, NY). Lipofectamine 2000 (LifeTechnology, Grand Island, NY) đã được sử dụng làm thuốc thử chuyển hóa và 0,2 ul được pha loãng trong thể tích cuối cùng của 10 ul OPTI-MEM. Sau 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng, cả hai dung dịch được kết hợp và ủ thêm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, dung dịch kết hợp 20 ul được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào 100 ul chứa tế bào HeLa và ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 18 đến 22 giờ ủ, các tế bào biểu hiện luciferase được ly giải bằng 100 ul Dung dịch đệm ly giải thụ động (Promega, Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phần dịch ly giải được chuyển sang các đĩa 96 giếng polystyrene trắng đục (Corning, Manassas, VA) và kết hợp với dung dịch xét nghiệm luciferase hoàn chỉnh 100 ul (Promega, Madison, WI). Thể tích lysate được điều chỉnh hoặc pha loãng cho đến khi phát hiện không quá 2 triệu đơn vị ánh sáng tương đối (RLU) trên mỗi giếng đối với các mẫu tạo tín hiệu mạnh nhất và RLU cho mỗi hóa chất được thử nghiệm được trình bày trong Bảng 119. Máy đọc đĩa là BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). Tín hiệu nền của các đĩa không có thuốc thử là khoảng 200 đơn vị ánh sáng tương đối trên mỗi giếng.
Đối với xét nghiệm lysate hồng cầu lưới ở thỏ, mRNA luciferase chứa 2′-fluoro được pha loãng trong nước vô trùng không có nuclease đến lượng cuối cùng là 250 ng trong 10 ul và thêm vào 40 ul Lysate hồng cầu lưới thỏ mới chuẩn bị và phản ứng dịch mã trong ống nghiệm được thực hiện trong ống phản ứng polypropylen 1,5 mL tiêu chuẩn (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ở 30° C. trong khối gia nhiệt khô. Thử nghiệm dịch mã được thực hiện với bộ Kit Reticulocyte Lysate (được xử lý bằng nuclease) của Thỏ (Promega, Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch đệm phản ứng được bổ sung hỗn hợp một-một gồm các dung dịch gốc axit amin được cung cấp không có Leucine hoặc Methionine tạo thành hỗn hợp phản ứng chứa đủ lượng cả hai axit amin để cho phép dịch mã in vitro hiệu quả. Sau 60 phút ủ, phản ứng được dừng lại bằng cách đặt các ống phản ứng lên đá.
Các phần của phản ứng dịch mã in vitro chứa RNA biến đổi luciferase được chuyển sang các đĩa 96 giếng polystyrene trắng đục (Corning, Manassas, VA) và kết hợp với dung dịch xét nghiệm luciferase hoàn chỉnh 100 ul (Promega, Madison, WI). Thể tích của các phản ứng dịch mã trong ống nghiệm được điều chỉnh hoặc pha loãng cho đến khi phát hiện không quá 2 triệu đơn vị ánh sáng tương đối (RLU) trên mỗi giếng đối với các mẫu tạo tín hiệu mạnh nhất và RLU cho mỗi hóa chất được thử nghiệm được trình bày trong Bảng 120. Máy đọc đĩa là BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). Tín hiệu nền của các đĩa không có thuốc thử là khoảng 160 đơn vị ánh sáng tương đối trên mỗi giếng.
Như có thể thấy trong Bảng 119 và 120, nhiều hợp chất chứa 2′Fluoro hoạt động in vitro và tạo ra protein luciferase.
Ví dụ 76. Luciferase trong tế bào HeLa sử dụng kết hợp các biến đổi
Để đánh giá việc sử dụng mRNA biến đổi 2′fluoro kết hợp với biến đổi khác, một loạt mRNA đã được phiên mã bằng cách sử dụng T7 polymerase kiểu hoang dã (các hợp chất không chứa fluoro) hoặc sử dụng các polymerase T7 đột biến (các hợp chất chứa fluyoro) như được mô tả trong Ví dụ 75. Tất cả các mRNA biến đổi đều được thử nghiệm bằng phương pháp chuyển nạp in vitro vào tế bào HeLa.
Một ngày trước khi truyền nhiễm, 20.000 tế bào HeLa (ATCC số CCL-2; Manassas, VA) đã được thu hoạch bằng cách xử lý bằng dung dịch Trypsin-EDTA (LifeTechnology, Grand Island, NY) và gieo hạt vào tổng thể tích 100 ul môi trường EMEM (được bổ sung với 10% FCS và 1× Glutamax) mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Corning, Manassas, VA). Tế bào được nuôi cấy ở 37oG trong 5% CO2bầu không khí qua đêm. Ngày hôm sau, 83 ng RNA biến đổi Luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) với sự biến đổi hóa học được mô tả trong Bảng 121, được pha loãng trong 10 ul tập cuối cùng của OPTI-MEM (LifeTechnology, Grand Island, NY). Lipofectamine 2000 (LifeTechnology, Grand Island, NY) đã được sử dụng làm thuốc thử chuyển hóa và 0,2 ul được pha loãng trong thể tích cuối cùng của 10 ul OPTI-MEM. Sau 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng, cả hai dung dịch được kết hợp và ủ thêm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, dung dịch kết hợp 20 ul được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào 100 ul chứa tế bào HeLa và ủ ở nhiệt độ phòng.
Sau 18 đến 22 giờ ủ, các tế bào biểu hiện luciferase được ly giải bằng 100 ul Dung dịch đệm ly giải thụ động (Promega, Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phần dịch ly giải được chuyển sang các đĩa 96 giếng polystyrene trắng đục (Corning, Manassas, VA) và kết hợp với dung dịch xét nghiệm luciferase hoàn chỉnh 100 ul (Promega, Madison, WI). Thể tích lysate được điều chỉnh hoặc pha loãng cho đến khi phát hiện không quá 2 triệu đơn vị ánh sáng tương đối (RLU) trên mỗi giếng đối với các mẫu tạo tín hiệu mạnh nhất và RLU cho mỗi hóa chất được thử nghiệm được trình bày trong Bảng 121. Máy đọc đĩa là BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). Tín hiệu nền của các đĩa không có thuốc thử là khoảng 200 đơn vị ánh sáng tương đối trên mỗi giếng.
Như được chứng minh trong Bảng 121, hầu hết các tổ hợp biến đổi đều tạo ra mRNA tạo ra protein luciferase chức năng, bao gồm tất cả các hợp chất không chứa bột và nhiều tổ hợp chứa các biến đổi 2′fluro.
Ví dụ 77. Phiên mã in vitro G-CSF
Để đánh giá hoạt động của tất cả các sửa đổi hóa học khác nhau của chúng tôi trong bối cảnh khung đọc mở thứ hai, chúng tôi đã sao chép các thử nghiệm được thực hiện trước đó bằng cách sử dụng mRNA luciferase, với mRNA G-CSF của con người. MRNA G-CSF (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap 1) đã được biến đổi hoàn toàn với các thành phần hóa học trong Bảng 122 và 123 bằng cách sử dụng T7 polymerase kiểu hoang dã (đối với tất cả các hợp chất không chứa fluoro) hoặc T7 polymerase đột biến (đối với tất cả các hợp chất chứa fluoro). T7 polymerase đột biến đã thu được trên thị trường (Bộ phiên mã Durascribe® T7 (Mã số DS010925) (Epicenter®, Madison, WI).
RNA biến đổi trong Bảng 122 và 123 được chuyển nhiễm in vitro trong tế bào HeLa hoặc được thêm vào dịch ly giải dạng lưới của thỏ (250 ng mRNA biến đổi) như đã chỉ ra. Đối chứng chưa được xử lý, được chuyển nhiễm mô phỏng (riêng thuốc thử chuyển nhiễm), G-CSF được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouri dine hoặc kiểm soát luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được trình bày theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine cũng được phân tích. Sự biểu hiện của protein G-CSF được xác định bằng ELISA và các giá trị được trình bày trong Bảng 122 và 123. Trong Bảng 122, “NT” có nghĩa là không được thử nghiệm.
Như được trình bày trong Bảng 123, nhiều, nhưng không phải tất cả, các biến đổi hóa học đã dẫn đến việc sản xuất protein G-CSF ở người. Những kết quả này từ các hệ thống dịch dựa trên ô và không có ô có mối tương quan rất tốt với các sửa đổi giống nhau thường hoạt động hoặc không hoạt động trong cả hai hệ thống. Một ngoại lệ đáng chú ý là mRNA G-CSF được biến đổi 5-formylcytidine hoạt động trong hệ thống dịch mã không có tế bào, nhưng không hoạt động trong hệ thống chuyển đổi dựa trên tế bào HeLa. Sự khác biệt tương tự giữa hai xét nghiệm cũng được nhận thấy với mRNA luciferase được biến đổi 5-formylcytidine.
Như được trình bày trong Bảng 123, nhiều, nhưng không phải tất cả, các chất hóa học biến đổi mRNA G-CSF (khi được sử dụng kết hợp) đã thể hiện hoạt tính in vivo. Ngoài ra, sự hiện diện của N1-methyl-pseudouridine trong mRNA đã biến đổi (với N4-acetylcytidine hoặc 5 methylcytidine) cho thấy biểu hiện cao hơn so với khi sử dụng cùng các kết hợp này khi được thử nghiệm bằng pseudouridine. Tổng hợp lại, những dữ liệu này chứng minh rằng N1-methyl-pseudouridine chứa G-CSF mRNA giúp cải thiện biểu hiện protein trong ống nghiệm.
Ví dụ 78. Sàng lọc hóa chất
Các bảng liệt kê dưới đây (Bảng 124-126) tóm tắt phần lớn dữ liệu sàng lọc in vitro và in vitro với các hợp chất khác nhau được trình bày trong các ví dụ trước. Có mối tương quan tốt giữa các xét nghiệm dịch mã dựa trên tế bào và không có tế bào. Các chất thay thế hóa học tương tự thường cho thấy sự phù hợp tốt dù được thử nghiệm trong bối cảnh luciferase hay G-CSF mRNA. Cuối cùng, N1-methyl-pseudouridine chứa mRNA cho thấy mức độ biểu hiện protein rất cao mà ít hoặc không phát hiện được sự kích thích cytokine in vitro và in vivo, và vượt trội hơn so với mRNA chứa pseudouridine cả in vitro và in vivo.
Luciferase mARN (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) và G-CSF mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi bằng các chất hóa học tự nhiên và không tự nhiên được mô tả trong Bảng 124 và 125 hoặc các chất hóa học kết hợp được mô tả trong Bảng 126 và được thử nghiệm bằng các phương pháp được mô tả ở đây.
Trong Bảng 125 và 126, “*” dùng để chỉ phản ứng sao chép trong ống nghiệm sử dụng T7 polymerase đột biến (Bộ phiên mã Durascribe® T7 (Mã số DS010925) (Epicenter®, Madison, WI); “**” dùng để chỉ phản ứng thứ hai tạo ra phản ứng sao chép trong ống nghiệm bằng cách sử dụng T7 polymerase đột biến (Bộ phiên mã Durascribe® T7 (Mã số DS010925) (Epicenter®, Madison, WI); “***” đề cập đến quá trình sản xuất được thấy trong các bản dịch tự do của tế bào (ly giải hồng cầu lưới ở thỏ) ; khả năng sản xuất protein của HeLa được đánh giá bằng “+,” “+/−” và “-” khi đề cập đến G-CSF PBMC “++++” có nghĩa là lớn hơn 6.000 μg/ml G-CSF, “++ +” nghĩa là lớn hơn 3.000 μg/ml G-CSF, “++” nghĩa là lớn hơn 1.500 μg/ml G-CSF, “+” nghĩa là lớn hơn 300 μg/ml G-CSF, “+/−” nghĩa là 150- 300 μg/ml G-CSF và nền là khoảng 110 μg/ml; khi đề cập đến cytokine PBMC “++++” có nghĩa là lớn hơn 1.000 μg/ml interferon-alpha (IFN-alpha), “+++” có nghĩa là lớn hơn 600 pg/ml IFN-alpha, “C++” có nghĩa là lớn hơn 300 pg/ml IFN-alpha, “+” có nghĩa là lớn hơn 100 pg/ml IFN-alpha, “-” có nghĩa là nhỏ hơn 100 p/ml và nền khoảng 70 pg/ml; và “NT” có nghĩa là chưa được kiểm tra. Trong Bảng 125, việc sản xuất protein được đánh giá bằng cách sử dụng T7 polymerase đột biến (Bộ phiên mã Durascribe® T7 (Mã số DS010925) (Epicenter®, Madison, WI).
Trong Bảng 126, khả năng sản xuất protein của HeLa được đánh giá bằng “+,” “+/−” và “−”; khi đề cập đến G-CSF PBMC “++++” có nghĩa là lớn hơn 6.000 μg/ml G-CSF, “+++” có nghĩa là lớn hơn 3.000 μg/ml G-CSF, “++” có nghĩa là lớn hơn 1.500 μg/ ml G-CSF, “+” có nghĩa là lớn hơn 300 μg/ml G-CSF, “+/−” có nghĩa là 150-300 μg/ml G-CSF và nền là khoảng 110 μg/ml; khi đề cập đến cytokine PBMC “++++” có nghĩa là lớn hơn 1.000 μg/ml interferon-alpha (TFN-alpha), “+++” có nghĩa là lớn hơn 600 μg/ml TFN-alpha, “++” có nghĩa là lớn hơn 300 pg/ml IFN-alpha, “+” có nghĩa là lớn hơn 100 μg/ml TFN-alpha, “-” có nghĩa là dưới 100 μg/ml và nền là khoảng 70 μg/ml; “WT” dùng để chỉ loại T7 polymerase hoang dã, “MT” dùng để chỉ T7 polymerase đột biến (Bộ phiên mã Durascribe® T7 (Mã số DS010925) (Epicenter®, Madison, WI) và “NT” có nghĩa là không được thử nghiệm.
Ví dụ 79. Hóa chất 2′Fluoro trong PBMC
Khả năng của mRNA được sửa đổi G-CSF (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap 1) để kích hoạt phản ứng miễn dịch bẩm sinh được xác định bằng cách đo interferon-alpha (IFN-alpha) và sản xuất yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-alpha). Sử dụng môi trường nuôi cấy PBMC in vitro là một cách được chấp nhận để đo khả năng kích thích miễn dịch của oigonucleotide (Robbins và cộng sự, Oligonucleotides 2009 19:89-102) và các phương pháp chuyển nhiễm được mô tả ở đây. Trong Bảng 127 là mức trung bình từ 2 hoặc 3 người hiến PBMC riêng biệt sản xuất interferon-alpha (IFN-alpha) và yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-alpha) theo thời gian được đo bằng ELISA cụ thể. Các biện pháp kiểm soát R848, P(J)P(C), LPS và Lipofectamine 2000 (L2000) cũng được phân tích.
Liên quan đến khả năng nhận biết miễn dịch bẩm sinh, trong khi cả hai thành phần hóa học mRNA biến đổi đều ngăn cản phần lớn việc sản xuất IFN-alpha và TINE-alpha so với các biện pháp kiểm soát dương tính (R848, P(I)P(C)), các hợp chất 2′fluoro làm giảm IFN-alpha và T4N- sản xuất alpha thậm chí còn thấp hơn so với các dạng kết hợp khác và sự kết hợp N4-acetylcytidine đã làm tăng thành phần cytokine.
Ví dụ 80. MRNA được biến đổi với Virus Etch thuốc lá 5′UTR
Vùng 5’ chưa được dịch (UTR) có thể được cung cấp dưới dạng vùng sườn. Nhiều UTR 5′ có thể được bao gồm trong vùng sườn và có thể giống nhau hoặc có trình tự khác nhau. Bất kỳ phần nào của các vùng sườn, kể cả không có, có thể được tối ưu hóa codon và bất kỳ phần nào có thể chứa một hoặc nhiều biến đổi cấu trúc hoặc hóa học khác nhau một cách độc lập, trước và/hoặc sau khi tối ưu hóa codon.
5′UTR có thể bao gồm 5′UTR từ vi rút gây bệnh thuốc lá (TEV). Các biến thể của 5′ UTR có thể được sử dụng trong đó một hoặc nhiều nucleotit được thêm vào hoặc loại bỏ ở đầu cuối, bao gồm A, T, C hoặc G.
Ví dụ 81. Biểu hiện mARN có công thức PLGA
A. Tổng hợp và xác định đặc tính của vi cầu Luciferase PLGA
Luciferase mARN (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine, được biến đổi bằng 25% uridine được thay thế với 2-thiouridine và 25% cytosine được thay thế bằng 5-methylcytosine, được biến đổi hoàn toàn bằng N1-methyl-pseudouridine hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng pseudouridine được hoàn nguyên trong dung dịch đệm 1 × TE và sau đó được tạo thành trong kính hiển vi PLGA. Các vi cầu PLGA được tổng hợp bằng phương pháp nhũ hóa kép nước/dầu/nước đã biết trong lĩnh vực này bằng cách sử dụng nắp PLGA-ester (Lactel, Cat #B6010-2, độ nhớt vốn có 0,55-0,75, 50:50 LA:GA), polyvinylalcohol (PVA) (Sigma, Cat #348406-25G, MW 13-23 k) diclometan và nước. Tóm lại, 0,4 ml mRNA trong dung dịch đệm TE ở mức 4 mg/ml (W1) đã được thêm vào 2 ml PLGA hòa tan trong dichloromethane (DCM) (O1) ở nồng độ 200 mg/ml PLGA. Nhũ tương W1/O1 được đồng nhất hóa (IKA Ultra-Turrax hom*ogenizer, T18) trong 30 giây ở tốc độ 5 (˜19.000 vòng/phút). Nhũ tương W1/01 sau đó được thêm vào 250 ml PVA 1% (W2) và đồng nhất hóa trong 1 phút ở tốc độ 5 (˜19.000 vòng/phút). Các công thức được khuấy trong 3 giờ, sau đó được đưa qua lưới lọc nylon 100 μm (Fisherbrand Cell Strainer, Cat #22-363-549) để loại bỏ các cốt liệu lớn hơn và cuối cùng được rửa bằng cách ly tâm (10 phút, 9.250 vòng/phút, 4° C.). Phần nổi phía trên được loại bỏ và các viên PLGA được hòa lại trong 5-10 ml nước, được lặp lại 2×. Sau khi rửa và hòa lại bằng nước, 100-200 µl mẫu vi cầu PLGA được sử dụng để đo kích thước hạt của các công thức bằng nhiễu xạ laser (Malvern Mastersizer2000). Công thức đã rửa được đông lạnh trong nitơ lỏng và sau đó đông khô trong 2-3 ngày.
Sau khi đông khô, cân ˜10 mg PLGA MS trong ống eppendorf 2 ml và làm biến dạng bằng cách thêm 1 ml DCM và để mẫu lắc trong 2-6 giờ. MRNA được chiết xuất từ các vi hạt PLGA đã bị biến dạng bằng cách thêm 0,5 ml nước và lắc mẫu qua đêm. MRNA luciferase không được tạo công thức trong bộ đệm TE (đối chứng không được tạo công thức) được thêm vào DCM và trải qua quá trình biến dạng (điều khiển biến dạng) để được sử dụng làm đối chứng trong thử nghiệm chuyển nhiễm. Hiệu suất đóng gói, lượng phần trăm khối lượng và kích thước hạt được thể hiện trong Bảng 128. Hiệu suất đóng gói được tính bằng mg mRNA từ quá trình biến dạng của vi cầu PLGA chia cho lượng mRNA ban đầu được thêm vào công thức. Tải phần trăm trọng lượng trong công thức được tính bằng mg mRNA từ sự biến dạng của các vi cầu PLGA chia cho lượng PLGA ban đầu được thêm vào công thức.
B. Biểu hiện protein của mARN biến đổi được bao bọc trong kính hiển vi PLGA
Một ngày trước khi truyền nhiễm, 20.000 tế bào HeLa (ATCC số CCL-2; Manassas, VA) đã được thu hoạch bằng cách xử lý bằng dung dịch Trypsin-EDTA (LifeTechnology, Grand Island, NY) và gieo hạt vào tổng thể tích 100 ul môi trường EMEM (được bổ sung với 10% FCS và 1× Glutamax) mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Corning, Manassas, VA). Các tế bào được nuôi cấy ở nhiệt độ 37° C. trong môi trường có 5% CO2 qua đêm. Ngày hôm sau, 83 ng mẫu vi cầu luciferase mRNA PLGA đã được biến dạng, mẫu kiểm soát mRNA luciferase đã được biến dạng (Kiểm soát biến dạng) hoặc mẫu kiểm soát mRNA luciferase chưa được tạo công thức (Kiểm soát Unfomul) đã được pha loãng trong thể tích cuối cùng 10 ul của OPTI-MEM (LifeTechnology, Grand Island). , NY). Lipofectamine 2000 (LifeTechnology, Grand Island, NY) đã được sử dụng làm thuốc thử chuyển hóa và 0,2 ul được pha loãng trong thể tích cuối cùng 10 ul của OPTI-MEM. Sau 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng, cả hai dung dịch được kết hợp và ủ thêm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, 20ul dung dịch kết hợp được bổ sung vào 100ul môi trường nuôi cấy tế bào chứa tế bào HeLa. Các đĩa sau đó được ủ như mô tả trước đây.
Sau thời gian ủ từ 18 đến 22 giờ, các tế bào biểu hiện luciferase được ly giải bằng Bộ đệm ly giải thụ động 100 ul (Promega, Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phần dịch ly giải được chuyển sang các đĩa 96 giếng polystyrene trắng đục (Corning, Manassas, VA) và kết hợp với dung dịch xét nghiệm luciferase hoàn chỉnh 100 ul (Promega, Madison, WI). Tín hiệu nền của các đĩa không có thuốc thử là khoảng 200 đơn vị ánh sáng tương đối trên mỗi giếng. Đầu đọc đĩa là BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT).
Các tế bào được thu hoạch và sự phát quang sinh học (tính theo đơn vị ánh sáng tương đối, RLU) cho mỗi mẫu được thể hiện trong Bảng 129. Việc chuyển đổi các mẫu này đã xác nhận rằng các thành phần hóa học khác nhau của luciferase mRNA vẫn có thể biểu hiện protein luciferase sau khi tạo công thức vi cầu PLGA.
Ví dụ 82. Nghiên cứu in vitro về yếu tố IX
A. Môi trường không chứa huyết thanh
MARN nhân tố IX của con người (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và pseudouridine) được chuyển nhiễm vào môi trường không có huyết thanh. Chất nổi trên bề mặt nuôi cấy tế bào được thu thập và chịu sự tiêu hóa trypsin trước khi trải qua quá trình phân tách các peptide bằng HPLC 2 chiều. Phương pháp giải hấp/ion hóa bằng laser được hỗ trợ bằng ma trận đã được sử dụng để phát hiện các peptide. 8 peptide đã được phát hiện và 7 trong số các peptide được phát hiện là duy nhất của Yếu tố IX. Những kết quả này chỉ ra rằng mRNA được chuyển hóa trong môi trường không có huyết thanh có thể biểu hiện protein Yếu tố IX có chiều dài đầy đủ.
B. Tế bào thận phôi người (HEK) 293A
250 ng mRNA của Yếu tố con người IX được tối ưu hóa bằng codon (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31911; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1) đã được chuyển nhiễm vào HEK 293A tế bào (150.000 tế bào/giếng) sử dụng Lipofectamine 2000 trong DMEM với sự hiện diện của 10% FBS. Các phức hợp truyền máu đã được loại bỏ 3 giờ sau khi truyền máu. Các tế bào được thu hoạch vào lúc 3, 6, 9, 12, 24, 48 và 72 giờ sau khi truyền máu. Tổng RNA được phân lập và sử dụng để tổng hợp cDNA. CDNA được phân tích bằng phương pháp PCR thời gian thực định lượng bằng cách sử dụng bộ mồi đặc hiệu Yếu tố IX được tối ưu hóa bằng codon. Mức độ hypoxanthine photphoribosyltransfersase 1 (HPRT) ở người đã được sử dụng để bình thường hóa. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng phần trăm của mRNA có thể phát hiện được, coi mức mRNA là 100% tại thời điểm 3 giờ. Thời gian bán hủy của mRNA biến đổi yếu tố IX được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và pseudouridine trong tế bào thận phôi người 293 (HEK293) là khoảng 8-10 giờ.
Ví dụ 83. Công thức nước muối: Tiêm dưới da
MRNA được biến đổi G-CSF của người (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) và mRNA được biến đổi EPO của người (mRNA trình tự được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và pseudouridine), được bào chế trong nước muối và được tiêm vào cơ (IM). với liều 100 ug.
Các biện pháp kiểm soát bao gồm Luciferase (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine)) hoặc dung dịch đệm công thức (F.Buffer) . Những con chuột bị chảy máu vào lúc 13 giờ sau khi tiêm để xác định nồng độ polypeptide của người trong huyết thanh tính bằng pg/mL. (Nhóm G-CSF đo G-CSF của người trong huyết thanh chuột và nhóm EPO đo EPO của người trong huyết thanh chuột). Dữ liệu được thể hiện trong Bảng 130.
mRNA phân hủy nhanh chóng trong huyết thanh khi không có công thức cho thấy phương pháp tốt nhất để đưa mRNA tồn tại lâu hơn trong hệ thống là tạo công thức mRNA. Như được thể hiện trong Bảng 130, mRNA có thể được phân phối dưới da chỉ bằng cách sử dụng công thức đệm.
Ví dụ 84. Giao hàng trong dịch kính
MRNA được biến đổi mCherry (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31908; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) và mRNA được biến đổi luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được bào chế trong nước muối được phân phối qua đường tiêm vào chuột như được mô tả trong Bảng 131. Mẫu này được so sánh với việc kiểm soát nước muối chỉ được cung cấp trong dịch kính.
Công thức này sẽ được nhỏ vào mắt trái hoặc mắt phải của mỗi con vật vào ngày thứ nhất trong khi con vật đó được gây mê. Vào ngày trước khi dùng thuốc mỡ hoặc dung dịch mắt gentamicin được bôi lên cả hai mắt hai lần. Thuốc mỡ hoặc dung dịch nhãn khoa gentamicin cũng được bôi ngay sau khi tiêm và vào ngày sau khi tiêm. Trước khi dùng thuốc, nhỏ thuốc giãn đồng tử (1% tropicamide và/hoặc 2,5% phenylephrine) vào mỗi mắt.
18 giờ sau khi dùng thuốc, mắt nhận liều mCherry và dung dịch đệm phân phối sẽ được tách nhân và mỗi mắt được đặt riêng biệt trong một ống chứa 10 mL 4% paraformaldehyde ở nhiệt độ phòng để cố định mô qua đêm. Ngày hôm sau, mắt sẽ được chuyển riêng sang các ống chứa 10 mL sucurose 30% và bảo quản ở 21°C cho đến khi chúng được xử lý và cắt thành từng phần. Các slide được chuẩn bị từ các phần khác nhau được đánh giá dưới kính hiển vi F. Biểu hiện tích cực đã được nhìn thấy trong các slide được chuẩn bị bằng mắt được quản lý mRNA đã sửa đổi mCherry và đối chứng không cho thấy biểu hiện nào.
Ví dụ 85. Trong nghiên cứu biểu hiện Cytokine của Vivo
Chuột được tiêm bắp với 200 ug mRNA đã biến đổi G-CSF (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự) không được biến đổi với nắp 5′, Cap1 (không được sửa đổi), hoàn toàn được biến đổi bằng 5-methylcytosine và pseudouridine và 5′cap, Cap1 (Gen1) hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine và 5′cap, Cap1 (nắp Gen2) hoặc không có nắp (Gen2 không có nắp). Kiểm soát R-848, 5% sucrose và chuột không được điều trị cũng được phân tích. Sau 8 giờ, huyết thanh được thu thập từ chuột và được phân tích biểu hiện interferon-alpha (IFN-alpha). Kết quả được thể hiện ở Bảng 132.
Ví dụ 86. Biểu hiện in vitro của mRNA biến đổi VEGF
Các tế bào HEK293 được chuyển nhiễm mRNA (mmRNA) VEGF-A đã biến đổi (trình tự mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31920; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được tạo phức với Lipofectamine2000 từ Invitrogen (Carlsbad, CA) ở nồng độ như trong Bảng 133. Biểu hiện protein được phát hiện bằng ELISA và protein (pg/ml) được thể hiện trong Bảng 133 và
Ví dụ 87. Sàng lọc in vitro trên tế bào HeLa của GFP
Một ngày trước khi truyền nhiễm, 20.000 tế bào HeLa (ATCC số CCL-2; Manassas, VA) đã được thu hoạch bằng cách xử lý bằng dung dịch Trypsin-EDTA (LifeTechnology, Grand Island, NY) và gieo hạt vào tổng thể tích 100 ul môi trường EMEM (được bổ sung với 10% FCS và 1× Glutamax) mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Corning, Manassas, VA). Tế bào được nuôi cấy ở 37° C. trong 5% CO2bầu không khí qua đêm. Ngày hôm sau, 37,5 ng hoặc 75 ng RNA biến đổi protein huỳnh quang xanh (GFP) (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31919; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) với sự biến đổi hóa học được mô tả trong Bảng 134, được pha loãng trong thể tích cuối cùng 10 ul của OPTI-MEM (LifeTechnology, Grand Island, NY). Lipofectamine 2000 (LifeTechnology, Grand Island, NY) đã được sử dụng làm thuốc thử chuyển hóa và 0,2 ul được pha loãng trong thể tích cuối cùng của 10 ul OPTI-MEM. Sau 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng, cả hai dung dịch được kết hợp và ủ thêm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, dung dịch kết hợp 20 ul được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào 100 ul chứa tế bào HeLa và ủ ở nhiệt độ phòng.
Sau 18 đến 22 giờ ủ, các tế bào biểu hiện luciferase được ly giải bằng 100ul Dung dịch đệm ly giải thụ động (Promega, Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phần dịch ly giải được chuyển sang các đĩa 96 giếng polystyrene trắng đục (Corning, Manassas, VA) và kết hợp với dung dịch xét nghiệm luciferase hoàn chỉnh 100 ul (Promega, Madison, WI). Cường độ huỳnh quang trung bình (MFI) được xác định cho từng chất hóa học và được thể hiện trong Bảng 134.
Những kết quả này chứng minh rằng GFP được biến đổi hoàn toàn bằng N1-methyl-pseudouridine và 5-methylcytosine tạo ra nhiều protein hơn trong tế bào HeLa so với các hóa chất khác. Ngoài ra, liều GFP cao hơn được đưa vào tế bào sẽ mang lại giá trị MFI cao nhất.
Ví dụ 88. Đồng nhất hóa
Các dung dịch mARN luciferaza khác nhau (như được mô tả trong Bảng 135 trong đó “X” dùng để chỉ dung dịch chứa thành phần đó) (trình tự mARN được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và pseudouridine) đã được đánh giá để kiểm tra hiệu suất phần trăm của các dung dịch khác nhau, tính toàn vẹn của mRNA bằng máy phân tích sinh học và sự biểu hiện protein của mRNA bằng cách chuyển hóa trong ống nghiệm. Dung dịch mARN được điều chế trong nước, dung dịch đệm 1× TE ở mức 4 mg/ml như được chỉ ra trong Bảng 135, và được bổ sung vào diclometan (DCM) hoặc DCM chứa 200 mg/ml poly(axit lactic-co-glycolic) (PLGA ) (Lactel, Cat #B6010-2, độ nhớt vốn có 0,55-0,75, 50:50 LA:GA) để đạt được nồng độ mRNA cuối cùng là 0,8 mg/ml. Các dung dịch yêu cầu đồng nhất được đồng nhất hóa trong 30 giây ở tốc độ 5 (khoảng 19.000 vòng/phút) (IKA Ultra-Turrax hom*ogenizer, T18). Các mẫu mRNA trong nước, dicloromethane và poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) không thể phục hồi được (NR). Tất cả các mẫu, ngoại trừ các mẫu NR, đều duy trì tính toàn vẹn của mRNA như được xác định bằng máy phân tích sinh học (Bio-rad Experion).
Một ngày trước khi truyền nhiễm, 20.000 tế bào HeLa (ATCC số CCL-2; Manassas, VA) đã được thu hoạch bằng cách xử lý bằng dung dịch Trypsin-EDTA (LifeTechnology, Grand Island, NY) và gieo hạt vào tổng thể tích 100 ul môi trường EMEM (được bổ sung với 10% FCS và 1× Glutamax) mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Corning, Manassas, VA). Các tế bào được nuôi cấy ở nhiệt độ 37° C. trong môi trường có 5% CO2 qua đêm. Ngày hôm sau, 250 ng mRNA luciferase từ các mẫu có thể thu hồi được pha loãng trong thể tích cuối cùng 10 ul OPTI-MEM (LifeTechnology, Grand Island, NY). Lipofectamine 2000 (LifeTechnology, Grand Island, NY) đã được sử dụng làm thuốc thử chuyển hóa và 0,2 ul được pha loãng trong thể tích cuối cùng 10 ul của OPTI-MEM. Sau 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng, cả hai dung dịch được kết hợp và ủ thêm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, 20ul dung dịch kết hợp được bổ sung vào 100ul môi trường nuôi cấy tế bào chứa tế bào HeLa. Các đĩa sau đó được ủ như mô tả trước đây. MRNA luciferase đối chứng (mRNA luciferase được tạo thành trong nước muối) (Đối chứng) và các tế bào chưa được xử lý (Chưa xử lý) cũng được đánh giá. Các tế bào đã được thu hoạch và mức phát quang sinh học trung bình (tính bằng photon/giây) (biolum. (p/s)) cho mỗi tín hiệu cũng được thể hiện trong Bảng 135. Các mẫu có thể phục hồi đều cho thấy hoạt động của luciferase mRNA khi phân tích.
Sau thời gian ủ từ 18 đến 22 giờ, các tế bào biểu hiện luciferase được ly giải bằng Bộ đệm ly giải thụ động 100 ul (Promega, Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phần dịch ly giải được chuyển sang các đĩa 96 giếng polystyrene trắng đục (Corning, Manassas, VA) và kết hợp với dung dịch xét nghiệm luciferase hoàn chỉnh 100 ul (Promega, Madison, WI). Tín hiệu nền của các đĩa không có thuốc thử là khoảng 200 đơn vị ánh sáng tương đối trên mỗi giếng. Đầu đọc đĩa là BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT).
Các tế bào đã được thu hoạch và mức phát quang sinh học trung bình (tính theo đơn vị ánh sáng tương đối, RLU) (biolum. (RLU)) cho mỗi tín hiệu cũng được thể hiện trong Bảng 135. Các mẫu có thể phục hồi đều cho thấy hoạt động của luciferase mRNA khi phân tích.
Ví dụ 89. Dung dịch đệm TE và đánh giá nước
Luciferase mARN (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được hoàn nguyên trong nước hoặc dung dịch đệm TE như được nêu trong Bảng 136 và sau đó được tạo thành trong vi cầu PLGA. Các vi cầu PLGA được tổng hợp bằng phương pháp nhũ tương kép nước/dầu/nước đã biết trong lĩnh vực kỹ thuật này bằng cách sử dụng PLGA (Lactel, Cat #B6010-2, độ nhớt vốn có 0,55-0,75, 50:50 LA:GA), polyvinylalcohol (PVA) (Sigma, Cat #348406-25G, MW 13-23 k) diclometan và nước. Tóm lại, 0,2 đến 0,6 ml mRNA trong nước hoặc dung dịch đệm TE ở nồng độ 2 đến 6 mg/ml (W1) được thêm vào 2 ml PLGA hòa tan trong dichloromethane (DCM) (O1) ở nồng độ 100 mg/ml của PLGA. Nhũ tương W1/O1 được đồng nhất hóa (IKA Ultra-Turrax hom*ogenizer, T18) trong 30 giây ở tốc độ 5 (˜19.000 vòng/phút). Nhũ tương W1/01 sau đó được thêm vào 250 ml PVA 1% (W2) và đồng nhất hóa trong 1 phút ở tốc độ 5 (˜19.000 vòng/phút).
Các công thức được khuấy trong 3 giờ, sau đó được đưa qua lưới lọc nylon 100 μm (Fisherbrand Cell Strainer, Cat #22-363-549) để loại bỏ các cốt liệu lớn hơn và cuối cùng được rửa bằng cách ly tâm (10 phút, 9.250 vòng/phút, 4° C.). Phần nổi phía trên được loại bỏ và các viên PLGA được hòa lại trong 5-10 ml nước, được lặp lại 2×. Công thức đã rửa được đông lạnh trong nitơ lỏng và sau đó đông khô trong 2-3 ngày. Sau khi đông khô, cân ˜10 mg PLGA MS trong ống eppendorf 2 ml và làm biến dạng bằng cách thêm 1 ml DCM và để mẫu lắc trong 2-6 giờ. mRNA được chiết xuất từ các vi hạt PLGA đã bị biến dạng bằng cách thêm 0,5 ml nước và lắc mẫu qua đêm. MRNA luciferase không được tạo công thức trong nước hoặc dung dịch đệm TE (điều khiển biến dạng) được thêm vào DCM và trải qua quá trình biến dạng để được sử dụng làm đối chứng trong thử nghiệm chuyển nhiễm.
Một ngày trước khi truyền nhiễm, 20.000 tế bào HeLa (ATCC số CCL-2; Manassas, VA) đã được thu hoạch bằng cách xử lý bằng dung dịch Trypsin-EDTA (LifeTechnology, Grand Island, NY) và gieo hạt vào tổng thể tích 100 ul môi trường EMEM (được bổ sung với 10% FCS và 1× Glutamax) mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Corning, Manassas, VA). Các tế bào được nuôi cấy ở nhiệt độ 37° C. trong môi trường có 5% CO2 qua đêm. Ngày hôm sau, 100 ng mẫu mRNA luciferase bị biến dạng đã được pha loãng trong thể tích cuối cùng 10 ul của OPTI-MEM (LifeTechnology, Grand Island, NY). Lipofectamine 2000 (LifeTechnology, Grand Island, NY) đã được sử dụng làm thuốc thử chuyển hóa và 0,2 ul được pha loãng trong thể tích cuối cùng 10 ul của OPTI-MEM. Sau 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng, cả hai dung dịch được kết hợp và ủ thêm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, 20ul dung dịch kết hợp được bổ sung vào 100ul môi trường nuôi cấy tế bào chứa tế bào HeLa. Các đĩa sau đó được ủ như mô tả trước đây.
Sau 18 đến 22 giờ ủ, các tế bào biểu hiện luciferase được ly giải bằng Bộ đệm ly giải thụ động 100 ul (Promega, Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phần dịch ly giải được chuyển sang các đĩa 96 giếng polystyrene trắng đục (Corning, Manassas, VA) và kết hợp với dung dịch xét nghiệm luciferase hoàn chỉnh 100 ul (Promega, Madison, WI). Tín hiệu nền của các đĩa không có thuốc thử là khoảng 200 đơn vị ánh sáng tương đối trên mỗi giếng. Đầu đọc đĩa là BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). Để xác định hoạt tính của mARN luciferase từ mỗi công thức, đơn vị ánh sáng tương đối (RLU) cho mỗi công thức được chia cho RLU của chất kiểm soát biến dạng mARN thích hợp (mRNA trong nước hoặc đệm TE). Bảng 136 thể hiện hoạt động của mARN luciferase. Hoạt tính của mARN luciferase trong các công thức vi cầu PLGA (Dạng) được cải thiện đáng kể bằng cách tạo công thức trong đệm TE so với trong nước.
Ví dụ 90. Biến đổi hóa học trên mRNA
Một ngày trước khi truyền nhiễm, 20.000 tế bào HeLa (ATCC số CCL-2; Manassas, VA) đã được thu hoạch bằng cách xử lý bằng dung dịch Trypsin-EDTA (Life Technologies, Grand Island, NY) và gieo hạt vào tổng thể tích 100 ul môi trường EMEM ( được bổ sung 10% FCS và 1× Glutamax) mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Corning, Manassas, VA). Tế bào được nuôi cấy ở 37° C. trong 5% CO2bầu không khí qua đêm. Ngày hôm sau, 83 ng RNA biến đổi Luciferase (trình tự mRNA được hiển thị SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1) với sự biến đổi hóa học được mô tả trong Bảng 137, được pha loãng trong 10 ul tập cuối cùng của OPTI-MEM (LifeTechnology, Grand Island, NY). Lipofectamine 2000 (LifeTechnology, Grand Island, NY) đã được sử dụng làm thuốc thử chuyển hóa và 0,2 ul được pha loãng trong thể tích cuối cùng của 10 ul OPTI-MEM. Sau 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng, cả hai dung dịch được kết hợp và ủ thêm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, dung dịch kết hợp 20 ul được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào 100 ul chứa tế bào HeLa và ủ ở nhiệt độ phòng.
Sau 18 đến 22 giờ ủ, các tế bào biểu hiện luciferase được ly giải bằng 100 ul Dung dịch đệm ly giải thụ động (Promega, Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phần dịch ly giải được chuyển sang các đĩa 96 giếng polystyrene trắng đục (Corning, Manassas, VA) và kết hợp với dung dịch xét nghiệm luciferase hoàn chỉnh 100 ul (Promega, Madison, WI). Thể tích lysate được điều chỉnh hoặc pha loãng cho đến khi phát hiện không quá 2 triệu đơn vị ánh sáng tương đối (RLU) trên mỗi giếng đối với các mẫu tạo tín hiệu mạnh nhất và RLU cho mỗi hóa chất được thử nghiệm được trình bày trong Bảng 137. Máy đọc đĩa là BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). Tín hiệu nền của các đĩa không có thuốc thử là khoảng 200 đơn vị ánh sáng tương đối trên mỗi giếng.
Ví dụ 91. Tiêm bắp và tiêm dưới da mRNA biến đổi
MARN biến đổi Luciferase (trình tự mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (5 mC/pU), được biến đổi hoàn toàn với 5 -methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine (5 mC/N1 mpU), được biến đổi hoàn toàn bằng pseudouridine (pU), được biến đổi hoàn toàn bằng N1-methyl-pseudouridine (N1 mpU) hoặc được biến đổi trong đó 25% cytosine được thay thế bằng 5-methylcytosine và 25% uridine được thay thế bằng 2-thiouridine (5 mC/s2U) được pha chế trong PBS (pH 7,4) được tiêm cho chuột Balb-C tiêm bắp hoặc tiêm dưới da với liều 2,5 mg/kg. Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 8 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ và 144 giờ để tiêm bắp và 2 giờ, 8 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 2 giờ. 120 giờ cho giao hàng dưới da. Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Tổng thông lượng trung bình (photon/giây) khi tiêm bắp được trình bày trong Bảng 138 và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) khi tiêm dưới da được trình bày trong Bảng 139. Tín hiệu nền là 3,79E+05 (p/s). Biểu hiện cao nhất khi tiêm bắp được thấy trong khoảng từ 24 đến 48 giờ đối với tất cả các thành phần hóa học và biểu hiện vẫn được phát hiện sau 144 giờ. Đối với tiêm dưới da, biểu hiện cao nhất được ghi nhận sau 2-8 giờ và biểu hiện được phát hiện sau 72 giờ.
Ví dụ 92. Nghiên cứu bơm thẩm thấu
Trước khi cấy ghép, một bơm thẩm thấu (ALZET® Osmotic Pump 2001D, DURECT Corp. Cupertino, CA) được nạp 0,2 ml 1×PBS (pH 7,4) (bơm nạp PBS) hoặc 0,2 ml mRNA biến đổi luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine) ở mức 1 mg/ml trong 1× PBS (pH 7,4). ) (bơm nạp Luciferase) và ủ qua đêm trong 1× PBS (pH 7,4) ở 37° C.
Chuột Balb-C ( n = 3) được cấy dưới da bằng bơm nạp PBS hoặc bơm nạp luciferase và chụp ảnh lúc 2 giờ, 8 giờ và 24 giờ. Để kiểm soát, một máy bơm nạp PBS được cấy dưới da và chuột được tiêm dưới da mRNA biến đổi luciferase trong 1 × PBS (bơm nạp PBS; SC Luciferase) hoặc bơm thẩm thấu không được cấy và chuột được tiêm dưới da với mRNA biến đổi luciferase trong 1× PBS (SC Luciferase). Công thức luciferase được nêu trong Bảng 140.
Ví dụ 93. Nghiên cứu bơm thẩm thấu ngoài
Một máy bơm thẩm thấu bên ngoài (ALZET® Osmotic Pump 2001D, DURECT Corp. Cupertino, CA) được nạp 0,2 ml 1×PBS (pH 7,4) (bơm nạp PBS) hoặc 0,2 ml mRNA biến đổi luciferase (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine) ở mức 1 mg/ml trong 1× PBS (pH 7,4) (luciferase bơm đã nạp) và ủ qua đêm trong 1× PBS (pH 7,4) ở 37° C.
Sử dụng một ống thông kết nối với bơm nạp PBS bên ngoài hoặc bơm nạp luciferase cho chuột Balb-C (n=3) được sử dụng công thức. Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 8 giờ và 24 giờ. Để kiểm soát, một máy bơm nạp PBS bên ngoài được sử dụng và chuột được tiêm dưới da với mRNA biến đổi luciferase trong 1 × PBS (bơm nạp PBS; SC Luciferase) hoặc máy bơm bên ngoài không được sử dụng và chuột chỉ được tiêm dưới da với mRNA biến đổi luciferase trong 1× PBS (SC Luciferase). Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Sau đó, động vật được gây mê và hình ảnh được thu lại bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Các công thức luciferase được nêu trong Bảng 141 và tổng dòng trung bình (photon/giây).
Ví dụ 94. Nghiên cứu chất bịt kín Fibrin
Chất bịt kín Fibrin, chẳng hạn như Tisseel (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL), bao gồm fibrinogen và trombin trong một ống tiêm hai nòng. Sau khi trộn, fibrinogen được chuyển thành fibrin để tạo thành cục máu đông fibrin trong khoảng 10 đến 30 giây. Cục máu đông này có thể bắt chước cơ chế đông máu tự nhiên của cơ thể. Ngoài ra, hydrogel fibrin là cấu trúc ba chiều có khả năng được sử dụng trong quá trình phân phối giải phóng kéo dài. Hiện nay, chất bịt kín fibrin được chấp thuận ứng dụng trong cầm máu và hàn kín để thay thế các kỹ thuật phẫu thuật thông thường như khâu, thắt và đốt điện.
Các thành phần trombin và fibrinogen được nạp riêng vào ống tiêm nòng kép. Chuột Balb-C (n=3) được tiêm dưới da 50ul fibrinogen, 50ul trombin và chúng cũng được tiêm vào cùng vị trí với mARN luciferase biến đổi (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có kích thước xấp xỉ 140 nucleotide không được trình bày theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine) (Tisseel+Luciferase), 50 ul fibrinogen và 50 ul trombin (Tisseel) hoặc luciferase mRNA đã biến đổi (Luciferase) . Việc tiêm fibrinogen và trombin được thực hiện đồng thời bằng ống tiêm nòng kép. Việc tiêm luciferase vào SC được thực hiện 15 phút sau khi tiêm fibrinogen/trombin để cho phép fibrin hydrogel trùng hợp (nhóm Tisseel + Luciferase). Một nhóm đối chứng gồm những con chuột không được điều trị cũng được đánh giá. Những con chuột được chụp ảnh lúc 5 giờ và 24 giờ. Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Các công thức luciferase được nêu trong Bảng 142 và tổng dòng trung bình (photon/giây) được thể hiện trong Bảng 143. Chất bịt kín fibrin được phát hiện là không ảnh hưởng đến hình ảnh và việc tiêm luciferase và Tisseel cho thấy biểu hiện của luciferase.
Ví dụ 95. Nghiên cứu chất bịt kín chứa fibrin mRNA
A. MARN biến tính và Canxi Clorua
Trước khi hoàn nguyên, mARN luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng N1-methyl-pseudouridine được thêm vào canxi clorua. Canxi clorua sau đó được sử dụng để hoàn nguyên trombin. Fibrinogen được hoàn nguyên bằng dung dịch ức chế tiêu sợi huyết theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thrombin hoàn nguyên chứa mRNA đã biến đổi và fibrinogen được nạp vào một ống tiêm nòng kép. Chuột được tiêm dưới da 50 ul fibrinogen và 50 ul trombin chứa mARN biến đổi hoặc chúng được tiêm 50 ul PBS chứa liều tương đương mARN luciferase biến đổi. Một nhóm đối chứng gồm những con chuột không được điều trị cũng được đánh giá. Những con chuột được chụp ảnh theo các khoảng thời gian xác định trước để xác định tổng thông lượng trung bình (photon/giây).
B. MARN biến tính và Canxi Clorua biến tính được tạo thành từ hạt nano lipid
Trước khi hoàn nguyên, mARN luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng N1-methyl-pseudouridine được bào chế dưới dạng hạt nano lipid được thêm vào canxi clorua. Canxi clorua sau đó được sử dụng để hoàn nguyên trombin. Fibrinogen được hoàn nguyên bằng dung dịch ức chế tiêu sợi huyết theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thrombin hoàn nguyên chứa mRNA đã biến đổi và fibrinogen được nạp vào một ống tiêm nòng kép. Chuột được tiêm dưới da 50 ul fibrinogen và 50 ul trombin chứa mARN biến đổi hoặc chúng được tiêm 50 ul PBS chứa liều tương đương mARN luciferase biến đổi. Một nhóm đối chứng gồm những con chuột không được điều trị cũng được đánh giá. Những con chuột được chụp ảnh theo các khoảng thời gian xác định trước để xác định tổng thông lượng trung bình (photon/giây).
C. MARN biến đổi và Fibrinogen
Trước khi hoàn nguyên, mARN luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng N1-methyl-pseudouridine được thêm vào dung dịch ức chế tiêu sợi huyết. Dung dịch ức chế tiêu sợi huyết sau đó được sử dụng để hoàn nguyên fibrinogen. Thrombin được hoàn nguyên bằng dung dịch canxi clorua theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Fibrinogen hoàn nguyên chứa mRNA đã biến đổi và trombin được nạp vào một ống tiêm nòng kép. Chuột được tiêm dưới da 50 ul trombin và 50 ul fibrinogen chứa mARN biến đổi hoặc chúng được tiêm 50 ul PBS chứa liều tương đương mARN luciferase biến đổi. Một nhóm đối chứng gồm những con chuột không được điều trị cũng được đánh giá. Những con chuột được chụp ảnh theo các khoảng thời gian xác định trước để xác định tổng thông lượng trung bình (photon/giây).
D. Hạt nano lipid được biến đổi mRNA và Fibrinogen có công thức
Trước khi hoàn nguyên, mARN luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng N1-methyl-pseudouridine được bào chế dưới dạng hạt nano lipid được thêm vào dung dịch ức chế tiêu sợi huyết. Dung dịch ức chế tiêu sợi huyết sau đó được sử dụng để hoàn nguyên fibrinogen. Thrombin được hoàn nguyên bằng dung dịch canxi clorua theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Fibrinogen hoàn nguyên chứa mRNA đã biến đổi và trombin được nạp vào một ống tiêm nòng kép. Chuột được tiêm dưới da 50 ul trombin và 50 ul fibrinogen chứa mARN biến đổi hoặc chúng được tiêm 50 ul PBS chứa liều tương đương mARN luciferase biến đổi. Một nhóm đối chứng gồm những con chuột không được điều trị cũng được đánh giá. Những con chuột được chụp ảnh theo các khoảng thời gian xác định trước để xác định tổng thông lượng trung bình (photon/giây).
E. MARN biến đổi và Thrombin
Trước khi hoàn nguyên, mARN luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng N1-methyl-pseudouridine được thêm vào trombin hoàn nguyên sau khi nó được hoàn nguyên bằng canxi clorua theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch ức chế tiêu sợi huyết sau đó được sử dụng để hoàn nguyên fibrinogen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Fibrinogen và trombin hoàn nguyên chứa mRNA đã biến đổi được nạp vào một ống tiêm nòng kép. Chuột được tiêm dưới da 50 ul trombin chứa mARN biến đổi và 50 ul fibrinogen hoặc chúng được tiêm 50 ul PBS chứa liều tương đương mARN luciferase biến đổi. Một nhóm đối chứng gồm những con chuột không được điều trị cũng được đánh giá. Những con chuột được chụp ảnh theo các khoảng thời gian xác định trước để xác định tổng thông lượng trung bình (photon/giây).
F. MARN biến đổi và Thrombin được điều chế bằng hạt nano lipid
Trước khi hoàn nguyên, mARN luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng N1-methyl-pseudouridine được bào chế dưới dạng hạt nano lipid được thêm vào trombin hoàn nguyên sau khi nó được hoàn nguyên bằng canxi clorua theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch ức chế tiêu sợi huyết sau đó được sử dụng để hoàn nguyên fibrinogen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Fibrinogen và trombin hoàn nguyên chứa mRNA đã biến đổi được nạp vào một ống tiêm nòng kép. Chuột được tiêm dưới da 50 ul trombin chứa mARN biến đổi và 50 ul fibrinogen hoặc chúng được tiêm 50 ul PBS chứa liều tương đương mARN luciferase biến đổi. Một nhóm đối chứng gồm những con chuột không được điều trị cũng được đánh giá. Những con chuột được chụp ảnh theo các khoảng thời gian xác định trước để xác định tổng thông lượng trung bình (photon/giây).
Ví dụ 96. Công thức lipid cation của 5-Methylcytosine và N1-Methyl-Pseudouridine biến tính mRNA
Luciferase mARN (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn với 5-metylcytosine và N1-metyl-pseudouridine được tạo ra trong các lipit cation được mô tả trong Bảng 144. Các công thức này được tiêm tĩnh mạch (I.V.), tiêm bắp (I.M.) hoặc tiêm dưới da (S.C.) cho chuột Balb-C với liều 0,05 mg/kg.
Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 8 giờ và 24 giờ sau khi dùng thuốc và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho từng đường dùng và công thức lipid cation. Thông lượng nền là khoảng 4,17E+05 p/s. Kết quả chụp ảnh được trình bày ở Bảng 145. Trong Bảng 145, “NT” có nghĩa là chưa được kiểm tra.
Ví dụ 97. Nghiên cứu tiêm tĩnh mạch hạt nano lipid
Luciferase mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được tạo ra trong hạt nano lipid chứa 50% DLin- MC3-DMA HOẶC Dlin-KC2-DMA như được mô tả trong Bảng 146, 38,5% cholesterol, 10% DSPC và 1,5% PEG. Công thức này được tiêm tĩnh mạch (IV) cho chuột Balb-C với liều 0,5 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,005 mg/kg hoặc 0,0005 mg/kg. Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột.
Đối với DLin-KC2-DMA, chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 8 giờ, 24 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 168 giờ sau khi dùng thuốc và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho từng đường dùng và lipid cation công thức. Thông lượng nền là khoảng 3,66E+05 p/s. Kết quả chụp ảnh được trình bày trong Bảng 147. Các cơ quan được chụp ảnh lúc 8 giờ và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho gan, lá lách, phổi và thận. Một kiểm soát cho từng cơ quan cũng đã được phân tích. Kết quả được trình bày trong Bảng 149. Tín hiệu cao nhất đối với tất cả các mức liều là vào lúc 8 giờ sau khi dùng thuốc. Ngoài ra, việc phân phối đến các cơ quan khác nhau (gan, lá lách, phổi và thận) có thể được kiểm soát bằng cách tăng hoặc giảm liều LNP.
Đối với DLin-MC3-DMA, chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 8 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 144 giờ sau khi dùng thuốc và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho từng đường dùng và lipid cation công thức. Thông lượng nền là khoảng 4,51E+05 p/s. Kết quả chụp ảnh được thể hiện trong Bảng 149. Các cơ quan được chụp ảnh lúc 8 giờ và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho gan, lá lách, phổi và thận. Một kiểm soát cho từng cơ quan cũng đã được phân tích. Kết quả được trình bày trong Bảng 150. Tín hiệu cao nhất đối với tất cả các mức liều là vào lúc 8 giờ sau khi dùng thuốc. Ngoài ra, việc phân phối đến các cơ quan khác nhau (gan, lá lách, phổi và thận) có thể được kiểm soát bằng cách tăng hoặc giảm liều LNP.
Ví dụ 98. Nghiên cứu dưới da hạt nano lipid
Luciferase mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được tạo ra trong hạt nano lipid chứa 50% DLin- KC2-DMA như được mô tả trong Bảng 151, 385% cholesterol, 10% DSPC và 1,5% PEG. Công thức này được tiêm dưới da (S.C.) cho chuột Balb-C với liều 0,5 mg/kg, 0,05 mg/kg hoặc 0,005 mg/kg.
Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 8 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 144 giờ sau khi dùng thuốc và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho từng đường dùng và công thức lipid cation. Giới hạn phát hiện dưới là khoảng 3E+05 p/s. Kết quả chụp ảnh được thể hiện trong Bảng 152. Các cơ quan được chụp ảnh lúc 8 giờ và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho gan, lá lách, phổi và thận. Một kiểm soát cho từng cơ quan cũng đã được phân tích. Kết quả được trình bày trong Bảng 153. Tín hiệu cao nhất đối với tất cả các mức liều là vào lúc 8 giờ sau khi dùng thuốc. Ngoài ra, việc phân phối đến các cơ quan khác nhau (gan, lá lách, phổi và thận) có thể được kiểm soát bằng cách tăng hoặc giảm liều LNP. Ở liều cao, các công thức LNP di chuyển ra ngoài vị trí tiêm dưới da, vì mức độ biểu hiện luciferase cao được phát hiện ở gan, lá lách, phổi và thận.
Ví dụ 99. Nghiên cứu dưới da hạt nano lipid cation
Luciferase mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) được tạo ra trong hạt nano lipid chứa 50% DLin- MC3-DMA, 38,5% cholesterol, 10% DSPC và 1,5% PEG. Công thức này được tiêm dưới da (S.C.) cho chuột Balb-C với liều 0,5 mg/kg, 0,05 mg/kg hoặc 0,005 mg/kg.
Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 8 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 144 giờ sau khi dùng thuốc và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho từng đường dùng và công thức lipid cation. Các cơ quan được chụp ảnh lúc 8 giờ và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho gan, lá lách, phổi và thận. Một kiểm soát cho từng cơ quan cũng được phân tích.
Ví dụ 100. Nghiên cứu Luciferase Lipoplex
MRNA luciferase lipoplexed (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (5 mC/pU), được biến đổi hoàn toàn với 5 -methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine (5 mC/N1 mpU) hoặc được sửa đổi trong đó 25% cytosine được thay thế bằng 5-methylcytosine và 25% uridine được thay thế bằng 2-thiouridine (5 mC/s2U). Công thức này được tiêm tĩnh mạch (I.V.), tiêm bắp (I.M.) hoặc tiêm dưới da (S.C.) cho chuột Balb-C với liều 0,10 mg/kg.
Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 8 giờ, 24 giờ và 48 giờ sau khi dùng thuốc và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho từng đường dùng và biến đổi hóa học. Tín hiệu nền là khoảng 3,91E+05 p/s. Kết quả chụp ảnh được thể hiện trong Bảng 154. Các cơ quan được chụp ảnh lúc 6 giờ và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho gan, lá lách, phổi và thận. Một kiểm soát cho từng cơ quan cũng đã được phân tích. Kết quả được thể hiện ở Bảng 155.
Ví dụ 101. Công thức cation lipid của mARN biến tính
Luciferase mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi trong đó 25% cytosine được thay thế bằng 5-methylcytosine và 25% uridine được thay thế bằng 2-thiouridine (5 mC/s2U) được bào chế dưới dạng lipid cation được mô tả trong Bảng 156. Các công thức này được tiêm tĩnh mạch (I.V.), tiêm bắp (I.M.) hoặc tiêm dưới da (S.C.) cho chuột Balb-C với liều 0,05 mg/ Kilôgam.
Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 8 giờ và 24 giờ sau khi dùng thuốc và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho từng đường dùng và công thức lipid cation. Thông lượng nền là khoảng 3,31E+05 p/s. Kết quả chụp ảnh được trình bày ở Bảng 157. Trong Bảng 157, “NT” có nghĩa là chưa được kiểm tra. Những con chuột không được điều trị cho thấy dòng chảy trung bình là 3,14E+05 lúc 2 giờ, 3,33E+05 lúc 8 giờ và 3,46E+05 lúc 24 giờ. Biểu hiện cao nhất được thấy ở cả ba tuyến đường được thử nghiệm lúc 8 giờ. Dlin-KC2-DMA có biểu hiện tốt hơn Dlin-MC3-DMA và DODMA thể hiện biểu thức cho tất cả các tuyến được đánh giá.
Ví dụ 102. Công thức của mRNA biến tính 5-Methylcytosine và N1-Methyl-pseudouridine
Luciferase mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine được tạo ra trong PBS (pH bằng 7,4) ). Các công thức này được tiêm bắp (I.M.) hoặc tiêm dưới da (S.C.) cho chuột Balb-C với liều 2,5 mg/kg.
Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 5 phút, 30 phút, 60 phút và 120 phút sau khi dùng thuốc và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho từng đường dùng và công thức lipid cation. Thông lượng nền là khoảng 3,78E+05 p/s. Kết quả chụp ảnh được thể hiện trong Bảng 158. Biểu hiện của luciferase đã được thấy ở phút thứ 30 với cả hai đường phân phối. Biểu hiện đỉnh điểm khi tiêm dưới da xuất hiện trong khoảng từ 30 đến 60 phút. Biểu hiện tiêm bắp vẫn tăng ở phút 120.
Ví dụ 103. Tiêm bắp và tiêm dưới da mRNA biến đổi về mặt hóa học
MARN biến đổi Luciferase (trình tự mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng N4-acetylcytidine, được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methoxyuridine, được biến đổi hoàn toàn bằng N4- acetylcytidine và N1-methyl-pseudouridine hoặc 5-methylcytosine và 5-methoxyuridine đã được biến đổi hoàn toàn có công thức trong PBS (pH 7,4) được tiêm cho chuột Balb-C tiêm bắp hoặc tiêm dưới da với liều 2,5 mg/kg. Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Những con chuột được chụp ảnh lúc 2 giờ, 8 giờ và 24 giờ. Tổng thông lượng trung bình (photon/giây) khi tiêm bắp được trình bày trong Bảng 159 và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) khi tiêm dưới da được trình bày trong Bảng 160. Tín hiệu nền là 3,84E+05 (p/s). Biểu hiện cao nhất khi tiêm bắp được thấy trong khoảng từ 24 đến 48 giờ đối với tất cả các thành phần hóa học và biểu hiện vẫn được phát hiện sau 120 giờ. Đối với tiêm dưới da, biểu hiện cao nhất được ghi nhận sau 2-8 giờ và biểu hiện được phát hiện sau 72 giờ.
Ví dụ 104. Nghiên cứu trên Vivo
MRNA biến đổi Luciferase chứa ít nhất một biến đổi hóa học được tạo thành dưới dạng hạt nano lipid (LNP) bằng phương pháp bơm ống tiêm và được đặc trưng bởi kích thước hạt, thế zeta và khả năng đóng gói.
Như được nêu trong Bảng 161, công thức LNP luciferase được sử dụng cho chuột Balb-C theo đường tiêm bắp (I.M.), tiêm tĩnh mạch (I.V.) và tiêm dưới da (S.C.). Là RNA biến đổi luciferase đối chứng được tạo ra trong PBS được tiêm vào tĩnh mạch cho chuột.
Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 2, 8, 24, 48, 120 và 192 giờ để xác định độ phát quang sinh học (được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột). Vào lúc 8 giờ hoặc 192 giờ, gan, lá lách, thận và vị trí tiêm để tiêm dưới da và tiêm bắp được chụp ảnh để xác định độ phát quang sinh học.
Ví dụ 105. Nghiên cứu công thức hóa lipid cation của mARN biến đổi hóa học
Luciferase mARN (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (5 mC/pU), pseudouridine (pU) hoặc N1-methyl-pseudouridine (N1 mpU) được bào chế dưới dạng lipid cation được mô tả trong Bảng 162. Các chế phẩm này được tiêm tĩnh mạch (I.V.), tiêm bắp (I.M.) hoặc tiêm dưới da (S.C.) cho chuột Balb-C với liều 0,05 mg/ Kilôgam.
Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 8 giờ và 24 giờ sau khi dùng thuốc và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho từng đường dùng và công thức lipid cation. Thông lượng nền là khoảng 4,11E+05 p/s. Kết quả chụp ảnh được thể hiện trong Bảng 163. Biểu hiện đỉnh điểm được thấy ở cả ba lộ trình được thử nghiệm sau 8 giờ.
Ví dụ 106. Nghiên cứu về mRNA biến đổi hóa học
Luciferase mARN (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng N4-acetylcytidine (N4-acetyl), được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methoxyuridine (5meth ), được biến đổi hoàn toàn bằng N4-acetylcytidine và N1-metyl-pseudouridine (N4-acetyl/N1 mpU) hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và 5-methoxyuridine (5 mC/5-meth) được bào chế trong DLin-MC3-DMA ở dạng được mô tả trong Bảng 164.
Các công thức này được tiêm vào tĩnh mạch (I.V.), tiêm bắp (I.M.) hoặc tiêm dưới da (S.C.) cho chuột Balb-C với liều 0,05 mg/kg.
Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 6 giờ và 24 giờ sau khi dùng thuốc và tổng thông lượng trung bình (photon/giây) được đo cho từng đường dùng và công thức lipid cation. Thông lượng nền là khoảng 2,70E+05 p/s. Kết quả chụp ảnh được thể hiện trong Bảng 165.
Ví dụ 107. Hạt nano lipid chứa nhiều mARN biến đổi
MRNA EPO (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine), G-CSF mRNA (mRNA trình tự được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine) và yếu tố IX mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID). NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine), được bào chế trong Dlin-MC3-DMA như được mô tả trong Bảng 166. các công thức được tiêm tĩnh mạch (I.V.), tiêm bắp (I.M.) hoặc tiêm dưới da (S.C.) cho chuột Balb-C với liều 0,05 mg/kg. Các công thức LNP đối chứng chỉ chứa một mRNA cũng được sử dụng với liều lượng tương đương.
Huyết thanh được thu thập từ chuột vào lúc 8 giờ, 24 giờ, 72 giờ và/hoặc 7 ngày sau khi dùng công thức. Huyết thanh được phân tích bằng ELISA để xác định biểu hiện protein của EPO, G-CSF và Yếu tố IX.
Ví dụ 108. Nghiên cứu công thức hóa lipid cation của mRNA biến tính 5-Methylcytosine và N1-Methyl-Pseudouridine
MRNA EPO (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31910; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine) hoặc G-CSF mRNA (mRNA trình tự được thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine) được bào chế trong DLin-MC3-DMA và DLin- KC2-DMA như được mô tả trong Bảng 167. Công thức này được tiêm vào tĩnh mạch (IV), tiêm bắp (I.M.) hoặc tiêm dưới da (S.C.) cho chuột Balb-C với liều 0,05 mg/kg.
Huyết thanh được thu thập từ chuột vào lúc 8 giờ, 24 giờ, 72 giờ và/hoặc 7 ngày sau khi dùng công thức. Huyết thanh được phân tích bằng ELISA để xác định biểu hiện protein của EPO và G-CSF.
Ví dụ 109. Nghiên cứu PBMC VEGF in vitro
500 ng VEGF mRNA (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31920 đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (VEGF 5 mC/pU), được sửa đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine (VEGF 5 mC/N1 mpU) hoặc không biến đổi (VEGF unmod) được truyền 0,4 uL Lipofectamine 2000 vào tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) từ ba người hiến máu bình thường (D1, D2, và D3). Các tế bào cũng không được xử lý đối với mỗi nhà tài trợ như một biện pháp kiểm soát. Chất nổi phía trên được ELISA thu hoạch và chạy 22 giờ sau khi truyền để xác định biểu hiện protein và cảm ứng cytokine. Biểu thức cảm ứng VEGF và IFN-alpha được thể hiện trong Bảng 168 và
Ví dụ 110. Biểu hiện in vitro của mRNA biến đổi
Các tế bào HEK293 đã được chuyển nhiễm mRNA đã được biến đổi EPO (trình tự mRNA được hiển thị trong SEQ ID NO:31910; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được hiển thị theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine), các tế bào HeLa được chuyển nhiễm về phía trước với mRNA được biến đổi yếu tố tăng trưởng beta (TGF-beta) (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31921; đuôi poly A có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) và các tế bào HepG2 được thay thế bằng mRNA đã biến đổi protein diệt khuẩn/tăng tính thấm (rBPI-21) (trình tự mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31922; poly Một đuôi có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được sửa đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine) đã được tạo phức với Lipofectamine2000 từ Invitrogen (Carlsbad, CA) ở nồng độ được nêu trong Bảng 169, 170 và 171 bằng cách sử dụng quy trình được mô tả ở đây. Sự biểu hiện protein được phát hiện bằng ELISA và protein (pg/ml) cũng được thể hiện trong Bảng 169, 170 và 171. Trong Bảng 169, “>” có nghĩa là lớn hơn. Đối với TGF-beta, việc kiểm soát các tế bào chưa được xử lý và chuyển đổi mô hình Lipofectamine2000 cũng đã được thử nghiệm.
Ví dụ 111. MARN biến đổi bicistronic
Biểu mô thận phôi người (HEK293) được gieo hạt trên các đĩa 96 giếng (Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen, Đức) HEK293 được gieo hạt với mật độ 30.000 trong môi trường nuôi cấy tế bào 100 μl (DMEM, 10% FCS, thêm 2 mM L -Glutamine, 1 mM Natripyruvate và 1× axit amin không thiết yếu (Biochrom AG, Berlin, Đức) và 1,2 mg/ml Natribicarbonate (Sigma-Aldrich, Munich, Đức)) 75 ng mRNA biến đổi hai cistronic (mCherry- 2A-GFP) (SEQ ID NO: 31923; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine), mARN biến đổi mCherry (mRNA SEQ ID NO: 31908; polyA đuôi có khoảng 160 nucleotit không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và pseudouridine) hoặc mRNA được biến đổi bằng protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP) (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31919; đuôi polyA có khoảng 160). các nucleotide không được trình bày theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và pseudouridine) được thêm vào sau khi gieo hạt tế bào và ủ. Việc kiểm soát các tế bào chưa được xử lý cũng đã được đánh giá. mCherry-2A-GFP dùng để chỉ trình tự mRNA đã được sửa đổi bao gồm vùng mã hóa của mCherry, peptide 2A và vùng mã hóa của GFP.
Các tế bào được thu hoạch bằng cách chuyển chất nổi trên bề mặt của môi trường nuôi cấy sang đĩa đáy chữ U Pro-Bind 96 giếng (Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg, Đức). Các tế bào đã được cố gắng cố định với 1/2 thể tích Trypsin/EDTA (Biochrom AG, Berlin, Đức), gộp với các chất nổi phía trên tương ứng và cố định bằng cách thêm một thể tích PBS/2% FCS (cả Biochrom AG, Berlin, Đức)/0,5% formaldehyde (Merck , Darmstadt, Đức). Sau đó, các mẫu được gửi đến máy đo tế bào dòng chảy bằng laser kích thích 532nm và bộ lọc 610/20 cho PE-Texas Red trong máy đo tế bào LSRII (Beckton Dickinson GmbH, Heidelberg, Đức). Cường độ huỳnh quang trung bình (MFI) của tất cả các sự kiện được thể hiện trong Bảng 172. Các tế bào được thay thế bằng mRNA biến đổi hai cistronic có thể biểu hiện cả mCherry và GFP.
Ví dụ 112. Nghiên cứu công thức dạng cation lipid của 5-Methylcytosine và N1-Methyl-Pseudouridine được biến đổi mRNA để tạo ra kháng thể
MRNA chuỗi nặng (HC) Herceptin (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31924; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine) và Herceptin mARN biến đổi chuỗi nhẹ (LC) (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31925; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1; được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và N1-methyl-pseudouridine) được bào chế trong Dlin-MC3-DMA và Dlin-KC2-DMA như được mô tả trong Bảng 173. Công thức này được tiêm tĩnh mạch (IV) cho chuột Balb-C với liều 0,500, 0,050 và 0,005 mg/kg.
Huyết thanh được thu thập từ chuột vào lúc 8 giờ, 24 giờ, 72 giờ và/hoặc 7 ngày sau khi dùng công thức. Huyết thanh được phân tích bằng ELISA để xác định biểu hiện protein của Herceptin.
Ví dụ 113. SAR định hướng của Pseudouridine và N1-Methyl-Pseudouridine
Với sự tập trung gần đây vào pyrimidine nucleoside pseudouridine, một loạt nghiên cứu về hoạt động cấu trúc đã được thiết kế để nghiên cứu mRNA có chứa các biến đổi đối với pseudouridine hoặc N1-methyl-pseudourdine.
Nghiên cứu được thiết kế để khám phá tác động của chiều dài chuỗi, tính ưa mỡ tăng lên, sự hiện diện của cấu trúc vòng và sự thay đổi tương tác kỵ nước hoặc ưa nước khi thực hiện sửa đổi ở vị trí N1, vị trí C6, vị trí 2, vị trí 4 và trên xương sống phốt phát. Tính ổn định cũng đang được nghiên cứu.
Với mục đích này, các biến đổi liên quan đến quá trình alkyl hóa, xycloalkyl hóa, alkyl-cycloalkyl hóa, arylation, alkyl-aryl hóa, các gốc alkyl hóa với các nhóm amino, các gốc alkyl hóa với các nhóm axit cacboxylic, và các gốc alkyl hóa chứa các gốc mang điện axit amin được nghiên cứu. Mức độ alkyl hóa thường là C1-C6. Ví dụ về các sửa đổi hóa học bao gồm những thay đổi được liệt kê trong Bảng 174 và Bảng 175.
Ví dụ 114. Sự kết hợp của các nucleoside tự nhiên và không tự nhiên
Các nucleoside tồn tại tự nhiên và không tự nhiên được kết hợp vào mARN mã hóa polypeptit cần quan tâm. Ví dụ về các chất này được nêu trong Bảng 176 và 177. Một số nucleoside triphosphat (NTP) có bán trên thị trường được nghiên cứu trong các polynucleotit theo sáng chế. Một số lựa chọn trong số này được đưa ra trong Bảng 176. Sau đó, mRNA thu được được kiểm tra khả năng tạo ra protein, cảm ứng các cytokine và/hoặc tạo ra kết quả điều trị.
Ví dụ 115. Kết hợp các biến đổi đối với Nucleobase và Carbohydrate (Đường)
Các nucleoside tồn tại tự nhiên và không tự nhiên được kết hợp vào mARN mã hóa polypeptit cần quan tâm. Các nucleoside và NTP có bán trên thị trường có các biến đổi đối với cả nucleobase và carbohydrate (đường) được kiểm tra khả năng kết hợp vào mRNA và tạo ra protein, cảm ứng các cytokine và/hoặc tạo ra kết quả điều trị. Ví dụ về các nucleoside này được đưa ra trong Bảng 178 và 179.
Trong các bảng “UTP” là viết tắt của uridine triphosphate, “GTP” là viết tắt của guanosine triphosphate, “ATP” là viết tắt của adenosine triphosphate, “CTP” là viết tắt của cytosine triphosphate, “TP” là viết tắt của triphosphate và “Bz” là viết tắt của benzyl.
Ví dụ 116. Sản xuất protein của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu trong tế bào HeLa
Một ngày trước khi truyền nhiễm, 20.000 tế bào HeLa (ATCC số CCL-2; Manassas, VA) đã được thu hoạch bằng cách xử lý bằng dung dịch Trypsin-EDTA (LifeTechnology, Grand Island, NY) và gieo hạt vào tổng thể tích 100 ul môi trường EMVEM (được bổ sung với 100% FCS và 1× Glutamax) trên mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Corning, Manassas, VA). Tế bào được nuôi cấy ở 37°C. trong 500CO2bầu không khí qua đêm. Ngày hôm sau, 250 ng RNA biến đổi của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31920; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) với sự biến đổi hóa học được mô tả trong Bảng 180, được pha loãng trong thể tích cuối cùng 10 ul của OPTI-MVEM (LifeTechnology, Grand Island, NY). Lipofectamine 2000 (LifeTechnology, Grand Island, NY) đã được sử dụng làm thuốc thử chuyển hóa và 0,2 ul lipofectamine 2000 đã được pha loãng thành thể tích cuối cùng của 10 ul OPTI-MEM. Sau 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng, cả hai dung dịch được kết hợp và ủ thêm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, dung dịch kết hợp 20 ul được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào 100 ul chứa tế bào HeLa và ủ ở nhiệt độ phòng. Bộ tế bào HeLa thứ hai cũng được đánh giá bằng mARN VEGF theo quy trình nêu trên. Việc kiểm soát các tế bào chưa được xử lý và các tế bào được xử lý chỉ bằng lipofecatamine 2000 cũng đã được phân tích cho bộ tế bào HeLa đầu tiên.
Sau 18 đến 22 giờ ủ, phần nổi phía trên tế bào nuôi cấy biểu hiện VEGF được thu thập và ly tâm ở tốc độ 10.000 RCf trong 2 phút. Các chất nổi phía trên đã được làm sạch sau đó được phân tích bằng bộ ELISA dành riêng cho VEGF (Hệ thống R & D, Minneapolis, MN) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tất cả các mẫu được pha loãng cho đến khi các giá trị xác định nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn ELISA. Lượng protein được tạo ra được thể hiện trong Bảng 180.
Những kết quả này chứng minh rằng VEGF được biến đổi hoàn toàn bằng 1-methylpseudouridine tạo ra nhiều protein hơn trong tế bào HeLa so với các hóa chất khác.
Ví dụ 117. So sánh quá trình sản xuất protein của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu được biến đổi hóa học trong tế bào HeLa
Một ngày trước khi truyền nhiễm, 20.000 tế bào HeLa (ATCC số CCL-2; Manassas, VA) đã được thu hoạch bằng cách xử lý bằng dung dịch Trypsin-EDTA (LifeTechnology, Grand Island, NY) và gieo hạt vào tổng thể tích 100 ul môi trường EMEM (được bổ sung với 10% FCS và 1× Glutamax) mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Corning, Manassas, VA). Tế bào được nuôi cấy ở 37° C. trong 5% CO2bầu không khí qua đêm. Ngày hôm sau, 250 ng RNA biến đổi của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31920; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) với sự biến đổi hóa học được mô tả trong Bảng 181, được pha loãng trong thể tích cuối cùng 10 ul của OPTI-MEM (LifeTechnology, Grand Island, NY). Lipofectamine 2000 (LifeTechnology, Grand Island, NY) đã được sử dụng làm thuốc thử chuyển hóa và 0,2 ul lipofectamine 2000 đã được pha loãng thành thể tích cuối cùng của 10 ul OPTI-MEM. Sau 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng, cả hai dung dịch được kết hợp và ủ thêm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, dung dịch kết hợp 20 ul được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào 100 ul chứa tế bào HeLa và ủ ở nhiệt độ phòng. Việc kiểm soát các tế bào chưa được xử lý cũng đã được phân tích.
Sau 18 đến 22 giờ ủ, phần nổi phía trên tế bào nuôi cấy biểu hiện VEGF được thu thập và ly tâm ở tốc độ 10.000 RCf trong 2 phút. Các chất nổi phía trên đã được làm sạch sau đó được phân tích bằng bộ ELISA dành riêng cho VEGF (Hệ thống R & D, Minneapolis, MN) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tất cả các mẫu được pha loãng cho đến khi các giá trị xác định nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn ELISA. Lượng protein sinh ra được thể hiện ở Bảng 181 và
Những kết quả này chứng minh rằng VEGF được biến đổi hoàn toàn bằng 1-methylpseudouridine tạo ra nhiều protein hơn trong tế bào HeLa so với các hóa chất khác.
Ví dụ 118. Sản xuất protein yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu ở động vật có vú
MRNA của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu phức hợp (VEGF) (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31920; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) không được sửa đổi, được sửa đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (5 mC) /pU), được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và 1-methylpseudouridine (5 mC/1 mpU), được biến đổi trong đó 25% cytosine được thay thế bằng 5-methylcytosine và 25% uridine được thay thế bằng 2-thiouridine (5 mC/s2U ), được biến đổi hoàn toàn bằng 1-methylpseudouridine (1 mpU) hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng pseudouridine (pU). Công thức này được tiêm tĩnh mạch cho chuột với liều 2 mg mRNA cho mỗi con chuột. Để kiểm soát, một nhóm chuột không được điều trị. Huyết thanh từ chuột được đo bằng ELISA VEGF cụ thể 3 giờ sau khi dùng để biểu hiện protein VEGF. Kết quả được thể hiện ở Bảng 182 và
Ví dụ 119. Sản xuất protein của yếu tố kích thích khuẩn lạc bạch cầu hạt trong tế bào HeLa
Một ngày trước khi truyền nhiễm, 20.000 tế bào HeLa (ATCC số CCL-2; Manassas, VA) đã được thu hoạch bằng cách xử lý bằng dung dịch Trypsin-EDTA (LifeTechnology, Grand Island, NY) và gieo hạt vào tổng thể tích 100 ul môi trường EMEM (được bổ sung với 10% FCS và 1× Glutamax) mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Corning, Manassas, VA). Tế bào được nuôi cấy ở 37° C. trong 5% CO2bầu không khí qua đêm. Ngày hôm sau, 250 ng ARN biến đổi của yếu tố kích thích tạo thành bạch cầu hạt (G-CSF) (trình tự mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31907; đuôi polyA có khoảng 160 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) với sự biến đổi hóa học mô tả trong Bảng 183, được pha loãng trong thể tích cuối cùng 10 ul của OPTI-MEM (LifeTechnology, Grand Island, NY). Lipofectamine 2000 (LifeTechnology, Grand Island, NY) đã được sử dụng làm thuốc thử chuyển hóa và 0,2 ul lipofectamine 2000 đã được pha loãng thành thể tích cuối cùng của 10 ul OPTI-MEM. Sau 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng, cả hai dung dịch được kết hợp và ủ thêm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, dung dịch kết hợp 20 ul được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào 100 ul chứa tế bào HeLa và ủ ở nhiệt độ phòng. Việc kiểm soát các tế bào chưa được điều trị và các tế bào được điều trị chỉ bằng lipofecatamine 2000 cũng đã được phân tích.
Sau 18 đến 22 giờ ủ, phần nổi phía trên tế bào nuôi cấy biểu hiện G-CSF được thu thập và ly tâm ở tốc độ 10.000 RCf trong 2 phút. Các chất nổi phía trên đã được làm sạch sau đó được phân tích bằng bộ ELISA dành riêng cho G-CSF (Hệ thống R & D, Minneapolis, MN) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tất cả các mẫu được pha loãng cho đến khi các giá trị xác định nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn ELISA. Lượng protein sinh ra được thể hiện ở Bảng 183 và
Ví dụ 120. Sản xuất protein của yếu tố biến đổi hóa học IX trong dịch nổi tế bào HeLa
Một ngày trước khi truyền máu, 15.000 tế bào HeLa (ATCC số CCL-2; Manassas, VA) đã được thu hoạch bằng cách xử lý bằng dung dịch Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (LifeTechnology, Grand Island, NY) và gieo hạt với tổng thể tích 100 ul Môi trường thiết yếu tối thiểu của Eagle (EMEM) (được bổ sung 10% huyết thanh thai nhi (FCS) và 1× Glutamax) mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 24 giếng (Corning, Manassas, VA). Tế bào được nuôi cấy ở 37° C. trong 5% CO2bầu không khí qua đêm. Ngày hôm sau, 250 ng RNA biến đổi yếu tố IX (trình tự mRNA thể hiện trong SEQ ID NO: 31911; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn với 5-methylcytosine và pseudouridine (5 mC/ pU), được biến đổi hoàn toàn bằng 5-methylcytosine và 1-methylpseudouridine (5 mC/1 mpU), được biến đổi trong đó 25% cytosine được thay thế bằng 5-methylcytosine và 25% uridine được thay thế bằng 2-thiouridine (s2U/5 mC) , được biến đổi hoàn toàn bằng 1-methylpseudouridine (1 mpU) hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng pseudouridine (pU) đã được pha loãng trong thể tích cuối cùng 10 ul của OPTI-MEM® (LifeTechnology, Grand Island, NY). Lipofectamine 2000 (LifeTechnology, Grand Island, NY) đã được sử dụng làm thuốc thử chuyển hóa và 0,2 ul lipofectamine 2000 được pha loãng thành 10 ul thể tích cuối cùng của OPTI-MEM®. Sau 5 phút ủ ở nhiệt độ phòng, cả hai dung dịch được kết hợp và ủ thêm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, dung dịch kết hợp 20 ul được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào 100 ul chứa tế bào HeLa và ủ ở nhiệt độ phòng. Một kiểm soát không được điều trị cũng đã được phân tích.
Sau 18 giờ ủ, các phần nổi phía trên tế bào biểu hiện yếu tố IX được thu thập bằng cách ly giải tế bào với đệm kết tủa miễn dịch (IP) của Công nghệ sinh học Pierce (Thermo Scientific, Rockford, IL) và ly tâm ở tốc độ 10.000 RCf trong 2 phút. Các chất nổi phía trên đã được làm sạch được pha loãng theo tỷ lệ 1:2 (1 ml lysate/2 giếng/đĩa 24 giếng) hoặc 1:5 (1 ml lysate/5 giếng/đĩa 24 giếng) sau đó được phân tích bằng bộ ELISA đặc hiệu yếu tố IX theo nhà sản xuất. hướng dẫn. Tất cả các mẫu được pha loãng cho đến khi các giá trị xác định nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn ELISA. Lượng protein được tạo ra trong cả hai nghiên cứu được thể hiện trong Bảng 184 và
Ví dụ 121. Cung cấp 1-Methylpseudouridine hoặc 5-Methylcytosine và 1-Methylpseudouridine Biến đổi Luciferase mRNA được bào chế trong Hạt nano Lipid cation vào phổi
MRNA được biến đổi Luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng 1-methylpseudouridine (Luc-G5-LNP-KC2) hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng 1-methylpseudouridine và 5-methylcytosine (Luc-G2-LNP-KC2) được bào chế trong Hạt nano Lipid cation (LNP-KC) như được mô tả trong Bảng 185.
Các công thức này được tiêm qua đường mũi (IN) cho chuột Balb-C với liều 0,3 mg/kg. Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 8 giờ, 48 và 72 giờ sau khi dùng thuốc và đo tổng thông lượng trung bình (photon/giây). Thông lượng nền là khoảng 6,3+05 p/s. Kết quả chụp ảnh Luc-G5-LNP-KC2 hoặc Luc-G5-LNP-KC2 so với Xe được thể hiện ở Bảng 186, “NT” nghĩa là chưa thử nghiệm.
Ví dụ 122. Cung cấp 1-Methylpseudouridine hoặc 5-Methylcytosine và 1-Methylpseudouridine Luciferase biến đổi mRNA Lipoplexed trong Lipofectamine 2000 qua đường mũi
MRNA được biến đổi Luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn bằng 1-methylpseudouridine (Luc-G5-Lipoplex) hoặc được biến đổi hoàn toàn bằng 1- methylpseudouridine và 5-methylcytosine (Luc-G2-Lipoplex) được lipoplex hóa theo hai bước, bước đầu tiên là pha loãng 16,6 ul từ 3 mg/ml 1-methylpseudouridine hoặc 1-methylpseudouridine và 5-methylcytosine biến đổi mRNA luciferase trong 108,5 ul DMEM và bước thứ hai là pha loãng 100 ul LF2000 trong 25 ul DMEM sau đó cả hai nhẹ nhàng trộn với nhau để tạo thành máy trộn tổng 250 ul ủ 5-10 phút ở RT để tạo thành phức hợp Lipid-mRNA trước khi tiêm. Lipoplex từ cả mRNA Luciferase được biến đổi hoàn toàn bằng 1-methylpseudouridine hoặc 1-methylpseudouridine và 5-methylcytosine được tiêm qua đường mũi (IN) cho chuột Balb-C với liều 0,5 mg/kg.
Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 8 giờ và 24 giờ sau khi dùng thuốc và đo tổng thông lượng trung bình (photon/giây). Tín hiệu nền là khoảng 4,8+05 p/s. Thông lượng nền là khoảng 6,3+05 p/s. Kết quả hình ảnh của Luc-G5-Lipoplex hoặc Luc-G2-Lipoplex so với Xe được thể hiện trong Bảng 187.
Ví dụ 123. Cung cấp 1-Methylpseudouridine hoặc 5-Methylcytosine và 1-Methylpseudouridine Biến đổi mRNA Luciferase được bào chế trong PBS qua đường mũi
MRNA được biến đổi Luciferase (trình tự mRNA được thể hiện trong SEQ ID NO: 31917; đuôi polyA có khoảng 140 nucleotide không được thể hiện theo trình tự; 5′cap, Cap1) được biến đổi hoàn toàn với 1-methylpseudouridine (Luc-G5-Buffer(PBS)) hoặc được sửa đổi hoàn toàn với 1-methylpseudouridine và 5-methylcytosine (Luc-G2-Buffer(PBS)) được bào chế trong PBS (pH 7,4) được tiêm qua đường mũi (IN) cho chuột Balb-C với liều 7,5 mg/kg.
Hai mươi phút trước khi chụp ảnh, chuột được tiêm vào màng bụng dung dịch D-luciferin với liều 150 mg/kg. Động vật sau đó được gây mê và hình ảnh được thu được bằng hệ thống hình ảnh IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Độ phát quang sinh học được đo bằng tổng thông lượng (photon/giây) của toàn bộ con chuột. Những con chuột được chụp ảnh vào lúc 2 giờ, 8 giờ và 24 giờ sau khi dùng thuốc và đo tổng thông lượng trung bình (photon/giây). Thông lượng nền là khoảng 4,8+05 p/s. Thông lượng nền là khoảng 6,3+05 p/s. Kết quả chụp ảnh của Bộ đệm Luc-G5-in so với Xe được thể hiện trong Bảng 188.
Cần phải hiểu rằng những từ được sử dụng là những từ mô tả chứ không phải giới hạn và những thay đổi đó có thể được thực hiện trong phạm vi yêu cầu bảo hộ kèm theo mà không đi chệch khỏi phạm vi và tinh thần thực sự của sáng chế ở các khía cạnh rộng hơn của nó.
Mặc dù sáng chế đã được mô tả khá chi tiết và có một số đặc điểm liên quan đến một số phương án được mô tả, nhưng nó không có ý định giới hạn ở bất kỳ chi tiết hoặc phương án nào như vậy hoặc bất kỳ phương án cụ thể nào, mà nó phải được hiểu với các tài liệu tham khảo vào các yêu cầu bảo hộ kèm theo để đưa ra cách giải thích rộng nhất có thể có về các yêu cầu bảo hộ đó dựa trên tình trạng kỹ thuật đã có và do đó, bao quát một cách hiệu quả phạm vi dự định của sáng chế.
Tất cả các ấn phẩm, đơn xin cấp bằng sáng chế, bằng sáng chế và các tài liệu tham khảo khác được đề cập ở đây đều được đưa toàn bộ vào bằng cách viện dẫn. Trong trường hợp có xung đột, đặc tả hiện tại, bao gồm cả các định nghĩa, sẽ có hiệu lực. Ngoài ra, tiêu đề các phần, tài liệu, phương pháp và ví dụ chỉ mang tính minh họa và không nhằm mục đích giới hạn.
